CN103881701A - 一种磷光能量转移体系，其合成方法，用途以及凝血酶的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磷光能量转移体系，其合成方法，用途以及凝血酶的检测方法，将一条5’端带有氨基修饰核酸适配体通过脱水缩合反应固定在巯基丙酸（MPA）包裹的Mn掺杂的ZnS磷光量子点表面，使得标记的磷光量子点靠近碳纳米点表面，磷光被猝灭。利用核酸适配体与凝血酶的强结合作用，磷光基团远离碳纳米点表面，使得磷光强度恢复，用于测定凝血酶的量。本实验首次采用磷光量子点和碳纳米点之间的磷光能量转移原理来检测生物体内凝血酶的含量，提高了测定的选择性和专一性，并且降低了荧光背景，猝灭时间大大缩短，提高了测定的灵敏度，检测限也较低，采集到的磷光信号稳定，满足了微量分析的要求。

Description

一种磷光能量转移体系,其合成方法,用途以及凝血酶的检测方法

技术领域

本发明涉及一种磷光能量转移体系，其合成方法，用途以及凝血酶的检测方法。 

背景技术

肿瘤组织对周围组织的侵袭，转移的形成以及肿瘤组织和肿瘤患者血液本身的变化均可导致病人凝血机制的改变，产生不同程度的出血倾向。凝血酶是一种重要的生理蛋白酶，在血液凝固，炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥重要作用，因此检测凝血酶在医学上具有重要意义。凝血酶（Thrombin）的浓度及活性是衡量凝血机制的重要指标，对揭示肿瘤的发生机制，或作为早期诊断，分子分型，疗效和预后判断具有重大意义。 

核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）经体外筛选得到的，能与响应的靶分子专一性紧密结合的一类单链DNA或RNA。与抗体相比，适配体靶分子范围广，亲和力高，特异性强，筛选制备方便且纯度高，批间重现性好，性质稳定，容易修饰功能团，因此在药物筛选，临床诊断和分析化学等领域得到了广泛应用。目前建立的基于适配体检测蛋白质的方法有比色法，荧光法，电化学法，压电生物传感法等。其中，荧光法具有灵敏度高，动态范围宽，特性参数多等优点，具有很大的发展潜力。 

量子点是粒径小于或接近于激子波尔半径的半导体纳米晶粒。它们处于分子与块状固体之间的中间状态，通常由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成。量子点的比表面积，表面原子数，表面能和表面张力都随粒径的下降而急剧增加。由于尺寸效应，表面效应以及宏观量子隧道效应等，导致量子点的热，磁，光，敏等特性和表面稳定性均优于相应的体材料。量子点的光学性质是目前科研工作者研究的一个热点。 

量子点作为荧光探针广泛地应用于生物医学，分析科学，环境科学，食品科学等研究领域。其光学特性比传统有机染料相比具有明显的优越性：①量子点的荧光激发光谱宽，且连续分布。因此可以采用单一波长光源同时激发不同颜色的量子点；②可以通过改变量子点粒径大小和组成材料来“调谐”其发射波长，将不同光谱区的量子点混合使用，可以使研究者通过多种颜色同时追踪数种生物分子；③量子点的荧光光谱有较大的斯托克斯位移，荧光光谱窄而对称，因此用不同光谱特征的量子点标记生物分子时，荧光光谱易于识别分析；④比 有机染料具有更高的光稳定性。在深入开发和研究量子点的荧光性质的同时，量子点的磷光性质也开始引起了科学家们的注意。 

磷光是一种长寿命的光，平均寿命达10^-4秒到数秒。磷光与荧光的发光机理不同，是分子中电子激发三线态T₁回到基态S₀而产生的辐射。由于T₁-S₀是禁阻的，其可能性仅为S₁-S₀过程可能性的百万分之一。由于磷光寿命长，在发射光子以前，分子的碰撞运动会使T₁电子经无辐射弛豫返回基态，也就是所谓的磷光猝灭。为克服猝灭现象，最常见的方法就是使用深冷设备把分子固定为刚性体，这就是最初的低温磷光。但是低温磷光的限制条件是必须具有深冷设备，装置价格昂贵且操作复杂。因此室温磷光的研究引起了分析工作者的普遍重视。 

室温磷光的检测有很多的优点：①灵敏度高：磷光的灵敏度通常比一般的吸光光度法高三个数量级；②无需价格昂贵且使用麻烦的低温冷却装置，免除了溶剂或溶液的除氧过程，相对低温磷光法，大大降低了成本和简化了操作步骤；③分析曲线线性范围宽：通常达2-4个数量级；④选择性好：这是因为磷光光谱的位置通常位于更长的波长，具有更大的斯托克斯位移，不会和激发光谱发生重叠，可以避免激发光的干扰，自吸收现象也有所减轻；⑤检出限低：发光分析的检出限一般决定于空白值的大小，因为磷光较少受杂散光及背景发光的干扰，即空白值较低；⑥易于实现连续操作和自动化。 

磷光能量共振转移（PRET）是一种非辐射能量跃迁。当两个荧光发色基团距离足够靠近时，供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，从该电子能态回到基态前，通过偶极子的相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，供体与受体的跃迁偶极的相对取向，以及供体和受体之间的距离等因素都会影响能量转移的效率。传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，并且供，受体发射光谱相互干扰。而量子点用于磷光能量转移的研究，克服了有机荧光染料的不足。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互干扰。由于量子点具有较宽的激发光谱，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，最大限度地避免对能量受体的直接激发。通过改变量子点的组成或尺寸，可以获得发射波长在可见光区的量子点，为吸收光谱在可见光区的生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。 

Pang课题组在2011年的一篇文献(Anal.Chem.2011,83,8130-8137)中报道过有关检测凝血酶的方法，该实验使用上转换荧光材料和碳纳米颗粒之间有效的荧光能量转移原理(FRET)来检测人体血浆中的凝血酶含量，此方法的检测范围在0.5-20nM，最低检出限为0.18nM。但 此方法并没有考虑到核酸适配体自身的荧光干扰和样品散射光的影响，降低了实验结果的可靠性及实验的可重复性。 

由于不是所有的蛋白都能找到与之一一对应的抗原或抗体，而标记蛋白往往会造成蛋白的活性降低甚至失活，传统的免疫蛋白分析不能适应发展需要。而由人工合成的核酸适配体不依赖于动物或细胞，容易获得，可方便地在适配体的特定位置用荧光，酶或生物素分子等功能团加以标记，相对抗原或抗体来说，适配体的稳定性和耐受变性好，且其变性是可逆的，并可长期贮存和在常温下运输。 

近年来，核酸适配体作为一种分子识别元件，越来越受到关注。目前，应用核酸适配体荧光检测蛋白质主要是基于适配体与目标蛋白作用后产生的荧光偏振度或荧光强度的改变来检测蛋白。核酸适配体荧光检测凝血酶也主要采取这两种方式。由于适配体与核酸作用结合后其分子量发生变化，从而引起偏振角度变化，用其检测蛋白，其信号变化范围较小，线性范围较窄，并且荧光偏振对非均相溶液的测定存在一定的局限性。也有人设计分子信标或分子开关与核酸适配体作用，其荧光强度在核酸适配体与目标蛋白结合前后产生变化（主要是由于分子间距离变化产生的荧光猝灭或分子开光微环境变化产生的自猝灭作用），通过荧光强度的改变量来检测蛋白。这类方法也是通过荧光信号的改变量来测定目标蛋白的，荧光背景较大，线性范围不宽，对于低浓度的蛋白测定存在一定困难。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种磷光能量转移体系，其合成方法，用途以及凝血酶的检测方法，Mn掺杂的ZnS量子点作为供体，碳纳米点作为能量的受体，并论证了其对凝血酶的检测可以达到0.013nM的最低检测限。这种传感器展现了良好的分析性能，有效的避免自体荧光和散射光的干扰。磷光能量转移体系检测凝血酶为设计化学生物传感器提供了一个新的方法。 

具体技术方案如下： 

一种磷光能量转移体系，能量的供体为Mn掺杂的ZnS量子点，能量的受体为碳纳米点。 

上述磷光能量转移体系的合成方法，作为能量供体的量子点的采用如下步骤合成： 

（1）容器内加入巯基丙酸，ZnSO₄和MnCl₂水溶液； 

（2）调节溶液的pH值； 

（3）搅拌并饱和； 

（4）加入Na₂S水溶液； 

（5）反应并陈化； 

（6）沉降并高速离心； 

（7）倾去上层清液并干燥，即得。 

进一步地， 

步骤（1）中在100mL的三口烧瓶内，加入0.17mL巯基丙酸，5mL0.1mol/L ZnSO₄和0.2mL0.01mol/L MnCl₂水溶液，和/或， 

步骤（2）中用NaOH调节溶液的pH值至11，和/或， 

步骤（3）中在室温下磁力搅拌，通氮气饱和30分钟，保证稳定剂与Zn²⁺和Mn²⁺络合充分，和/或， 

步骤（4）中注射器在隔绝空气的条件下加入5mL0.1mol/L的Na₂S水溶液，和/或， 

步骤（5）中，在室温下继续反应20分钟，将得到的Mn掺杂ZnS量子点的溶液在空气氛围下陈化2小时，温度控制在50℃，和/或， 

步骤（6）中以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，和/或， 

步骤（7）中，置于室温真空干燥24小时，即可得到实验所需的纳米粒子固体粉末。 

进一步地，作为能量受体的碳纳米点的采用如下步骤合成： 

1）蜡烛灰溶于V_水：V_乙醇=1:1溶液中； 

2）离心并收集上清液； 

3）离心并收集沉淀； 

4）干燥沉淀物； 

5）将步骤4）产物溶于十二烷基苯磺酸钠中； 

6）超声，即得。 

进一步地， 

步骤（1）中取8mg蜡烛灰，溶解在20mLV_水：V_乙醇=1:1中，超声几小时，使蜡烛灰均匀溶解，和/或， 

步骤（2）中用离心机3000转/分钟，离心2分钟，移去大型粒子，收集上清液，和/或， 

步骤（3）中用6000转/分钟离心6分钟，将上层液移去，收集沉淀，和/或， 

步骤（5）中产物溶解在20mL0.02%SDBS(十二烷基苯磺酸钠)中，和/或， 

步骤（6）中获得产物的浓度为0.1mg/mL。 

上述磷光能量转移体系的用途，进一步地，用于对凝血酶的检测。 

一种凝血酶的检测方法，采用磷光量子点和碳纳米点之间的磷光能量转移来检测生物体 内凝血酶的含量。 

进一步地，包括如下步骤： 

a.将适配体固定在Mn掺杂的ZnS磷光量子点表面； 

b.使得标记的磷光量子点靠近碳纳米点表面； 

c.磷光被猝灭； 

d.利用核酸适配体与凝血酶的强结合作用，磷光基团远离碳纳米点表面； 

e.使得磷光强度恢复； 

f.测定凝血酶的量。 

进一步地，所述凝血酶适配体修饰的量子点采用如下步骤制得：取2mg的量子点，超声分散于0.1M pH=7的磷酸盐缓冲液PBS中，加入20mg丁二酸酐，搅拌反应2小时；离心，用pH=7的PBS清洗后，将沉淀溶于0.02M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液中，并加入1.2mgEDC和1.8mg NHS，反应30分钟；再加入50μL的凝血酶适配体TBA,继续反应12小时；反应结束后，离心分离，将沉淀溶于0.02M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液中pH=7.2，即得。 

进一步地，步骤a中具体为将一条5’端带有氨基修饰核酸适配体通过脱水缩合反应固定在巯基丙酸MPA包裹的Mn掺杂的ZnS磷光量子点表面。 

与目前现有技术相比，本发明即克服了荧光信号背景较大的影响，又能有效的避免来自样品本底荧光和散射光的干扰。并且此方法灵敏度高，操作简单，可以快速的检测生物体液中的凝血酶，避免了化学修饰和固定化过程，并且在检测过程中不需要加入任何除氧剂和诱导剂，避免了生物体液中的金属离子，生物分子和其它抗生素的干扰。且本实验的检测范围比已有的文献报道的都低，最低检出限为0.013nM，比文献报道的低两个数量级。 

附图说明

图1a为MPA（巯基丙酸）包裹的Mn掺杂ZnS QDs(MPA-QDs)的TEM（透射电镜）图； 

图1b为TBA-QDs(0.03mg/mL)的磷光光谱图； 

图1c为碳纳米点的SEM（扫描电镜）图; 

图1d为碳纳米点(0.045mg/mL)紫外吸收图; 

图2a为加入不同浓度的碳纳米点时TBA-QDs的磷光猝灭曲线。TBA-QDs的浓度为0.03mgmL^-1;碳纳米点的浓度（从低到高）为：0,0.005,0.01,0.015,0.02,0.025,0.03,0.035,0.04,0.045mg mL^-1.； 

图2b为不同碳纳米点浓度下TBA-QDs的磷光强度线性图和经验方程。 

图2c为MPA-QDs中没有加入（曲线a，黑线）和加入（曲线b，红线）0.045m_g/mL碳纳米点时的磷光谱图; 

图2d为时间猝灭曲线，含有0.03mg/mLTBA-QDs和0.045mg/mL碳纳米点,所有的实验操作都是在0.01M,0.15M NaCl,pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液下进行（激发波长为316nm）。 

图3a为加入入碳纳米点时TBA-QDs的相对磷光强度； 

图3b为没有加入碳纳米点时TBA-QDs的相对磷光强度； 

图4a曲线a为0.03mg/mL TBA-QDs的磷光光谱，曲线b为a+20nM凝血酶，曲线c为a+0.045mg/mL CNDs，曲线d为a+20nM凝血酶； 

图4b为5nM凝血酶加入TBA-QDs-CNDs体系后磷光强度随时间的变化曲线。TBA-QDs浓度：0.03mg/mL;碳点：0.045mg/mL。 

图5a为加入不同浓度的凝血酶后的磷光恢复图，浓度从低到高依次是：0,0.05,0.1,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,20.0,30.0,40.0,50.0,80.0nM.插图是凝血酶在低浓度时的放大曲线； 

图5b为加入不同浓度凝血酶的线性曲线和经验方程。每个数据点代表三个独立的实验误差的平均值。所有的实验都是在(0.01M,0.15M NaCl,pH7.4)的Tris-HCl缓冲液中进行的，TBA-QDs浓度为0.03mg/mL，CNDs浓度为0.045mg/mL。 

图6为凝血酶适配体传感器干扰离子的检测。所有的干扰物质的浓度为1.0uM，凝血酶浓度为5nM。相对磷光强度P/P₀（P₀和P分别代表没有加入凝血酶，但加入干扰物质和加入凝血酶后的磷光强度）。所有的实验都是在(0.01M,0.15M NaCl,pH7.4)的Tris-HCl缓冲液中进行的，TBA-QDs浓度为0.03mg/mL，CNDs浓度为0.045mg/mL。 

图7a为加入不同浓度的凝血酶后磷光强度的恢复，浓度从低到高依次：0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0,50.0,80.0nM. 

图7b线性曲线和经验方程，每个数据点代表三个独立实验的平均值与误差线,所有的实验都是在(0.01M,0.15M NaCl,pH7.4)的Tris-HCl缓冲液中进行的，TBA-QDs浓度为0.03mg/mL，CNDs浓度为0.045mg/mL。 

图8为本发明Mn掺杂ZnS量子点与碳纳米点之间的磷光能量转移检测凝血酶原理图。 

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。 

本实施例将一条5’端带有氨基修饰核酸适配体通过脱水缩合反应固定在巯基丙酸（MPA） 包裹的Mn掺杂的ZnS磷光量子点表面，使得标记的磷光量子点靠近碳纳米点表面，磷光被猝灭。利用核酸适配体与凝血酶的强结合作用，磷光基团远离碳纳米点表面，使得磷光强度恢复，用于测定凝血酶的量。本实验首次采用磷光量子点和碳纳米点之间的磷光能量转移原理来检测生物体内凝血酶的含量，提高了测定的选择性和专一性，并且降低了荧光背景，猝灭时间大大缩短，提高了测定的灵敏度，检测限也较低，采集到的磷光信号稳定，满足了微量分析的要求。 

实验设备：LS-55荧光分光光度计，石英比色皿(1cm×1cm)，扫描电子显微镜，透射电子显微镜，pH-3C酸度计，紫外分光光度计。 

实验材料:巯基丙酸（MPA），ZnSO₄.7H₂O,Na₂S.9H₂O,MnCl₂.4H₂O,乙醇，氮气，十二磺基苯磺酸钠（SDBS），1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐（EDC.HCl），蜡烛，超纯水，凝血酶适配体（5’-NH2-GGTTGGTGTGGTTGG-3’）。 

实验步骤： 

（1）量子点的合成 

锰掺杂的硫化锌量子点的合成是根据已有报道的文献做了少量的修改。在100mL的三口烧瓶内，加入0.17mL巯基丙酸，5mL0.1mol/L ZnSO₄和0.2mL0.01mol/L MnCl₂水溶液，用NaOH调节溶液的pH值至11，在室温下磁力搅拌，通氮气饱和30分钟，保证稳定剂与Zn²⁺和Mn²⁺络合充分。随后用注射器在隔绝空气的条件下加入5mL0.1mol/L的Na₂S水溶液，在室温下继续反应20分钟。将得到的Mn掺杂ZnS量子点的溶液在空气氛围下陈化2小时，温度控制在50℃。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，置于室温真空干燥24小时，即可得到实验所需的纳米粒子固体粉末。用LS-55磷光仪进行检测，在581nm处有强的磷光发射峰。与文献报道相符。 

（2）碳纳米点（CNDs）的制备 

取8mg蜡烛灰，溶解在20mLV_水：V_乙醇=1:1中，超声几小时，使蜡烛灰均匀溶解，然后用离心机3000转/分钟，离心2分钟，移去大型粒子，收集上清液，再用6000转/分钟离心6分钟，将上层液移去，收集沉淀，干燥沉淀物，得到产物2mg。将产物溶解在20mL0.02%SDBS(十二烷基苯磺酸钠)中，超声6小时，获得产物的浓度为0.1mg/mL。 

（3）凝血酶适配体修饰的量子点 

取2mg的量子点，超声分散于0.1M pH=7的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入20mg丁二酸酐，搅拌反应2小时。离心，用pH=7的PBS清洗后，将沉淀溶于0.02M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液中（pH=7.2），并加入1.2mg EDC和1.8mg NHS，反应30分钟。再加入50μL的凝血酶 适配体（TBA）,继续反应12小时。反应结束后，离心分离，将沉淀溶于0.02M NaCl的0.05MTris-HCl缓冲液中（pH=7.2），即得到目标产物。 

（4）磷光猝灭和杂交实验 

取一系列不同浓度的碳纳米点和TBA-QDs混合，用pH=7.2Tris-HCl定容至2mL，室温下反应40分钟。用LS-55荧光仪调节至磷光模式检测溶液的磷光强度。 

实验结论： 

（1）碳纳米点和量子点的表征 

MPA-QDs量子点的形貌通过TEM观察（图1a），显示出球形的颗粒，尺寸均一，粒径大小在5nm左右，这与之前文献报道相符。从SEM图中可以看出氧碳纳米点的尺寸在50nm左右（图1c）。量子点的磷光激发波长为316nm，发射光谱位置大约在581nm，而碳纳米点的紫外吸收峰位置在254nm，并且具有很宽的吸收带(图1d)，使得磷光能量转移能够很好的发生。（2）碳纳米点和量子点之间的磷光能量转移 

在磷光能量转移进程中，TBA-QDs作为供体，碳纳米点作为受体，为了进一步研究磷光能量转移的机制，我们研究了在TBA-QDs中加入不同浓度的碳纳米点。如图2a，在溶液中加入0.03mg/mL的TBA-QDs后逐渐加入不同浓度的碳纳米点（从0.0到0.045mg/mL），磷光强度逐渐下降。当碳纳米点的浓度达到0.045mg/mL时，猝灭效果最大。实验结果表明，当碳纳米点加入TBA-QDs体系中时，TBA-QDs的能量转移到碳纳米点上，从而导致TBA-QDs的磷光强度下降。猝灭效率的计算公式为（1-P/P₀），P₀和P分别代表在不存在（P₀）和存在（P）SWNTs时TBA-QDs的磷光强度。当体系中加入碳纳米点的浓度达到0.045mg/mL时，猝灭效率可以达到最大值为95.9%。这个猝灭效率展现了碳纳米点超强的猝灭效率。这个强的猝灭效率为敏感的“turn on”型传感器的定量实验提供了最佳的猝灭机制。我们还研究了没有适配体标记的MPA-QDs的磷光猝灭机制（图2c），在理想的孵育条件下，加入0.045mg/mL碳纳米点是磷光强度没有明显的变化。这个结果表明MPA-QDs和碳纳米点之间的相互作用更是可以忽略不计的。TBA-QDs磷光猝灭的主要原因是适配体和碳纳米点之间π-π作用力。图2d是TBA-QDs加入0.045mg/mL碳纳米点时的磷光猝灭曲线。在20分钟时达到最大值，随着时间的增长，猝灭效率最大，出现平台。为了保证猝灭效率达到最大值并且信号稳定，我们选择30分钟为最佳孵育时间。 

（3）磷光猝灭机制研究 

磷光猝灭一般被分为静态淬灭和动态猝灭。动态猝灭可以用Stern-Volmer’s方程来描述（方程1），静态猝灭可以用Lineweaver-Burk方程来描述（方程2），如下： 

P₀/P=1+K_SV×c_q     (1) 

1/(P₀-P)=1/P₀+K_LB/(P₀c_q)    (2) 

其中，P₀和P分别代表在TBA-QDs中不加入和加入碳纳米点时的磷光强度。K_SV为动态淬灭常数，K_LB为静态猝灭常数。P₀/P和c_q,1/(P0-P)和1/c_q点之间的关系在图3a和图3b中展现。 

TBA-QDs和碳纳米点之间的磷光猝灭机制既不符合Stern-Volmer’s方程也不符合Lineweaver-Burk方程。这个结果可能是动态猝灭机制和静态猝灭机制共同作用的结果，暗示了一个复杂猝灭模式。如图2b，ln(P₀/P-1)和c_q之间较好的线性关系可以用下面这个经验公式来表示： 

ln(P₀/P-1)=51.26c_q–1.65(R=0.9933) 

文献表明在单链DNA和富含π电子的碳材料，例如碳纳米点，石墨烯和碳纳米管之间可以发生π-π作用。本实验中，TBA-QDs和碳纳米点之间形成无磷光的复杂基态归因与DNA和碳纳米点之间的相互作用。 

（4）“打开型”磷光能量转移检测凝血酶 

我们研究了TBA-QDs-CNDs的磷光能量转移体系对凝血酶的响应。图4a描述的是在TBA-QDs-CNDs体系中加入20nM的凝血酶，TBA-QDs-CNDs体系的磷光强度恢复图（曲线d），结果表明在TBA-QDs-CNDs体系中加入凝血酶后，适配体和凝血酶之间形成四链体的结构，作用力大于适配体和碳纳米点之间的π-π作用。因此，能量受体碳纳米点从能量供体的表面脱离，导致能量供体的磷光强度恢复。基于这个磷光恢复原理，为我们建立“打开型”磷光能量转移检测凝血酶实现可能。我们又考察了在TBA-QDs-CNDs体系中加入凝血酶后磷光恢复的时间影响。图4b，在TBA-QDs-CNDs体系中加入5nM凝血酶后，磷光强度迅速增加，并在40分钟后达到最大值。因此，我们选取40分钟作为磷光恢复的最佳时间。 

在最佳的实验条件下，图5a是在TBA-QDs-CNDs体系中加入不同浓度的凝血酶时磷光强度的恢复图。随着凝血酶浓度的增加，TBA-QDs-CNDs体系的磷光强度也逐渐增加。定义（P-P₀/P₀）（P和P₀分别代表加入不同浓度的凝血酶和不加凝血酶时的磷光强度），图5b中凝血酶的浓度从0增加到40nM时的线性图，相关系数为0.9958，标准曲线方程为(P-P₀)/P₀=0.8356+0.5639c(c单位为nM)。最低检出限为0.013nM（3σ）。σ表示八次空白测定的标准偏差。这些分析参数优于之前文献报道的相关参数（如Table S1）。结合磷光分析的优点，适配体和蛋白质的特异性结构，这种分析技术，有低的检出限。这些方法的相对标准偏差为4.37%，是由测量5nM的凝血酶和七次重复测量的标准偏差得到的。这也表明TBA-QDs-CNDs体系磷光能量转移系统对凝血酶的检测有很高的可重复性。 

表格1（与其它方法的比较） 

(5)适配体和凝血酶之间的抗干扰研究 

在相同的实验条件下，我们研究了类似蛋白质和相同离子对此传感器的影响。我们在TBA-QDs-CNDs体系中加入不同的干扰物质，由图6可以看出，相对磷光强度P/P₀（P₀和P分别代表没有加入凝血酶，但加入干扰物质和加入凝血酶后的磷光强度），加入5nM凝血酶后传感器的相对强度为4.54，这比加入1.0uM其它干扰杂质后的相对磷光强度高出很多。这个结果表明，适配体磷光传感器受干扰杂质的影响很小，此传感器对凝血酶有很好的特异性响应和选择。因此适配体磷光传感器对凝血酶有很好的选择，并且表明“打开型”磷光方法对检测凝血酶有很广泛地发展。 

（6）实际样品检测 

为了证明磷光能量转移对实际样品有很好的应用，我们分别对人体血清和人体尿液进行了检测。所有的人体血清都来自于能凝血的血浆，因为在健康的人体血清中如果没有凝血因子，则没有凝血酶的存在。本实验中，样本血清均来自于健康的人。使用前，用Tris-HCL将待测样品稀释10倍，检测单独样品和加入标准样后凝血酶的浓度。图7a表示的是在人体血清中加入不同浓度的凝血酶后传感器的磷光强度恢复。可以看出，在人体血清中加入凝血酶对浓度成线性关系。如图7b，我们考查0-40nM不同浓度凝血酶的线性曲线，相关系数在0.9991，线性方程为(P-P₀)/P₀=-0.06954+0.1169c(c单位为nM)。与在纯缓冲液中的传感器相比，在血清中检测凝血酶敏感性略低。这可能是血清中其它的因素的作用导致的。最低检出限为0.048nM（3σ）。σ表示八次空白测定的标准偏差。这些方法的相对标准偏差为6.1%，是由测量5nM的凝血酶和七次重复测量的标准偏差得到的。这也表明该磷光传感器在检测血清中的凝血酶含量也有很高的可重复性。在实际的血清样本检测中将不同浓度的凝血酶加入到稀释10倍的血清样本中，在样品中加入5.0,10.0,20.0nM的凝血酶然后进行测量。得出不同的磷光恢复强度在Table1。回收率为97.8%到104.1%。也就表明该磷光传感器可以用于检测人体血清中凝血酶的含量。 

本实验根据磷光能量转移的原理来检测生物体内凝血酶的含量，并在人体血清和血浆实际样品中的检测有很好的响应。本实验我们选取的是Mn掺杂的ZnS磷光量子点作为能量的供体，碳纳米点作为能力的受体，建立能量转移体系。我们还可以合成其他的类似于Mn掺杂的ZnS量子点的磷光量子点，作为能量的供体，寻找其与碳纳米管结构和吸收峰位置相同的能量受体，也可以建立于本实验相同的能量转移体系，用于凝血酶的检测。新型的磷光能量转移体系，Mn掺杂的ZnS量子点作为供体，碳纳米点作为能量的受体，并论证了其对凝血酶的检测可以达到0.013nM的最低检测限。这种传感器展现了良好的分析性能，有效的避免自体荧光和散射光的干扰。磷光能量转移体系检测凝血酶为设计化学生物传感器提供了一个新的方法。 

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。 

Claims (10)

1.一种磷光能量转移体系，其特征在于，能量的供体为Mn掺杂的ZnS量子点，能量的受体为碳纳米点。

2.如权利要求1所述磷光能量转移体系的合成方法，其特征在于，作为能量供体的量子点的采用如下步骤合成：

（1）容器内加入巯基丙酸，ZnSO₄和MnCl₂水溶液；

（2）调节溶液的pH值；

（3）搅拌并饱和；

（4）加入Na₂S水溶液；

（5）反应并陈化；

（6）沉降并高速离心；

（7）倾去上层清液并干燥，即得。

3.如权利要求2所述磷光能量转移体系的合成方法，其特征在于，

步骤（1）中在100mL的三口烧瓶内，加入0.17mL巯基丙酸，5mL0.1mol/L ZnSO₄和0.2mL0.01mol/L MnCl₂水溶液，和/或，

步骤（2）中用NaOH调节溶液的pH值至11，和/或，

步骤（3）中在室温下磁力搅拌，通氮气饱和30分钟，保证稳定剂与Zn²⁺和Mn²⁺络合充分，和/或，

步骤（4）中注射器在隔绝空气的条件下加入5mL0.1mol/L的Na₂S水溶液，和/或，

步骤（5）中，在室温下继续反应20分钟，将得到的Mn掺杂ZnS量子点的溶液在空气氛围下陈化2小时，温度控制在50℃，和/或，

步骤（6）中以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，和/或，

步骤（7）中，置于室温真空干燥24小时，即可得到实验所需的纳米粒子固体粉末。

4.如权利要求2或3所述磷光能量转移体系的合成方法，其特征在于，作为能量受体的碳纳米点的采用如下步骤合成：

1）蜡烛灰溶于V_水：V_乙醇=1:1溶液中；

2）离心并收集上清液；

3）离心并收集沉淀；

4）干燥沉淀物；

5）将步骤4）产物溶于十二烷基苯磺酸钠中；

6）超声，即得。

5.如权利要求4所述磷光能量转移体系的合成方法，其特征在于，

步骤（1）中取8mg蜡烛灰，溶解在20mLV_水：V_乙醇=1:1中，超声几小时，使蜡烛灰均匀溶解，和/或，

步骤（2）中用离心机3000转/分钟，离心2分钟，移去大型粒子，收集上清液，和/或，

步骤（3）中用6000转/分钟离心6分钟，将上层液移去，收集沉淀，和/或，

步骤（5）中产物溶解在20mL0.02%SDBS(十二烷基苯磺酸钠)中，和/或，

步骤（6）中获得产物的浓度为0.1mg/mL。

6.如权利要求1所述磷光能量转移体系的用途，其特征在于，用于对凝血酶的检测。

7.一种凝血酶的检测方法，其特征在于，采用磷光量子点和碳纳米点之间的磷光能量转移来检测生物体内凝血酶的含量。

8.如权利要求7所述的凝血酶的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.将适配体固定在Mn掺杂的ZnS磷光量子点表面；

b.使得标记的磷光量子点靠近碳纳米点表面；

c.磷光被猝灭；

d.利用核酸适配体与凝血酶的强结合作用，磷光基团远离碳纳米点表面；

e.使得磷光强度恢复；

f.测定凝血酶的量。

9.如权利要求7或8所述的凝血酶的检测方法，其特征在于，所述凝血酶适配体修饰的量子点采用如下步骤制得：取2mg的量子点，超声分散于0.1M pH=7的磷酸盐缓冲液PBS中，加入20mg丁二酸酐，搅拌反应2小时；离心，用pH=7的PBS清洗后，将沉淀溶于0.02M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液中，并加入1.2mg EDC和1.8mg NHS，反应30分钟；再加入50μL的凝血酶适配体TBA,继续反应12小时；反应结束后，离心分离，将沉淀溶于0.02M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液中pH=7.2，即得。

10.如权利要求7-9中任一项所述的凝血酶的检测方法，其特征在于，步骤a中具体为将一条5’端带有氨基修饰核酸适配体通过脱水缩合反应固定在巯基丙酸MPA包裹的Mn掺杂的ZnS磷光量子点表面。

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