CN108375563A - 一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法 - Google Patents

一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法。它是利用凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与凝血酶适配体，混合猝灭体系中的TBA离开量子点表面，导致体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛。在本发明中磷光量子点和TBA均未修饰，很大程度的简化了合成步骤，同时也降低了实验成本。该方法准确度高，灵敏度高，在实际样品的检测中都有很好的应用前景。

Description

一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法
本专利受到国家自然科学基金面上项目2137509，天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800）和天津师范大学博士基金项目（No.52XB1510）的资助。
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，主要涉及一种免标记磷光探针对凝血酶定量检测的应用。
背景技术
近年来，以掺杂量子点为标记物的荧光分析法已经引起了国内外研究学者的广泛关注，成为当前科学研究的一大热点。在量子点中引入杂质离子会改变量子点的光、电、磁性质。因为掺杂能引起一些在非掺杂量子点中不可能出现的光特性，所以杂质离子对量子点光学性质的改变尤其重要。例如Mn离子掺杂后形成的Mn掺杂ZnS量子点与ZnS量子点相比具有特殊的室温磷光性质。
室温磷光（RTP）量子点检测受到了广泛的关注，已广泛应用于传感器，特别是生物分子传感器。相比较于其他检测模式，磷光检测模式有很多优点。由于磷光寿命的延长，且不受自荧光或散射光的干扰，所以RTP量子点检测具有较高的可靠性和稳定性。此外，由于磷光比荧光更不常见，因此检测选择性进一步增强。RTP传感器的发展前景广阔，因为其他的大多数生物传感器需要进行其他复杂的预处理。RTP传感器大多研究纯猝灭体系，“off-on”体系的研究还很少。
凝血酶（TB）是血液中的丝氨酸蛋白酶，可将可溶性纤维蛋白转化为不溶性纤维蛋白，促进血液凝固。它在多种生命过程中起着重要作用，并与许多疾病有关，如血栓栓塞性疾病、炎症反应、心血管疾病和抗凝血疗法。因此，对凝血酶的敏感性测定在临床研究和诊断中具有重要意义。
凝血酶适配体（TBA）含有15个碱基，其中含有丰富的鸟嘌呤（G），它与凝血酶有较强的特异性结合。TBA被认为是用于临床使用的一种有价值的、经典的凝血酶抑制剂，因为当使用肝素、华法林和比伐卢定，表现出严重的副作用或狭窄的治疗窗。TBA在折叠成一个反平行的结构时，可以强烈且有选择性地识别人凝血酶的纤维蛋白原结合外位点，抑制其在凝固级联中的关键作用。
本发明所用磷光材料与专利ZL 2015 1 0230335.7（磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽的应用）、ZL 2014 1 0140175.2（一种磷光量子点Mn-ZnS的制备方法及铁形态分析中的应用）中所用一致，但是用于检测的体系的物质不一样。
发明内容
本发明的目的在于克服传统荧光量子点的不足，提供基于磷光量子点为探针检测凝血酶的方法，目的是利用凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与凝血酶适配体（TBA）混合猝灭体系中的TBA离开量子点表面，导致体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛。
在本发明中磷光量子点和TBA均未修饰，很大程度的简化了合成步骤，同时也降低了实验成本。本发明运用的是“off-on”的磷光检测模式，这种体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。
综上，该方法准确度高，灵敏度高，在实际样品的检测中都有很好的应用前景。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
（1）MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液的制备（Wu, P., He, Y., Wang, H.-F., Yan,X.P., 2010. Anal. Chem. 82, 1427–1433.）准确称取0.0020g纯化后的量子点粉末，溶解于4 mL的高纯水中，摇匀备用，浓度为500mg/L；
（2）不同pH Tris-HCl缓冲液的配制
准确称取Tris-HCl固体0.7886g于50mL离心管中，加入40 mL高纯水,然后加入0.1M的NaOH溶液，调节pH至6.0, 6.5,7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.5, 9.0，最后加高纯水定容至50 mL。
（3）不同浓度TBA溶液的配制
分别取100 μM凝血酶适配体溶液10 μL, 30 μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL,70 μL,80 μL, 90 μL, 100 μL, 110 μL,用高纯水定容至1 mL，得到1 μM, 3 μM, 4 μM,5 μM, 6 μM,7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM TBA梯度浓度溶液。
（4）不同浓度凝血酶溶液的配制
加1 mL自制生理盐水至装有0.85 mg凝血酶的小瓶中，配置浓度为22.3 μM的凝血酶原液。分别取22.3 μM的凝血酶原液1 μL, 4 μL, 5 μL, 20 μL, 30 μL, 40 μL, 70 μL, 用高纯水定容至100 μL，得到0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM, 22.3 μM凝血酶梯度浓度溶液。自制生理盐水配方为：称取0.8克氯化钠，溶解在少量高纯水中，稀释到100毫升。
（5）采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入5-50μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M) pH=6.0-9.0 Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL梯度浓度（1 μM-11 μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置1-40 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入5-50μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M) pH=6.0-9.0 Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL梯度浓度（1 μM-11 μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置1-40 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223-22.3μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置1-45 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
本发明更进一步公开了免标记且结合凝血酶适配体的“off-on”型磷光探针定量检测凝血酶的方法在提高检测的灵敏度和选择性方面的应用。实验结果显示本发明所提供的检测方法有较宽的检测范围和较低的检出限，检测凝血酶的过程简单、高效、经济、环保。
本发明利用猝灭剂TBA与具有独特光学性能的MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点之间的相互作用，使得反应体系处于磷光猝灭。随后目标物凝血酶的加入，目标物分子凝血酶与猝灭剂TBA之具有特异性结合的作用，使得被猝灭的磷光强度逐渐恢复。通过磷光强度的变化值和线性方程计算得出待测液中凝血酶的浓度，以此实现对凝血酶的快速、高效、选择性检测。
本发明利用的MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点作为磷光探针选择性检测凝血酶含量，方法简便、快捷不需要复杂的功能化和样品前处理过程就可以实现对凝血酶的选择性检测。
本方法可以有效的避免常用的检测方法如分光光度法、化学发光法、液相色谱法和电化学方法等方法存在的检测时间长、检测过程复杂、有些样品需进行前处理、仪器昂贵、抗干扰能力差、检测灵敏度低等缺点。在众多的基于量子点而开发的光学分析探针中，Mn掺杂量子点不仅可以提高主体量子点的发光效率和稳定性，同时还可以产生室温磷光发射这种特殊的光致发光现象，具有磷光寿命长、选择性强、生物自体荧光和散射光的干扰小、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，非常适合在生物体系中进行分析检测应用，因而被广泛地用于金属离子和生物小分子分析检测中。因此，我们提出了通过简便、绿色的合成方法，制备出磷光强度高、水溶性好、生物毒性小、抗干扰能力强的Mn掺杂磷光量子点，将其开发成为灵敏度高、选择性好的磷光“off-on”型探针，发展为一种简便快捷、易于操作的分析测试手段以实现对凝血酶的选择性检测。
本发明的优点和与现有技术相比的积极效果：
（1）本发明所提供的检测方法有较宽的检测范围和较低的检出限，本方法与其他方法的比较见表1，说明了本方法有较宽的检测范围和较低的检出限。
（2）本发明用磷光量子点检测凝血酶，采用了免标记的方法，同时也利用了凝血酶与TBA之间强的特异性结合，从而提高了选择性。
（3）本发明采用了“off-on”型探针模式，发展为一种简便快捷、易于操作的分析测试手段，提高了定量检测凝血酶的灵敏度和精确度。
（4）本发明使用Mn掺杂ZnS量子点不仅可以提高主体量子点的发光效率和稳定性，同时还可以产生室温磷光发射这种特殊的光致发光现象，具有磷光寿命长、选择性强、生物自体荧光和散射光的干扰小、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，运用在定量检测凝血酶中很大程度的减少外界的干扰。
附图说明
图1为Mn掺杂ZnS磷光量子点的XRD图；
图2为Mn掺杂ZnS磷光量子点的TEM图；
图3为MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点和MPA的傅里叶变换红外光谱图（FTIR）图；
图4为Mn掺杂ZnS磷光量子点的紫外光谱图和磷光发射图，说明本专利中合成的磷光量子点在258 nm处有较强的吸收；在314 nm的激发波长下，本方法合成的磷光量子点在590nm处有激发峰；
图5为加入不同浓度TBA后MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点磷光猝灭优化图（图中a为实施例5，b为实施7）；
图6为Mn掺杂ZnS磷光量子点检测凝血酶的线性范围图，说明了在凝血酶浓度为2.23-2230 nM范围内，反应体系中凝血酶的浓度与磷光强度呈线性关系，其线性方程为：y=465.73+0.095x，R2=0.97。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所述的高纯水购买于杭州娃哈哈集团有限公司，硫酸锌、乙酸锰和硫化钠生产于天津市光复精细化工研究所，3-巯基丙酸(MPA)购于百灵威科技有限公司，Tris-HCl缓冲溶液购于鼎国昌盛生物技术有限责任公司，无水乙醇(C2H5OH)购于天津市基准化学试剂有限公司。凝血酶购于北京索莱宝科技有限公司。凝血酶适配体(TBA)(GGTTGGTGTGGTTGG)购于生工生物工程（上海）股份有限公司，其他试剂均购于天津科威有限公司。
实施例1：
MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点的合成
向100 mL的三口瓶中加入原料5 mL 0.1 M的硫酸锌、5 mL 0.01 M乙酸锰、50 mL 0.04M MPA，用1 M NaOH溶液调节该混合溶液的pH值至11。将该混合液在氮气环境中室温磁力搅拌30 min，保证稳定剂MPA与Zn2+和Mn2+络合充分。随后用注射器在隔绝空气的条件下加入5mL 0.1 M的硫化钠水溶液，在室温下继续搅拌20 min后，停止通N2。将三口瓶置于空气中，50 ℃恒温搅拌陈化2小时。得到具有室温磷光性质的MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点。加入无水乙醇（3倍量的无水乙醇），在12000转下高速离心5 min，弃去上清液，得到的产物用无水乙醇反复清洗多次，室温真空干燥24 h备用。傅里叶变换红外光谱图(FTIR)（图1）得到MPA通过-SH作用成功的包覆在了Mn掺杂ZnS磷光量子点的表面。通过透射电镜图(TEM)（图2），可以看出Mn掺杂ZnS磷光量子点的分散性良好且近似为球型。通过X射线粉末衍射光谱(XRD)（图3）得到磷光量子点的晶型为立方型闪锌矿结构。
实施例2：
1.合成方法参照实施例1；
2. 采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入5μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置35 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入5μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置35 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM,22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置30 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
实施例3：
1.合成方法参照实施例1；
2. 采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置35 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=8.0Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置35 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM,22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置30 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
实施例4：
1.合成方法参照实施例1；
2. 采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置20 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置20 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM,22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置30 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
实施例5：
1.合成方法参照实施例1；
2. 采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 8 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置35 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 8 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置35 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM,22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置30 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
实施例6：
1.合成方法参照实施例1；
2. 采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置35 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置35 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM,22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置20 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
实施例7：
1.合成方法参照实施例1；
2. 采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：
①向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL。摇匀静置35 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
②向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=7.4Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置35 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM, 15.61 μM, 17.84 μM,22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置30 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。
通过实施例2、3，优化不同浓度的量子点，得到最优量子点浓度25 mg/L；通过实施例3、4，优化不同pH值，选择的最优的pH 值为7.4；通过实例4、5，优化不同浓度TBA适配体，选择的体系最优TBA适配体为0.6 μM；通过实例4、7，优化MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点与TBA适配体猝灭反应时长，选择的最优猝灭反应时长为35 min；通过实例6、7，优化加入凝血酶后体系磷光恢复反应时长，选择的最优恢复反应时长为35 min。
在优化TBA浓度的过程中，得到如图5所示的加入不同浓度TBA后Mn掺杂ZnS磷光量子点磷光猝灭优化图，由图5中可得出，TBA体在反应体系中的浓度大于等于0.6 μM时，磷光强度趋于直线稳定，由此得到最优TBA在反应体系中的最优浓度为0.6 μM。
基于上述筛选条件，向离心管中依次加入30μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1mol/L)pH =7.4 Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL 6 μM TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL。摇匀静置35 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223 μM, 0.892 μM, 1.115 μM, 4.46 μM, 6.69 μM, 8.92 μM,15.61 μM, 17.84 μM, 22.3 μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置30 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测。可得到如图5所示的线性拟合图，得到方程y=465.73+0.095x，R2=0.97；

Claims (2)

1.一种免标记且结合凝血酶适配体的“off-on”型磷光探针定量检测凝血酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）向离心管中依次加入5-50 μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50 μL (0.1M) pH=6.0-9.0 Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50 μL梯度浓度（1 μM-11 μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL，摇匀静置1-40 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测；
（2）向离心管中依次加入5-50 μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50 μL (0.1M) pH=6.0-9.0 Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50 μL梯度浓度（1μM-11 μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL，摇匀静置1-40 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50 μL梯度浓度（0.223-22.3μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂，摇匀静置1-45 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测；
（3）以步骤（1）对磷光量子点探针的磷光进行猝灭，以步骤（2）对量子点的磷光进行恢复，并以其对步骤（1）的磷光恢复响应值为检测信号，检测样品中凝血酶的浓度；
凝血酶样品须溶解于自制生理盐水中，自制生理盐水配方为：称取0.8克氯化钠，溶解在少量高纯水中，稀释到100毫升；
高纯水须用0.45 μm水系膜过滤。
2.权利要求1所述的免标记且结合凝血酶适配体的“off-on”型磷光探针定量检测凝血酶的方法在提高检测的灵敏度和选择性方面的应用。
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