CN108760695B - 一种基于pret的磷光探针定量检测凝血酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PRET的磷光探针特异性引物定量检测凝血酶的方法。为了提高其灵敏度,本发明在TBA上进行修饰,得到TBA‑BHQ2探针。利用水热合成法合成的磷光QDs作为能量供体,TBA‑BHQ2作为能量受体,构成磷光共振转移检测机制,导致磷光猝灭。由于凝血酶适配体与凝血酶之间有较强的结合,从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与TBA‑BHQ2混合猝灭体系中的TBA‑BHQ2离开量子点表面与凝血酶形成新的复合物,从而使体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点,磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点,在检测中运用更加广泛和灵敏。
Description
本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095,天津市自然科学基金青年项目(No.17JCQNJC05800),天津师范大学博士基金项目(No.52XB1510)和天津师范大学“无机-有机杂化功能材料化学教育部重点实验室”、“天津市功能分子结构与性能重点实验室”开放基金项目的资助。
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域,主要涉及一种基于PRET的磷光探针对凝血酶定量检测。
背景技术
适配体是一种短的寡核苷酸,它可以折叠成一个独特的三维结构,它能将小的有机分子、蛋白质或细胞作为特定靶点。适配体是由上世纪90年代首次建立由指数富集(SELEX)系统演化而来的。从那以后,适配体已经成为一个值得注意的目标配体和治疗方法。一般来说,适配体的作用与抗体相似,但它在治疗应用方面有优势,特别是在肿瘤学领域。对于实体肿瘤的治疗,抗体的分子质量会阻碍其进入肿瘤的深层部位。相比之下,比抗体(150 kDa)分子量小得多的适配体,其分子量通常在6~30 kDa之间,能更好的进入肿瘤深层部位。重要的是,作为一种高度特异性的配体,适配体由于其体积小、化学和热稳定性好,易于修改和固定,是一种很有吸引力的诊断方法。
在基于适配体的分析方法中,最常见的分子靶点之一是凝血酶(TB)。凝血酶是凝血剂级联的最后一种酶,它将纤维蛋白原转化为不溶纤维蛋白,形成纤维蛋白凝胶。凝血酶在血液中的浓度变化很大,在健康人的血液中几乎不存在。然而,在凝血过程中,它可以达到低微的浓度,甚至在早期的止血过程中也能产生低浓度的凝血酶。凝血酶在多种生命过程中扮演着重要的角色,涉及许多疾病,如血栓栓塞性疾病、炎症反应、心血管疾病和抗凝血疗法。因此,对凝血酶的敏感性检测在临床研究和诊断中具有重要意义。
近年来,室温磷光(RTP)量子点(QDs)检测受到了广泛的关注,已被广泛应用于传感器,特别是生物分子传感器。由于能量转移过程为从三重态(4T1)到基态(6A1),因此,Mn掺杂的ZnS QDs在590 nm处表现出较强的磷光发射。本发明中,用于检测凝血酶的“off-on”磷光传感系统依赖于含磷光QDs和带有BHQ2染料的特异性凝血酶适配体(BHQ2-TBA)。QDs作为能量供体,BHQ2-TBA作为能量受体,构成磷光共振转移(PRET)检测机制。
本发明所用磷光材料与专利ZL201510230335.7(磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽的应用)、ZL201410140175.2(一种磷光量子点Mn-ZnS的制备方法及铁形态分析中的应用)中所用一致,但是用于检测的体系的物质不一样。
发明内容
本发明的目的在于克服传统荧光量子点的不足,提供基于磷光量子点为探针检测凝血酶的方法。凝血酶适配体(TBA)与凝血酶之间具有较强的特异性结合,
可以实现特异性检测。为了提高检测灵敏度,本发明在TBA上进行修饰,得到TBA-BHQ2探针。本发明利用水热合成法合成的磷光QDs作为能量供体,TBA-BHQ2作为能量受体,构成PRET检测机制,导致磷光猝灭。由于凝血酶适配体(TBA)与凝血酶之间有较强的结合,从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与TBA-BHQ2混合猝灭体系中的TBA-BHQ2离开量子点表面与凝血酶形成新的复合物,从而是体系磷光强度恢复。生物基质的自荧光或散射光干扰可以通过磷光量子来避免,因为当能量通过三线态传递时,磷光的寿命就会延长。此外,RTP生物传感器不需要任何脱氧剂或诱导剂,且避免复杂的预处理。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现:
一种采用PRET的磷光探针选择性检测凝血酶的方法,其特征在于,按照下述步骤进行:
(1)将制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中配制成浓度为500 mg/L的溶液作为检测体系,并使用315 nm作为激发波长,测试体系在590 nm处的磷光发射峰;
(2)将TBA-BHQ2溶液加入到检测体系中并混合均匀,静置以确保两者的相互作用,从而形成QDs/TBA-BHQ2复合物,考察590 nm处的磷光发射强度的变化情况,从而得到后面检测体系中TBA-BHQ2的最适浓度;
(3)将待测溶液(TB)加入到(2)中并混合均匀,静置以确保分析物与QDs/TBA-BHQ2复合物相互作用,以形成新的TB/TBA-BHQ2,考察590 nm处的磷光发射强度的变化情况;凝血酶溶解于自制生理盐水中,自制生理盐水配方为:称取0.8克氯化钠,溶解在少量高纯水中,稀释到100毫升。
所使用的磷光QDs材料的晶体结构属立方晶系(图1),QDs材料的制备方法见实施例1:
本发明同时也公开了所述的方法在用于选择性检测凝血酶方面的应用,磷光材料在315 nm作为激发波长,在590 nm处有较强发射峰,TBA-BHQ2作为猝灭剂,在590 nm有紫外吸收,由于磷光材料的发射峰与猝灭剂的紫外吸收完美重叠,构成了一个PRET的检测机制。由于凝血酶与凝血酶适配体有较强的结合,所以本发明中使用凝血酶作为凝光恢复剂,随着凝血酶的加入考察体系在590 nm处的磷光发射峰,基于此进行定量分析,通过磷光强度与加入的凝血酶的浓度进行线性拟合得到线性方程,以此来检测样品中凝血酶的含量。
本发明基于PRET的磷光探针选择性检测凝血酶的方法,按如下步骤进行:
1)将称取的制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中,作为检测体系,在315 nm激发波长下考察590 nm处的磷光发射光谱。
2)向配制好的磷光QDs材料的溶液中加入TBA-BHQ2溶液静置以确保两者充分作用,考察519 nm处的磷光发射强度的变化情况,从而得到后面检测体系中TBA-BHQ2的最适浓度;
3)待测溶液(TB)加入到2)中并混合均匀,静置以确保分析物与QDs/ TBA-BHQ2复合物相互作用,以形成新的TB/TBA-BHQ2,考察590 nm处的磷光发射强度的变化情况;将不同浓度的凝血酶溶液加入到具有磷光发射的QDs探针溶液中,590 nm处的磷光强度与0.08-7.5 nmol/L浓度范围内凝血酶的浓度呈良好的线性关系,线性相关系数R2=0.990,线性方程为:P0-P=281.75–10.04C,C 是以nmol/L表示的凝血酶的浓度,实现对凝血酶的磷光检测。
在测试过程中,向磷光QDs材料的溶液中加入TBA-BHQ2,混合均匀后,静置10-80min以使其作用完全,优选60 min即可;将待测溶液(TB)加入到QDs/ TBA-BHQ2复合物相互作用,静置10-80 min以使其作用完全,优选60 min即可。
在测试过程中,将配置的一系列的生物分子溶液如L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苏氨酸、溶菌酶加入2)中进行磷光测试,考察其选择性识别能力。
附图说明
图1为Mn掺杂ZnS磷光量子点的XRD图;
图2为MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点和MPA的傅里叶变换红外光谱图(FTIR)图;
图3为Mn掺杂ZnS磷光量子点的TEM图;
图4为Mn掺杂ZnS磷光量子点和TBA-BHQ2的紫外光谱图和磷光发射图(a Mn掺杂ZnS磷光量子点的紫外吸收,b Mn掺杂ZnS磷光量子点的磷光发射图,c TBA-BHQ2的紫外吸收);
图5为加入不同浓度TBA-BHQ2加入MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点后的磷光猝灭优化图;
图6是不同的浓度的凝血酶加入到对本发明制备的磷光探针中的磷光发射光谱图;
图7是本发明中使用磷光探针检测凝血酶线性拟合图,在一定的浓度范围内反应体系中凝血酶的浓度与磷光强度呈良好的线性关系;
图8是不同的生物分子对本发明制备的磷光探针磷光强度的影响柱状图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所述的高纯水购买于杭州娃哈哈集团有限公司,硫酸锌、乙酸锰和硫化钠生产于天津市光复精细化工研究所,3-巯基丙酸(MPA)购于百灵威科技有限公司,Tris-HCl缓冲溶液购于鼎国昌盛生物技术有限责任公司,无水乙醇(C2H5OH)购于天津市基准化学试剂有限公司。凝血酶购于北京索莱宝科技有限公司。凝血酶适配体(TBA) (5’-BHQ2-GGTTGGTGTGGTTGG-3’)购于生工生物工程(上海)股份有限公司,其他试剂均购于天津科威有限公司。
实施例1
MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点的合成(磷光QDs材料)
将原料硫酸锌(5 mL 0.1 M)、乙酸锰(5 mL 0.011 M)、MPA(0.05 M MPA)加入100mL的三口瓶中,用1 M NaOH溶液调节该混合溶液的pH值至11。在氮气保护下室温持续搅拌30 min。随后在隔绝空气下向反应体系中加入硫化钠水溶液(5 mL 0.1 M),室温继续搅拌20 min后停止通N2。在空气氛围下,50 ℃水浴中陈化2 h。加入无水乙醇(3倍量的无水乙醇),在12000转下高速离心5 min,弃去上清液,得到的产物用无水乙醇反复清洗多次,室温真空干燥24 h备用。通过傅里叶变换红外光谱图(FTIR)(图2)得到MPA通过-SH作用成功的包覆在了Mn掺杂ZnS磷光量子点的表面。通过透射电镜图(TEM)(图3),可以看出Mn掺杂ZnS磷光量子点的分散性良好且近似为球型。
实施例2
使用的磷光QDs材料和BHQ2-TAB的紫外吸收光谱和磷光发射光谱的测定
将上述实施例1制备所得的磷光QDs材料分散到水溶液中,对材料的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱进行测试,如附图4所示,在磷光QDs的紫外可见吸收光谱中290 nm处具有吸收峰(图4 曲线a)。在激发光激发下,磷光QDs在590 nm处呈现出特征磷光发射(图4曲线b)。为了发展成一种具有磷光检测的探针材料,采用590 nm处的磷光强度实现对分析物的定量分析。BHQ2-TAB在260 nm和590 nm处有吸收峰,260 nm处归因于适配体的单链DNA,590 nm处归因于BHQ2(图4 曲线c)。由于BHQ2紫外吸收与磷光QDs的磷光发射峰重叠,从而形成PRET反应机制。
实施例3
基于磷光QDs作为探针检测凝血酶体系中优化BHQ2-TAB浓度
为了考察不同浓度的BHQ2-TAB溶液对体系磷光强度的影响,将不同浓度的BHQ2-TAB溶液加入加到磷光探针QDs溶液中,混合均匀后,待体系稳定后进行磷光测试,得到的结果如附图5所示。由附图6可知随着BHQ2-TAB溶液浓度的增加590 nm处的磷光强度呈现出逐渐减小的趋势,当浓度超过0.2 μM时,趋于平衡。
实施例4
基于磷光QDs作为探针检测凝血酶
为了考察不同浓度的凝血酶溶液对体系磷光强度的影响,将不同浓度的凝血酶溶液加入加到实施例3中,混合均匀后,待体系稳定后进行磷光测试,得到的结果如附图6所示。由附图6可知随着凝血酶溶液浓度的增加590 nm处的磷光强度呈现出逐渐增加的趋势。随后,考察590 nm处的磷光强度与凝血酶浓度的关系,结果如附图7所示,在一定的浓度范围0.08-7.5 nmol/L内,磷光强度与溶菌酶的浓度呈良好的线性关系,线性相关系数R2=0.990,线性方程为:P0-P =281.75+10.04C,C是以nmol/L表示的溶菌酶的浓度。
实施例5
基于磷光QDs材料作为荧光探针选择性检测生物分子
以实施例1制备的磷光QDs材料作为磷光探针对不同生物分子进行选择性检测,具体方法如下:
分别将不同生物分子(L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苏氨酸、溶菌酶)加入加到实施例3中,混合均匀,静置待反应体系稳定后,进行磷光测试,考察其选择性识别能力,所得结果绘制成柱状图如附图8所示,考察不同生物分子对对探针材料的磷光响应的影响。正如预期的那样,只有凝血酶的加入导致了体系显著的磷光变化,而其它生物分子加入后体系的磷光响应没有明显变化,表明该方法具有良好的选择性,实现了磷光QDs材料对凝血酶的特异性识别。
上述方法的分析特征量如下表1所示,说明本方法具有较宽的线性范围和较低的检出限,结果令人满意。
表1磷光QDs材料检测凝血酶的分析特征量
Claims (3)
1.一种基于PRET的磷光探针定量检测凝血酶的方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(1)制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中配制成浓度为500 mg/L的溶液作为检测体系,并使用315 nm作为激发波长,测试体系在590 nm处的磷光发射峰;所述的磷光QDs材料指的是MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点;
(2)将TBA-BHQ2溶液加入到步骤(1)的溶液中并混合均匀,静置以确保两者的相互作用,从而形成QDs/TBA-BHQ2复合物溶液,其中TBA-BHQ2的浓度0.1 μmol/L;
(3)待测凝血酶溶液TB加入到步骤(2)的复合物溶液中并混合均匀,静置以确保分析物与QDs/TBA-BHQ2复合物相互作用,以形成TB/TBA-BHQ2复合物;
(4)步骤(2)对磷光量子点探针的磷光进行猝灭,步骤(3)对量子点的磷光进行恢复,并以步骤(1)的检测条件分别对步骤(2)和步骤(3)中形成的复合溶液进行检测,得到磷光恢复响应值,检测样品中凝血酶的浓度;
(5)分别将不同生物分子加入加到步骤(2)所得到QDs/TBA-BHQ2复合物溶液中,混合均匀,静置待反应体系稳定后,进行磷光测试,考察其选择性识别能力;所述的不同生物分子指的是L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苏氨酸或溶菌酶。
2.权利要求1所述的基于PRET的磷光探针定量检测凝血酶的方法,其中所述凝血酶样品须溶解于自制生理盐水中,自制生理盐水配方为:称取0.8克氯化钠,溶解在少量高纯水中,稀释到100毫升,高纯水须用0.45 μm水系膜过滤。
3.按权利要求1或权利要求2所述的基于PRET的磷光探针定量检测凝血酶的方法,在水溶液样品中检测凝血酶的线性范围0.08-7.5 nmol/L,检出限为0.023nmol/L。
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