CN106833628A - 表面修饰的碳纳米点及其制备和作为荧光探针检测Cu2+及谷胱甘肽的应用 - Google Patents

Abstract

表面修饰的碳纳米点及其制备和作为荧光探针检测Cu²⁺及谷胱甘肽的应用，本发明涉及Cu²⁺和谷胱甘肽的检测方法，本发明是要解决现有的检测Cu²⁺荧光探针易受其它金属离子干扰、制备成本高、制备步骤复杂的技术问题。本发明以三乙烯四胺修饰的碳纳米点作为荧光探针检测Cu²⁺和谷胱甘肽，荧光探针的制备方法是将柠檬酸和尿素在水溶液中微波加热，获得的碳纳米点加入到含有三乙烯四胺的乙醇溶液回流，制得荧光探针。该制备方法简单、反应条件温和、成本低。检测方法：荧光探针与Cu²⁺的相互作用，使TCDs荧光猝灭并形成TCDs‑Cu²⁺复合物，TCDs‑Cu²⁺复合物进一步与谷胱甘肽相互作用，并使TCDs的荧光恢复，从而实现对Cu²⁺及谷胱甘肽的检测。该探针可检测水溶液及生命体中的铜离子和谷胱甘肽。

Description

表面修饰的碳纳米点及其制备和作为荧光探针检测Cu2+及谷 胱甘肽的应用

技术领域

本发明属于纳米-荧光传感器领域，具体涉及荧光探针检测Cu²⁺和谷胱甘肽的方法。

背景技术

铜是生命必须的微量元素之一，在人体生理过程中发挥着重要作用。但当人体中的铜离子浓度超过一定浓度时，也会导致中毒，并产生严重的不可逆神经损伤。另外，富含巯基的三肽，如谷胱甘肽(GSH)几乎存在于人体的每一个细胞，能帮助人体保持正常的免疫功能。检测Cu²⁺及谷胱甘肽等生命体中重要的生物活性物质，并研究它们的相互作用，对于生物、化学、环境等都有着特殊意义。目前有荧光法检测Cu²⁺的荧光探针，如米小龙等人在《高等学校化学学报》2016第37卷第10期的1784～1791页报道了两种罗丹明类衍生物Cu²⁺的荧光探针，日光下，Cu²⁺可以使这两种罗丹明类衍生物由无色变为橘色或粉红色。但这种探针易受其他金属离子干扰，识别不具有专一性，而且制备成本高，制备步骤复杂。

碳纳米点作为一种新型的荧光材料备受关注。它具有良好的水溶性、化学惰性、低毒、易修饰、抗光漂白等性能。由于碳纳米点的良好性能，大量的研究者主要从制备和表面修饰两方面研究碳纳米点，碳纳米点的表面修饰方面，人们通过改变碳纳米点的表面基团，使修饰后的碳纳米点能更好的应用于分子识别和化学传感。但由于碳纳米点作为荧光检测方法研究的历史比较短，尚未见到利用表面修饰的碳纳米点作为荧光探针检测Cu²⁺和谷胱甘肽的分析方法的报道。

发明内容

本发明是要解决现有的检测Cu²⁺荧光探针易受其它金属离子干扰、制备成本高，制备步骤复杂的技术问题，而提供表面修饰的碳纳米点及其制备和作为荧光探针检测Cu²⁺及谷胱甘肽的应用，实现了高选择性荧光检测Cu²⁺和谷胱甘肽。

本发明的表面修饰的碳纳米点是三乙烯四胺修饰的碳纳米点，粒径为3～5nm。

上述的表面修饰的碳纳米点的制备方法按以下步骤进行：

一、按碳纳米点与三乙烯四胺的质量比为1:(0.1～10)将碳纳米点与三乙烯四胺加入到乙醇中混合均匀，得到混合物；

二、将混合物加热回流反应5～48h，得到粗产物；

三、将粗产物旋转蒸发除去乙醇，再用苯洗涤粗产物1～5次，离心分离后，用超纯水溶解固相物，得到溶液，再将溶液过滤；将滤液真空干燥，即得到表面修饰的碳纳米点(TCDs)。

其中步骤一中所述的碳纳米点(CDs)是由尿素和柠檬酸按质量比1:(1～6)的比例混合，然后通过微波加热制备的一种富含碳的纳米颗粒；

本发明的表面修饰的碳纳米点可作为荧光探针检测二价铜离子和谷胱甘肽，铜离子和谷胱甘肽为水溶液中的铜离子和谷胱甘肽或生命体中的铜离子和谷胱甘肽。

其中，定性检测铜离子和谷胱甘肽的方法具体是：

(1)将表面修饰的碳纳米点溶于超纯水中(TCDs)，形成TCDs水溶液，并测定溶液的荧光光谱；

(2)将上述的TCDs水溶液与待测水溶液Ⅰ混合，测定其荧光光谱，如果荧光强度显著减弱，则可以判定待测水溶液Ⅰ含有铜离子，形成了TCDs-Cu²⁺复合物；否则待测水溶液Ⅰ没有铜离子；

(3)将TCDs-Cu²⁺复合物的溶液与待测水溶液Ⅱ混合，测定其荧光光谱，如果荧光强度得以恢复，则可以判定待测水溶液Ⅱ含有谷胱甘肽(GSH)，形成TCDs-Cu²⁺-GSH；否则待测水溶液Ⅱ中没有谷胱甘肽。

定量检测水溶液中铜离子和谷胱甘肽的方法为标准曲线法，具体如下：

(1)配制不同浓度的含Cu²⁺的标准系列样品Ⅰ，分别加入表面修饰的碳纳米点(TCDs)溶液，并调节至pH值6.0～8.3之间，并测试溶液的荧光光谱，读出最大荧光发射峰的荧光强度值，以铜离子的浓度为横坐标、以最大荧光发射峰的荧光强度值为纵坐标作图，绘出标准曲线；

(2)用与标准样品Ⅰ相同的方法，测试待测溶液中加入表面修饰的碳纳米点(TCDs)溶液后的荧光光谱，根据最大荧光发射峰的荧光强度值在标准曲线上读出铜离子的浓度值；

(3)配制不同浓度的含谷胱甘肽(GSH)的标准系列样品Ⅱ，分别加入TCDs-Cu²⁺混合溶液，并调节至pH值6.0～8.3之间，并测试溶液的荧光光谱，读出最大荧光发射峰的荧光强度值，以谷胱甘肽的浓度为横坐标、以最大荧光发射峰的荧光强度值为纵坐标作图，绘出标准曲线；

(4)用与标准样品Ⅱ相同的方法，测试待测溶液中加入TCDs-Cu²⁺混合溶液后的荧光光谱，根据最大荧光发射峰的荧光强度值在标准曲线上读出谷胱甘肽的浓度值。

5.生命体中的铜离子和谷胱甘肽的检测方法，如下：

(1)将待测的生命体放置到含有表面修饰的碳纳米点(TCDs)水溶液中培养1～6h，然后用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(2)再把用TCDs培养后的生命体放入待测溶液Ⅰ中培养1～6h后，用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(3)进一步把TCDs-Cu²⁺培养后生命体放入待测溶液Ⅱ中培养1～6h后，再用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(4)如果在步骤(2)出现荧光强度显著减弱，则可以判定待测溶液Ⅰ含有铜离子；

(5)如果在步骤(3)出现荧光强度恢复，则可以判定待测水溶液Ⅱ中含有谷胱甘肽。

本发明利用荧光光谱研究了有机胺表面修饰的碳纳米点(TCDs)与Cu²⁺的相互作用，使TCDs荧光猝灭并形成TCDs-Cu²⁺复合物；该复合物进一步与谷胱甘肽相互作用，使TCDs的荧光恢复。从而建立了一种表面修饰的碳纳米点作为荧光探针荧光猝灭检测Cu²⁺，进一步荧光恢复检测谷胱甘肽的方法。在检测Cu²⁺时不受其它阳离子的干扰，识别具有专一性，检测限低至3.4nM；在检测谷胱甘肽时，基本不受常见阴离子和氨基酸的干扰，也具有识别专一性，检测限低至0.11μM。该有机胺表面修饰的碳纳米点荧光探针，制备成本低，反应条件温和，操作简单。本发明的荧光探针不仅可以用于检测水溶液中的铜离子和谷胱甘肽，而且还可以通过细胞成像，检测生命体中的铜离子和谷胱甘肽。

附图说明

图1为实施例1中碳纳米点(CDs)和表面修饰的碳纳米点(TCDs)的红外透射光谱；

图2为实施例1中TCDs、TCDs/Cu²⁺、TCDs/Cu²⁺+GSH的透射电镜(TEM)图；

图3是实施例1的TCDs和TCDs-Cu²⁺混合溶液的最大荧光发射峰强度随pH值的变化曲线图；

图4是实施例1中TCDs对不同种类的金属离子的荧光响应图；

图5是实施例1中TCDs和不同浓度的Cu²⁺的混合溶液的荧光光谱图；

图6是实施例1中Cu²⁺浓度对TCDs的最大荧光发射峰强度的影响；

图7是实施例1中的TCDs-Cu²⁺-GSH对不同种类的常见阴离子和氨基酸的荧光响应图；

图8是实施例1中的TCDs-Cu²⁺混合溶液和不同浓度的GSH溶液的荧光光谱图；

图9是实施例1中的GSH浓度对TCDs-Cu²⁺混合溶液的最大荧光发射峰强度的影响；

图10是实施例1中TCDs、TCDs-Cu²⁺混合溶液以及TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液在酵母细胞中的荧光成像图；

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的表面修饰的碳纳米点是三乙烯四胺修饰的碳纳米点，粒径为3～5nm。

具体实施方式二：具体实施方式一所述的表面修饰的碳纳米点的制备方法按以下步骤进行：

一、按碳纳米点与三乙烯四胺的质量比为1:(0.1～10)将碳纳米点与三乙烯四胺加入到乙醇中混合均匀，得到混合物；

二、将混合物加热回流反应5～48h，得到粗产物；

三、将粗产物旋转蒸发除去乙醇，再用苯洗涤粗产物1～5次，离心分离后，用超纯水溶解固相物，得到溶液，再将溶液过滤；将滤液真空干燥，即得到表面修饰的碳纳米点(TCDs)。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中所述的碳纳米点(CDs)是由尿素和柠檬酸按质量比1:(1～6)的比例混合，然后通过微波加热制备的一种富含碳的纳米颗粒；其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一中碳纳米点与三乙烯四胺的质量比为1:1；其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤一中碳纳米点与三乙烯四胺的质量比为1:5；其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二中加热回流反应时间为24h；其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：具体实施方式一所述的表面修饰的碳纳米点可作为荧光探针检测二价铜离子和谷胱甘肽；其中铜离子和谷胱甘肽为水溶液中的铜离子和谷胱甘肽或生命体中的铜离子和谷胱甘肽。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：定性检测铜离子和谷胱甘肽的方法按以下步骤进行：

(1)将表面修饰的碳纳米点溶于超纯水中(TCDs)，形成TCDs水溶液，并测定溶液的荧光光谱；

(2)将上述的TCDs水溶液与待测水溶液混合，测定其荧光光谱，如果荧光强度显著减弱，则可以判定待测水溶液含有铜离子，形成了TCDs-Cu²⁺复合物；否则待测水溶液没有铜离子；

(3)将TCDs-Cu²⁺复合物的溶液与待测水溶液混合，测定其荧光光谱，如果荧光强度得以恢复，则可以判定待测水溶液含有谷胱甘肽(GSH)，形成TCDs-Cu²⁺-GSH；否则待测水溶液中没有谷胱甘肽。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤(2)中荧光强度显著减弱是指荧光强度降低到原来的50％以下；其它与具体实施方式八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八或九不同的是步骤(3)中荧光强度得以恢复是指荧光强度提高到原来的80％以上；其它与具体实施方式八相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式七至十之一不同的是定量检测水溶液中铜离子和谷胱甘肽的方法为标准曲线法，具体如下：

(1)配制不同浓度的含Cu²⁺的标准系列样品Ⅰ，分别加入表面修饰的碳纳米点(TCDs)溶液，并调节至pH值6.0～8.3之间，并测试溶液的荧光光谱，读出最大荧光发射峰的荧光强度值，以铜离子的浓度为横坐标、以最大荧光发射峰的荧光强度值为纵坐标作图，绘出标准曲线；

(2)用与标准样品Ⅰ相同的方法，测试待测溶液中加入表面修饰的碳纳米点(TCDs)溶液后的荧光光谱，根据最大荧光发射峰的荧光强度值在标准曲线上读出铜离子的浓度值；

(3)配制不同浓度的含谷胱甘肽(GSH)的标准系列样品Ⅱ，分别加入TCDs-Cu²⁺混合溶液，并调节至pH值6.0～8.3之间，并测试溶液的荧光光谱，读出最大荧光发射峰的荧光强度值，以谷胱甘肽的浓度为横坐标、以最大荧光发射峰的荧光强度值为纵坐标作图，绘出标准曲线；

(4)用与标准样品Ⅱ相同的方法，测试待测溶液中加入TCDs-Cu²⁺混合溶液后的荧光光谱，根据最大荧光发射峰的荧光强度值在标准曲线上读出谷胱甘肽的浓度值。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式七至十之一不同的是生命体中的铜离子和谷胱甘肽的检测方法，按以下步骤进行：

(1)将待测的生命体放置到含有表面修饰的碳纳米点(TCDs)水溶液中培养1～6h，然后用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(2)再把用TCDs培养后的生命体放入待测溶液Ⅰ中培养1～6h后，用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(3)进一步把TCDs-Cu²⁺培养后生命体放入待测溶液Ⅱ中培养1～6h后，再用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(4)如果在步骤(2)出现荧光强度显著减弱，则可以判定待测溶液Ⅰ含有铜离子；

(5)如果在步骤(3)出现荧光强度恢复，则可以判定待测水溶液Ⅱ中含有谷胱甘肽。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十二不同的是步骤(4)中，荧光强度显著减弱是指荧光强度降低到原来的50％以下；其它与具体实施方式十二相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十二不同的是步骤(5)中，荧光强度恢复是指提高到原来的80％以上；其它与具体实施方式十二相同。

为使本领域技术人员进一步理解本发明，下面结合实施例和附图进一步说明本发明。

实施例1、本实施例1的表面修饰的碳纳米点的制备方法按以下步骤进行：

(1)向盛有30mL乙醇的圆底烧瓶中加入质量比为1.10克的碳纳米点(CDs)和1.09克三乙烯四胺，充分混合，得到混合物；其中所述的CDs的制备方法是：按尿素与柠檬酸按质量比为1:1的比例混合，然后放在微波炉中微波加热5min，用超纯水溶解固相物，离心、真空干燥，得到碳纳米点(CDs)，即富含碳的纳米颗粒；

(2)将混合物加热回流反应24h，得到粗产物；

(3)旋转蒸发粗产物，除去乙醇，用苯洗涤3次沉淀物，离心分离后，用超纯水溶解产物得到溶液，过滤；

(4)将滤液放置真空干燥箱120℃干燥24h，除去未反应的小分子，即得到表面修饰的碳纳米点(TCDs)。

图1为本实施例1中的CDs和TCDs的红外透射光谱。在TCDs的红外透射光谱中出现了胺的特征峰，说明三乙烯四胺修饰在碳纳米点上。

将50μg本实施例制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)加入10mL乙醇中，调节至pH值7.0，再加入10μL，0.05moL/L的Cu²⁺水溶液，得到TCDs/Cu²⁺，再加入10μL，0.05moL/L的谷胱甘肽，得到TCDs/Cu²⁺+GSH，此过程中TCDs、TCDs/Cu²⁺、TCDs/Cu²⁺+GSH的透射电镜(TEM)图如图2所示，其中图2A)为TCDs的TEM图，从图2A)可以看出TCDs的粒径大约为3-5nm左右，当TCDs溶液与Cu²⁺混合之后，形成的络合物TCDs/Cu²⁺的粒径变大，大约为30nm(如图2B)。如图2C所示，在上述TCDs/Cu²⁺络合物溶液中加入GSH后，发现其粒径恢复，直径为8nm左右。

将本实施例1制备的50μg TCDs溶解于10mL超纯水中，用含有此浓度的TCDs水溶液溶解盐酸或者氢氧化钠，并调节TCDs水溶液的pH值，pH值的调节范围为2～12，，激发波长为380nm，室温条件下，利用荧光光谱仪，测定了TCDs水溶液在不同pH值下的最大荧光发射峰的强度，TCDs随pH值变化的曲线如图3的A所示；将50μg TCDs溶解于10mL超纯水中，再加入10μL，0.05moL/L的Cu²⁺水溶液，混合均匀。用含有此浓度的TCDs-Cu²⁺水溶液溶解盐酸或者氢氧化钠，并调节TCDs-Cu²⁺混合水溶液的pH值，pH值的调节范围为2～12，激发波长为380nm，室温条件下，利用荧光光谱仪，测定了TCDs-Cu²⁺混合溶液在不同pH值下的最大荧光发射峰的强度，TCDs-Cu²⁺的混合溶液随pH值变化的曲线如图3的B所示。从图3的曲线A可以看出，当pH值在6.0到8.3之间，最大荧光发射峰强度几乎不变；当pH值从6.0降到2.1，其最大荧光发射峰强度逐渐递减；当pH从8.3增加到12.0，其最大荧光发射峰强度逐渐递减，说明TCDs作为荧光探针可有效地、准确地感应到pH值从2.1-6.0和8.3-12.0之间的变化；从曲线B可以看出，当pH从1.9增加到4.2，其最大荧光发射峰强度逐渐递增，当pH从4.2增加到7.3，其最大荧光发射峰强度显著下降，当pH值在7.3到12.0之间，最大荧光发射峰强度几乎不变，通过比较TCDs、TCDs-Cu²⁺的混合溶液的最大荧光发射峰强度随pH值变化曲线，发现TCDs在pH值大于7.3时，就能高灵敏、准确的检测溶液中Cu²⁺。

用本实施例1制备的TCDs为溶质，以pH＝7.3的Tirs缓冲水溶液为溶剂配制TCDs浓度为5.0μg/mL的TCDs溶液，向TCDs的Tirs缓冲水溶液中分别加入50μmoL/L Cu²⁺和其它常见的金属离子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)，在激发波长为380nm，测定了TCDs对不同金属离子的荧光响应；TCDs浓度为5.0μg/mL，Cu²⁺浓度为50μmoL/L，缓冲溶液的pH为7.3时，Cu²⁺与其它金属离子共存、其它金属离子浓度与Cu²⁺浓度相同的条件下，在激发波长380nm下，测定了其它金属离子对TCDs-Cu²⁺荧光光谱的影响。测试结果如图4所示，其中：纵坐标表示最大荧光发射峰的荧光强度值，横坐标表示金属离子种类。从图4可以看出，当pH＝7.3时，TCDs对不同金属离子的荧光响应。发现TCDs高选择性识别Cu²⁺，且大多数金属离子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)均不干扰TCDs-Cu²⁺混合溶液的荧光光谱。

将50μg本实施例1制备的TCDs溶解于10mL中性纯水中，并加入1mL，浓度为0.1mol/L的HEPES缓冲溶液，用NaOH调节溶液的pH＝7.3，此时TCDs的浓度为5.0μg/mL，HEPES浓度为0.01mol/L。之后再向该溶液中加入不同体积的0.05mol/L的Cu²⁺，在激发波长380nm下，测定Cu²⁺浓度在0-150μmol/L范围内，TCDs荧光光谱。得到的TCDs和不同浓度的Cu²⁺的混合溶液的荧光光谱图如图5所示，从图5可以看出，随着混合溶液中Cu²⁺浓度的增加，TCDs在470nm处的荧光峰强度逐渐减弱，从而可以实现TCDs对Cu²⁺的荧光检测。将Cu²⁺浓度对TCDs的最大荧光发射峰强度的变化绘制成曲线如图6所示，从图6的插图可知，Cu²⁺浓度在0-15μmol/L范围时，TCDs在470nm处的荧光强度与Cu²⁺浓度呈现出良好的线性关系(线性相关系数R²＝0.9984)，对空白样进行20次平行测定，按3σ/K(σ为空白样的标准偏差，K为线性方程的斜率)并计算出检出限为3.4nM，说明本发明的TCDs可以高灵敏的检测Cu²⁺。

用本实施例1制备的TCDs为溶质，以pH＝7.3的Tirs缓冲水溶液为溶剂配制TCDs浓度为5.0μg/mL的TCDs溶液，向TCDs的Tirs缓冲水溶液中分别加入50μmoL/L Cu²⁺和50μmoL/LGSH，再分别向上述溶液中加入不同的常见阴离子和氨基酸，且常见阴离子和氨基酸的浓度与GSH浓度相同，在激发波长380nm条件下，测定了不同常见阴离子和氨基酸对TCDs-Cu²⁺-GSH荧光光谱的影响。测试结果如图7所示，其中：纵坐标表示存在不同常见阴离子和氨基酸的最大荧光发射峰的荧光强度与仅存在GSH的最大荧光发射峰的荧光强度的比值，横坐标表示不同常见阴离子和氨基酸种类(序号分别代表：1、GSH、2、精氨酸+GSH、3、色氨酸+GSH、4亮氨酸+GSH、5、丝氨酸+GSH、6、苏氨酸+GSH、7、组氨酸+GSH、8、蛋氨酸+GSH、9、苯丙氨酸+GSH、10、半胱氨酸+GSH、11、谷氨酸+GSH、12、天冬氨酸+GSH、13、酪氨酸+GSH、14、焦磷酸根离子+GSH、15、S₂O₃ ^2-+GSH、16、Br^-+GSH、17、Cl^-+GSH、18、I^-+GSH、19、F^-+GSH、20、AC^-+GSH、21、CO₃ ^2-+GSH、22、NO₃ ^-+GSH、23、HCO₃ ^-+GSH、24、PO₄ ^3-+GSH、25、HPO₄ ^2-+GSH、26、H₂PO₄ ^-+GSH、27、SO₄ ^2-+GSH)。从图7可以看出，当pH＝7.3时，TCDs-Cu²⁺-GSH对不同常见阴离子和氨基酸的荧光响应。发现大多数常见阴离子和氨基酸金属离子均不干扰TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液的荧光光谱。

将本实施例1制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)用于检测谷胱甘肽，其步骤如下：

(1)将10μL浓度为0.05mol/L Cu²⁺水溶液加入到10mL浓度为5.0μg/mL的表面修饰的碳纳米点(TCDs)的pH＝7.3的Tris水溶液中，得到TCDs-Cu²⁺的混合溶液。(2)依次向(1)溶液中加入不同体积的浓度为25mmol/L的谷胱甘肽(GSH)，从而得到不同浓度的TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液，待溶液反应100s后，在激发波长为380nm的室温条件下，测定TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液的荧光光谱，并记录最大荧光发射峰的强度。由于所加入的GSH的水溶液体积非常小，可以忽略不计。TCDs-Cu²⁺混合溶液和不同浓度的GSH溶液的荧光光谱图如图8所示，当GSH加入到TCDs-Cu²⁺的中性Tris混合溶液后，发现随着谷胱甘肽的浓度逐渐增加，TCDs的最大发射峰的荧光强度逐渐增强。GSH浓度对TCDs-Cu²⁺混合溶液的最大荧光发射峰强度的影响曲线图如图9所示，由图9插图可知，GSH浓度在0-175μmol/L范围内，溶液的荧光强度和GSH浓度呈现良好的线性关系，其线性方程I'/I'₀＝1.0119[GSH]+0.3697([GSH]单位为10^{- 4}mol/L，线性相关系数R²＝0.9918)，公式中I'₀和I'分别为未加入和加入GSH时TCDs的最大发射峰的荧光强度，[GSH]为TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液中谷胱甘肽浓度，并计算出检出限为0.11μM，说明本发明的TCDs可以高选择的检测GSH。

将本实施例1制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)用于检测生命体中的Cu²⁺和谷胱甘肽，其步骤如下：

将酵母细胞在TCDs溶液(5.0μg/mL)中37℃下培养2h，然后用50μM Cu²⁺溶液在37℃下处理上述酵母细胞，并且卵化2h，之后进一步用250μM GSH处理TCDs-Cu²⁺处理过酵母细胞，再卵化2h，分别用荧光显微镜进行观察。图10是TCDs、TCDs-Cu²⁺混合溶液以及TCDs-Cu^{2 +}-GSH混合溶液在酵母细胞中的荧光成像图。图10A显示的是TCDs在酵母细胞中的荧光成像，呈现明亮的蓝色荧光；图10B为TCDs-Cu²⁺在酵母细胞的荧光成像，发现Cu²⁺的加入猝灭了酵母细胞内的荧光，图10C为TCDs-Cu²⁺-GSH在酵母细胞的荧光成像，发现GSH能使酵母细胞里的蓝色荧光得以恢复。由图10可知，本实施例制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)可以在生命体中交替检测Cu²⁺和谷胱甘肽(GSH)。

实施例2、本实施例2的表面修饰的碳纳米点的制备方法按以下步骤进行：

(1)向盛有30mL乙醇的圆底烧瓶中加入质量比为0.51克的碳纳米点(CDs)和2.55克三乙烯四胺，充分混合，得到混合物；其中所述的CDs的制备方法是：按尿素与柠檬酸按质量比为1:1的比例混合，然后放在微波炉中微波加热10min，用超纯水溶解固相物，离心、真空干燥，得到碳纳米点(CDs)，即富含碳的纳米颗粒；

(2)将混合物加热回流反应24h，得到粗产物；

(3)旋转蒸发粗产物，除去乙醇，用苯洗涤3次沉淀物，离心分离后，用超纯水溶解产物得到溶液，过滤；

(4)将滤液放置真空干燥箱120℃干燥24h，除去未反应的小分子，即得到表面修饰的碳纳米点(TCDs)。

对实施例2制备的表面修饰的碳纳米点进行表征，发现TCDs的红外透射光谱中出现了胺的特征峰，说明三乙烯四胺修饰在碳纳米点上。

将100μg本实施例制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)加入10mL乙醇中，调节至pH值7.0，再加入40μL，0.05moL/L的Cu²⁺水溶液，得到TCDs/Cu²⁺，再加入40μL，0.05moL/L的谷胱甘肽，得到TCDs/Cu²⁺+GSH，分别对TCDs、TCDs/Cu²⁺、TCDs/Cu²⁺+GSH溶液进行透射电镜(TEM)表征，表征结果显示TCDs的粒径大约为5nm左右，当TCDs溶液与Cu²⁺混合之后，形成的络合物TCDs/Cu²⁺的粒径变大，大约为25nm左右。而TCDs/Cu²⁺+GSH的电镜结果显示，其粒径恢复，直径为6nm左右。

用本实施例2制备的TCDs为溶质，以pH＝7.3的HEPES缓冲水溶液为溶剂配制TCDs浓度为10.0μg/mL的TCDs溶液，向TCDs的HEPES缓冲水溶液中分别加入50μmoL/L Cu²⁺和其它常见的金属离子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)，在激发波长为380nm，测定了TCDs对不同金属离子的荧光响应；TCDs浓度为10.0μg/mL，Cu²⁺浓度为50μmoL/L，缓冲溶液的pH为7.3时，Cu²⁺与其它金属离子共存、其它金属离子浓度是Cu²⁺浓度5倍的条件下，在激发波长380nm下，测定了其它金属离子对TCDs-Cu²⁺荧光光谱的影响。发现在HEPES缓冲溶液pH＝7.3时，TCDs对不同金属离子的荧光响应。发现TCDs高选择性识别Cu²⁺，且大多数金属离子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)均不干扰TCDs-Cu²⁺混合溶液的荧光光谱。

将100μg用本实施例2制备的TCDs溶解于10mL中性纯水中，并加入1mL，浓度为0.1mol/L的Tris缓冲溶液，用NaOH调节溶液的pH＝7.3，此时TCDs的浓度为10.0μg/mL，Tris浓度为0.01mol/L。之后再向该溶液中加入不同体积的0.05mol/L的Cu²⁺，在激发波长380nm下，测定Cu²⁺浓度在0-100μmol/L范围内，TCDs荧光光谱。发现随着混合溶液中Cu²⁺浓度的增加，TCDs在470nm处的荧光峰强度逐渐减弱，当Cu²⁺浓度在0-10μmol/L范围时，TCDs在470nm处的荧光强度与Cu²⁺浓度呈现出良好的线性关系(线性相关系数R²＝0.9992)，对空白样进行20次平行测定，按3σ/K(σ为空白样的标准偏差，K为线性方程的斜率)并计算出检出限为3.2nM，说明本发明的TCDs可以高灵敏的检测Cu²⁺。

用本实施例1制备的TCDs为溶质，以pH＝7.3的HEPES缓冲水溶液为溶剂配制TCDs浓度为10.0μg/mL的TCDs溶液，向TCDs的HEPES缓冲水溶液中分别加入100μmoL/L Cu²⁺和100μmoL/LGSH，再分别向上述溶液中加入不同的常见阴离子和氨基酸，且常见阴离子和氨基酸的浓度与GSH浓度相同，在激发波长380nm条件下，测定了不同常见阴离子和氨基酸对TCDs-Cu²⁺-GSH荧光光谱的影响。发现当pH＝7.3时，TCDs-Cu²⁺-GSH对不同常见阴离子和氨基酸的荧光响应。发现大多数常见阴离子和氨基酸金属离子均不干扰TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液的荧光光谱。

将本实施例2制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)用于检测谷胱甘肽，其步骤如下：

(1)将10μL浓度为0.05mol/L Cu²⁺水溶液加入到10mL浓度为10.0μg/mL的表面修饰的碳纳米点(TCDs)的pH＝7.3的HEPES水溶液中，得到TCDs-Cu²⁺的混合溶液。

(2)依次向(1)溶液中加入不同体积的浓度为25mmol/L的谷胱甘肽(GSH)，从而得到不同浓度的TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液，待溶液反应100s后，在激发波长为380nm的室温条件下，测定TCDs-Cu²⁺-GSH混合溶液的荧光光谱，并记录最大荧光发射峰的强度。

发现随着溶液中谷胱甘肽的浓度逐渐增加，TCDs的最大发射峰的荧光强度逐渐增强，且GSH浓度在0-150μmol/L范围内，溶液的荧光强度和GSH浓度呈现良好的线性关系，(线性相关系数R²＝0.9942)，并计算出检出限为0.09μM，说明本实施例2的TCDs可以高选择的检测GSH。

将本实施例2制备的表面修饰的碳纳米点(TCDs)用于检测生命体中的Cu²⁺和谷胱甘肽，其步骤如下：

将酵母细胞在TCDs溶液(10.0μg/mL)中37℃下培养2h，然后用100μM Cu²⁺溶液在37℃下处理上述酵母细胞，并且卵化2h，之后进一步用250μM GSH处理TCDs-Cu²⁺处理过酵母细胞，再卵化2h，分别用荧光显微镜进行观察。发现TCDs在酵母细胞中的荧光成像，呈现明亮的蓝色荧光；而加入Cu²⁺溶液卵化后的细胞的荧光显著猝灭；而进一步用GSH处理的酵母细胞，其酵母细胞里的蓝色荧光得以恢复。

Claims (9)

1.表面修饰的碳纳米点，其特征在于该碳纳米点是三乙烯四胺修饰的碳纳米点，粒径为3～5nm。

2.制备权利要求1所述的表面修饰的碳纳米点的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、按碳纳米点与三乙烯四胺的质量比为1:(0.1～10)将碳纳米点与三乙烯四胺加入到到乙醇中混合均匀，得到混合物；

二、将混合物加热回流反应5～48h，得到粗产物；

三、将粗产物旋转蒸发除去乙醇，再用苯洗涤粗产物1～5次，离心分离后，用超纯水溶解固相物，得到溶液，再将溶液过滤；将滤液真空干燥，即得到表面修饰的碳纳米点。

3.根据权利要求2所述的表面修饰的碳纳米点的制备方法，其特征在于步骤一中所述的碳纳米点是由尿素和柠檬酸按质量比1:(1～6)的比例混合，然后通过微波加热制备的一种富含碳的纳米颗粒。

4.根据权利要求2或3所述的表面修饰的碳纳米点的制备方法，其特征在于步骤一中碳纳米点与三乙烯四胺的质量比为1:1。

5.根据权利要求2或3所述的表面修饰的碳纳米点的制备方法，其特征在于步骤二中加热回流反应时间为24h。

6.权利要求1所述的表面修饰的碳纳米点的应用，其特征在于表面修饰的碳纳米点作为荧光探针检测二价铜离子和谷胱甘肽；其中铜离子和谷胱甘肽为水溶液中的铜离子和谷胱甘肽或生命体中的铜离子和谷胱甘肽。

7.根据权利要求6所述的表面修饰的碳纳米点的应用，其特征在于定性检测铜离子和谷胱甘肽的方法按以下步骤进行：

(1)将表面修饰的碳纳米点溶于超纯水中，形成TCDs水溶液，并测定溶液的荧光光谱；

(2)将上述的TCDs水溶液与待测水溶液Ⅰ混合，测定其荧光光谱，如果荧光强度显著减弱，则可以判定待测水溶液Ⅰ含有铜离子，形成了TCDs-Cu²⁺复合物；否则待测水溶液Ⅰ没有铜离子；

(3)将TCDs-Cu²⁺复合物的溶液与待测水溶液Ⅱ混合，测定其荧光光谱，如果荧光强度得以恢复，则可以判定待测水溶液Ⅱ含有谷胱甘肽，形成TCDs-Cu²⁺-GSH；否则待测水溶液Ⅱ中没有谷胱甘肽。

8.根据权利要求6所述的表面修饰的碳纳米点的应用，其特征在于定量检测水溶液中铜离子和谷胱甘肽的方法为标准曲线法，具体如下：

(1)配制不同浓度的含Cu²⁺的标准系列样品Ⅰ，分别加入表面修饰的碳纳米点溶液，并调节至pH值6.0～8.3之间，并测试溶液的荧光光谱，读出最大荧光发射峰的荧光强度值，以铜离子的浓度为横坐标、以最大荧光发射峰的荧光强度值为纵坐标作图，绘出标准曲线；

(2)用与标准样品Ⅰ相同的方法，测试待测溶液中加入表面修饰的碳纳米点溶液后的荧光光谱，根据最大荧光发射峰的荧光强度值在标准曲线上读出铜离子的浓度值；

(3)配制不同浓度的含谷胱甘肽的标准系列样品Ⅱ，分别加入TCDs-Cu²⁺混合溶液，并调节至pH值6.0～8.3之间，并测试溶液的荧光光谱，读出最大荧光发射峰的荧光强度值，以谷胱甘肽的浓度为横坐标、以最大荧光发射峰的荧光强度值为纵坐标作图，绘出标准曲线；

(4)用与标准样品Ⅱ相同的方法，测试待测溶液中加入TCDs-Cu²⁺混合溶液后的荧光光谱，根据最大荧光发射峰的荧光强度值在标准曲线上读出谷胱甘肽的浓度值。

9.根据权利要求6所述的表面修饰的碳纳米点的应用，其特征在于生命体中的铜离子和谷胱甘肽的检测方法，按以下步骤进行：

(1)将待测的生命体放置到含有表面修饰的碳纳米点水溶液中培养1～6h，然后用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(2)再把用TCDs培养后的生命体放入待测溶液Ⅰ中培养1～6h后，用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(3)进一步把TCDs-Cu²⁺培养后生命体放入待测溶液Ⅱ中培养1～6h后，再用荧光显微镜检测生命体的活细胞；

(4)如果在步骤(2)出现荧光强度显著减弱，则可以判定待测溶液Ⅰ含有铜离子；

(5)如果在步骤(3)出现荧光强度恢复，则可以判定待测水溶液Ⅱ中含有谷胱甘肽。