CN108517208B - 稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用，属于环境检测技术领域。以鲁米诺(luminol)和单磷酸鸟苷(GMP)为双配体，以稀土离子Tb3+为发光中心离子，通过luminol、GMP和Tb3+之间的自聚合配位作用，建立luminol‑Tb‑GMP荧光探针制备方法。luminol‑Tb‑GMP荧光探针兼具luminol和Tb3+的双荧光信号，在同一激发波长下同时发射luminol和Tb3+的双荧光信号。当Cu2+存在时，luminol和GMP对Cu2+有强配位作用，阻止了电子由GMP的氨基向Tb3+传递，导致Tb3+的荧光猝灭，而luminol的荧光强度则不变，建立基于luminol和Tb3+的荧光信号比率的Cu2+检测方法。此外，随着Cu2+浓度的增加，Tb3+的绿色荧光逐渐减弱，而luminol的蓝色荧光逐渐显现，据此还可实现对Cu2+的可视化检测。luminol‑Tb‑GMP荧光探针还可应用于环境水样和生物样品中Cu2+的灵敏检测。

Description

稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用
技术领域
本发明涉及一种稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用，属于环境检测技术领域。
背景技术
稀土配位聚合物(Ln-CPs)具有高荧光量子产率、长荧光寿命、大stoke位移、线状发射光谱以及组成成分和纳米尺寸可调等优异的光学性能，受到越来越多的关注。近年来，基于Ln-CPs的荧光探针广泛应用于小分子、阳离子、阴离子、温湿度和pH等传感(Real-timeRatiometric Fluorescent Assay for Alkaline Phosphatase Activity with StimulusResponsive Infinite Coordination Polymer Nanoparticles，Analytical Chemistry,2015,87,3080-3086)。研究表明，构成Ln-CPs的桥联配体大部分是合成的有机分子，这些有机配体往往制备方法复杂、水溶性和生物兼容性差，甚至一些有机配体还具有生物毒性。因此，采用具有生物兼容性的配体与稀土金属离子(Ln3+)配位制备Ln-CPs，将有利于进一步拓展其在生物研究领域的应用。核苷酸分子是生物体内重要的生物物质，具有生物兼容性好、原料易得、成本低廉、制备过程简单、结构多样化以及丰富的金属离子配位位点等生物分子配体的诸多优点，尤其是核苷酸分子中的磷酸基团对Ln3+具有很强的亲和性，易与Ln3+进行自组装。然而，传统的核苷酸稀土荧光探针多为单配体单荧光信号调节探针，容易受到环境波动等因素的干扰，从而限制了实际应用。尚未见室温下快速、环保的方法掺入鲁米诺(luminol) 作为第二配体合成双配体稀土荧光探针luminol-Tb-GMP CPNPs的报道。
铜是动物和植物体内重要且必须的微量元素，同时也是很多生物体中蛋白酶的重要辅酶因子。然而，Cu2+浓度过高则具有高毒性并对中枢神经系统产生损伤，进而引起威尔逊疾病和老年痴呆症等神经性疾病，高浓度的Cu2+还能诱导肠胃扰动以及肝脏或肾脏的损伤。 Cu2+的检测方法很多，如原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子质谱法、电化学法、动态光散射法、拉曼散射法以及荧光法(Fluorescent gold clusters as nanosensors forcopper ions in live cells,C.V.Durgadas,C.P.Sharma,K.Sreenivasan,Analyst,2011,136,933-940.)等。其中，荧光法具有高灵敏度、简单、仪器成本低等特点，使得基于荧光的Cu2+检测方法有良好的应用前景。目前，对Cu2+的荧光响应大多基于单荧光猝灭探针，常常受光源或检测器漂移或者复杂样品环境因素影响等的限制。比率荧光探针可以避免以上问题并在近年受到极大的关注(Two-Photon Probe for Cu2+with an Internal Reference:Quantitative Estimation ofCu2+ in Human Tissues by Two-Photon Microscopy,Analytical Chemistry 2014,86,5353-5359.)。两个发射峰分开的探针的荧光强度之比，可修正环境干扰并排除激发光强度波动的影响，因而提高定量分析的精确度。所以，发展Cu2+比率荧光检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用，该方法制备稀土比率荧光探针具有简单、快速、环境友好的特点，且可实现对Cu2+的比率荧光法和可视化双检测，对Cu2+具有灵敏度高和选择性好的优点，还可用于环境水样以及复杂生物样品中Cu2+的检测。
本发明实现步骤为：
一种稀土比率荧光探针的制备方法，其特征在于，将40μL 10mM鲁米诺溶液与90μL100mM单磷酸鸟苷溶液混合，充分搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O 溶液，继续搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀；将乳白色絮状沉淀在12000rpm转速下离心，得到的沉淀用超纯水洗净后再次离心，反复3次，将得到的沉淀溶于1mL超纯水中，制成稀土比率荧光探针溶液。
本发明还涉及稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用，其方法为：
将10μL稀土比率荧光探针溶液、40μL 10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的 Cu2+溶液混合，用超纯水稀释至溶液总体积为200μL，在37℃反应30分钟，采用荧光分光光度计测量在激发波长为290nm时溶液的荧光光谱，并根据不同浓度的Cu2+与对应的鲁米诺与Tb3+的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测，或在波长为253.7nm的紫外灯照射下，观察稀释后溶液颜色的变化来实现对Cu2+的快速可视化分析。
本发明制备得到的稀土比率荧光探针溶液应用于Cu2+的检测时，稀土比率荧光探针同时发射鲁米诺和稀土Tb3+的双荧光信号；随着Cu2+浓度的增加，鲁米诺在430nm处的荧光强度不变，Tb3+在547nm处的荧光强度逐渐减弱，则鲁米诺和Tb3+的荧光信号比率F430/F547逐渐增大，根据F430/F547可实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测；此外，将稀土比率荧光探针溶液、10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混合，在37℃反应30分钟，在波长为253.7nm的紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化；稀土比率荧光探针溶液呈Tb3+的绿色，随着Cu2+浓度的增加，Tb3+的绿色逐渐减弱，而鲁米诺的蓝色逐渐显现，根据溶液颜色变化可实现对Cu2+的快速可视化分析。
本发明制得的稀土比率荧光探针溶液应用于Cu2+的具体检测时，Cu2+浓度在0.01-80μM 范围内时，浓度的Cu2+对应的荧光信号强度的比值呈良好的线性，检出限为4.2nM。
本发明的有益效果为：
本发明以鲁米诺和生物分子单磷酸鸟苷为双配体，以稀土离子Tb3+为发光中心离子，通过luminol、GMP和Tb3+之间的自聚合配位作用，建立简单、快速、绿色的luminol-Tb-GMP 荧光探针制备方法；本发明方法制备的luminol-Tb-GMP荧光探针兼具luminol和Tb3+的双荧光信号，在同一激发波长下可同时发射luminol和Tb3+的双荧光信号，其中，当Cu2+存在时，luminol和GMP对Cu2+的强配位作用，阻止了电子由GMP的氨基向Tb3+传递，导致 Tb3+的荧光猝灭，而luminol的荧光强度不变，随着Cu2+浓度的增加，luminol在430nm处的荧光强度与Tb3+在547nm处的荧光强度的比值F430/F547逐渐增大，根据F430/F547可实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测，双荧光比率法可修正环境干扰并排除激发光强度的波动，可大大改善对Cu2+定量分析的精确性；此外，随着Cu2+浓度的增加，在波长为253.7nm的紫外灯照射下，Tb3+的绿光逐渐减弱，而luminol的蓝光逐渐显现，据此还可实现对Cu2+的可视化检测。本发明方法可用于环境水样以及复杂生物样品中Cu2+的检测。
附图说明
图1是(a)luminol,(b)luminol-Tb,(c)GMP-Tb,(d)luminol-Tb-GMP,(e)luminol-GMP的荧光光谱图。
图2是(a)luminol,(b)GMP,(c)luminol-Tb-GMP的傅利叶变换红外光谱图。
图3是(a)luminol,(b)GMP,(c)luminol-Tb-GMP的紫外可见吸收光谱图。
图4是(A)luminol-Tb-GMP的扫描电镜图,(B)GMP-Tb的扫描电镜图。
图5是(A)luminol-Tb-GMP对不同浓度Cu2+响应的荧光光谱图,(B)F430/F547对Cu2+的校准曲线。
图6是luminol-Tb-GMP对Cu2+检测的选择性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于此；
实施例1
luminol-Tb-GMP比率荧光探针的制备：将40μL 10mM鲁米诺溶液与90μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，充分搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，继续搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀；将乳白色絮状沉淀在12000rpm转速下离心，得到的沉淀用超纯水洗净后再次离心，反复3次，将得到的沉淀溶于1mL超纯水中，制成稀土比率荧光探针溶液。
采用荧光光谱法分别对luminol、luminol-Tb、GMP-Tb、luminol-Tb-GMP和luminol-GMP 进行表征，结果如图1所示。其中，图1为luminol、luminol-Tb、GMP-Tb、luminol-Tb-GMP 和luminol-GMP的荧光光谱图。在290nm激发波长下，luminol的最大荧光发射峰位于430 nm，但是峰强度很弱(曲线a)；而luminol-Tb极大地增强了luminol在430nm处的荧光 (曲线b)；GMP-Tb产生了Tb3+的四个特征峰，分别位于488nm、547nm、586nm和630nm(曲线c)；luminol-Tb-GMP同时具有luminol和Tb3+的荧光峰，表明luminol与GMP 成功地与Tb3+配位聚合(曲线d)；GMP与luminol的混合溶液的荧光强度与luminol相同，表明GMP对luminol的荧光没有干扰(曲线e)。
采用傅利叶变换红外光谱法对luminol、GMP和luminol-Tb-GMP进行定性鉴定，结果如图2所示。其中，图2为luminol、GMP和luminol-Tb-GMP的傅利叶变换红外光谱图。luminol在3420cm-1和3330cm-1处出现了N-H的伸缩振动，1622cm-1和1053cm-1处分别出现了C＝O的弯曲振动和伸缩振动(曲线a)。GMP在1688cm-1、1475cm-1、1240cm-1和1083cm-1处的吸收峰分别对应于P-OH的伸缩振动、鸟嘌呤N7-C8伸缩振动、磷酸的反对称和对称振动(曲线b)。luminol-Tb-GMP中GMP的特征吸收峰1688cm-1、1475cm-1和1083cm-1分别移动至1692cm-1、1479cm-1和1088cm-1，而1240cm-1处的特征吸收峰消失；同时，luminol的N-H特征峰和C＝O特征峰也发生了改变，1053cm-1处的特征吸收峰消失，1622cm-1处的特征吸收峰移动至1625cm-1(曲线c)。以上结果表明GMP和luminol 参与了luminol-Tb-GMP的形成。
采用紫外-可见光谱法谱进一步证实luminol-Tb-GMP的形成，结果如图3所示。GMP在260nm处有强吸收峰(曲线a)，luminol在300nm和347nm有明显的吸收峰(曲线b)，而luminol-Tb-GMP明显扩大了紫外吸收宽度且在260nm和347nm处发生了明显的减色效应(曲线c)，表明luminol和GMP均与Tb3+发生了配位作用。
图4A为luminol-Tb-GMP的扫描电镜图，可见，luminol-Tb-GMP由致密的网状纳米粒子构成，纳米粒子粒径约50nm。与单配体形成的GMP-Tb的透射电镜形貌相比(图4B)，掺入luminol的luminol-Tb-GMP的结构明显更紧密，表明采用本发明方法成功制备了luminol和GMP双配体的luminol-Tb-GMP。
实施例2
luminol浓度、Tb3+浓度和检测pH的优化
对制备的luminol-Tb-GMP溶液中的luminol浓度和Tb3+浓度以及对Cu2+检测时溶液的 pH值等实验条件进行了优化。luminol的浓度在传感过程中起着重要的作用，它不仅影响 luminol-Tb-GMP对Cu2+的灵敏度和选择性，还起到内参比信号的作用。当不存在Cu2+时，随着luminol-Tb-GMP中的luminol浓度的增加，F430/F547的值逐渐增大；当加入Cu2+时，由于Cu2+淬灭Tb3+的荧光而使F430/F547值增加，且luminol-Tb-GMP中的luminol浓度为0.4mM时对Cu2+响应最灵敏，因此，制备的luminol-Tb-GMP溶液中的luminol的最佳浓度为0.4mM。当不存在Cu2+时，随着luminol-Tb-GMP中Tb3+浓度的增加，F430/F547的比值缓慢降低；当 Cu2+存在时，在luminol-Tb-GMP中的Tb3+浓度小于10mM时F430/F547的比值随着Tb3+浓度增加而增大，当Tb3+浓度大于10mM时又稍有降低，因此，制备的luminol-Tb-GMP溶液中的Tb3+的最佳浓度为10mM，此时对Cu2+的响应最灵敏。当不存在Cu2+时，F430/F547的比值随着溶液pH的增加而增大，这是由于luminol对溶液pH的响应比较灵敏；当Cu2+存在时，pH值小于9.0时F430/F547的比值随着pH增加而增大，当pH大于9.0时逐渐降低，表明弱碱性环境更有利于提高检测Cu2+的灵敏度，因此，选择在pH为9.0时进行检测。
实施例3
luminol-Tb-GMP对Cu2+的检测应用
在优化实验条件下，采用luminol-Tb-GMP比率荧光探针对Cu2+进行定量检测。将10μL luminol-Tb-GMP溶液、40μL 10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混合，用超纯水稀释溶液总体积为200μL，在37℃反应30分钟，测量激发波长为290nm时溶液的荧光光谱。由图5可见，luminol-Tb-GMP比率荧光探针同时发射luminol和Tb3+的双荧光信号；随着Cu2+浓度的增加，luminol在430nm处的荧光强度不变，Tb3+在547nm处的荧光强度逐渐减弱，则luminol和Tb3+的荧光信号比率F430/F547逐渐增大(图5A)，F430/F547与Cu2+浓度在0.01-80μM范围内呈良好的线性，检出限为4.2nM(图5B)，比GMP单配体制备的GMP-Tb荧光探针对Cu2+的检出限低了近三个数量级。此外，将luminol-Tb-GMP 溶液、10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混合，在37℃反应30分钟，在波长为253.7nm的紫外灯照射下，观察溶液颜色的变化；luminol-Tb-GMP溶液呈Tb3+的绿色，随着Cu2+浓度的增加，Tb3+的绿色荧光逐渐减弱，而luminol的蓝色荧光逐渐显现，根据溶液颜色变化可实现对Cu2+的快速可视化分析。
考察了luminol-Tb-GMP对Cu2+检测的选择性，由图6可见，50μM Cu2+使得luminol-Tb-GMP的F430/F547迅速增大，而500μM其他金属离子(包括Ba2+,Mn2+,Zn2+,Cd2+, Pb2 +,Hg2+,Ag+,As(V),As(III),Fe2+,Co2+,SO4 2-,PO4 3-)、葡萄糖、抗坏血酸以及尿素等均不干扰Cu2+检测，表明本发明方法制备的luminol-Tb-GMP比率荧光探针对Cu2+检测具有良好的选择性。
采用标准加入法考察了luminol-Tb-GMP对环境水样中的Cu2+的检测应用。取赣江南昌段水样，用0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤，滤去漂浮物。将100μL水样、10μL luminol-Tb-GMP溶液和不同浓度的Cu2+标准溶液混合，加入10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液直至溶液总体积为200μL，在37℃反应30分钟，测量激发波长为290nm时溶液的荧光光谱。结果表明，本方法对水样中的Cu2+的回收率为97％-103％，与电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS)法测量得到的结果相一致。结果表明，本发明方法能用于检测实际水样中的Cu2+。
此外，采用标准加入法考察了luminol-Tb-GMP对生物样品中的Cu2+的检测应用。相关文献表明，由卵巢癌引起的腹水液中Cu2+的浓度明显升高，甚至比正常情况下高出10倍。肝硬化患者尿液中Cu2+的浓度明显高于正常人体尿液中Cu2+浓度。据此，我们收集了卵巢癌患者的腹水液和肝硬化患者的尿液，经3kDa的超滤装置去除蛋白质，滤液稀释5倍作为生物样品。将100μL生物样品、10μL luminol-Tb-GMP溶液和不同浓度的Cu2+标准溶液混合，加入10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液直至溶液总体积为200μL，在37℃反应30分钟，测量激发波长为290nm时溶液的荧光光谱。结果表明，本方法对卵巢癌患者的腹水液样品和肝硬化患者尿液样品中的Cu2+的回收率分别为96％-102％和97％-104％，与ICP-MS法测量得到的结果相一致。结果表明，本发明方法能用于检测复杂生物样品中的Cu2+，具有良好的应用价值。

Claims (6)

1.稀土比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将鲁米诺溶液与90μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，充分搅拌30分钟，再加入100μL100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，继续搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀；将乳白色絮状沉淀在12000rpm转速下离心，得到的沉淀用超纯水洗净后再次离心，反复3次，将得到的沉淀溶于1mL超纯水中，制成稀土比率荧光探针溶液。
2.如权利要求1所述的稀土比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述鲁米诺溶液的浓度为40μL 10mM。
3.权利要求1中制备的稀土比率荧光探针对Cu2+的非疾病诊断和治疗中的检测应用，其特征在于，方法为：
将10μL稀土比率荧光探针溶液、40μL 10mM Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混合，用超纯水稀释至溶液总体积为200μL，在37℃反应30分钟，采用荧光分光光度计测量在激发波长为290nm时溶液的荧光光谱，并根据不同浓度的Cu2+与对应的鲁米诺与Tb3+的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测，或在波长为253.7nm的紫外灯照射下，观察稀释后溶液颜色的变化来实现对Cu2+的快速可视化分析。
4.如权利要求3所述的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用，其特征在于，所述鲁米诺与Tb3+的荧光信号强度之间的比值为激发波长为290nm时，溶液中的鲁米诺在430nm处的荧光强度与Tb3+在547nm处的荧光强度之间的比值。
5.如权利要求3所述的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0。
6.如权利要求3所述的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用，其特征在于，所述Cu2+的浓度范围为0.01-80μM。
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