CN113736091A - 一种荧光微米探针检测槲皮素的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光微米探针检测槲皮素的方法和应用，以姜黄素为靶标、六氯环三磷腈为连接基团形成聚环三磷腈共姜黄素荧光微球，基于荧光微球与铝离子络合形成荧光微米探针，通过槲皮素与金属离子良好的配位能力，与荧光微米探针中铝离子结合释放荧光信号使体系荧光增强，实现对槲皮素的快速检测。本发明的荧光微米探针为聚磷腈超支化微米级荧光微米探针，通过构建“姜黄素‑金属离子‑槲皮素”微米级反应器提高复杂背景干扰下的荧光信号稳定性和传感性能，对槲皮素小分子的最低检测限为2.32×10^‑8mol/L，并实现1min内的快速响应，灵敏性高、抗干扰能力强、识别快速且检测结果准确。

Description

一种荧光微米探针检测槲皮素的方法和应用

技术领域

本发明涉及槲皮素检测技术，特别是一种荧光微米探针检测槲皮素的方法和应用。

背景技术

黄酮类化合物槲皮素(3′,3,4′,5,7–五羟基黄酮)，广泛存在于诸多中草药和日常食品中，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗癌症等作用。研究证明富含黄酮类的食品具有重要的生物学活性，通过增强多种酶的活性有益于人体细胞如抗炎、抗氧化、保肝、抗肿瘤和抗菌作用，还与降低某些癌症风险有关，检测槲皮素有利于评价食品化学中的营养质量和药理学中槲皮素的抗氧化活性。

现有技术中，检测槲皮素的方法有很多，如分光光度法、紫外吸收法、高效液相色谱和电化学方法等，荧光方法由于其快速简便的优点也受到关注，荧光探针可以通过制备价廉的试剂盒实现在复杂背景下的视觉识别，可用于槲皮素快速检测分析。近年来，出现基于小分子、纳米材料和聚合物等荧光探针可以实现对槲皮素的荧光检测。但是，大多数荧光探针响应时间慢和灵敏度差。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种荧光微米探针。

本发明的另一目的是提供上述荧光微米探针在检测槲皮素中的应用，响应时间快且灵敏度高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种荧光微球，以姜黄素(Cur)为靶标、六氯环三磷腈(HCCP)为连接基团，通过两者共聚合形成聚环三磷腈共姜黄素(PC)荧光微球。

优选地，所述荧光微球的粒径为0.5–2μm。

上述荧光微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)六氯环三磷腈与姜黄素按照摩尔比为1:1.5–5溶于有机溶剂；

(2)向上述混合物中加入三乙胺，且六氯环三磷腈与三乙胺的摩尔比为1:50–150，进行反应4–12小时，反应结束后经离心、过滤或抽滤收集沉淀，依次水洗和乙醇洗涤，干燥；

所述有机溶剂选自乙腈、甲苯、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种以上组合。

优选地，所述有机溶剂为乙腈。

优选地，步骤(1)中，六氯环三磷腈与姜黄素的摩尔比为1:2–4。

更优选地，步骤(1)中，六氯环三磷腈与姜黄素的摩尔比为1:3。

优选地，步骤(2)中，六氯环三磷腈与三乙胺的摩尔比为1:80–100。

更优选地，步骤(2)中，六氯环三磷腈与三乙胺的摩尔比为1:90。

一种荧光微米探针，含有质量比为1：1–2的上述荧光微球与铝离子，通过上述荧光微球溶解于乙醇溶液后与铝盐溶液混合得到。

优选地，所述荧光微米探针中荧光微球与铝离子的质量比为1:1.7。

一种用于检测槲皮素的试纸条，含有质量比为1：1–2的上述荧光微球与铝离子，其制备方法为：通过上述荧光微球溶解于乙醇溶液后与铝盐溶液混合，混合体系用乙醇稀释至所述荧光微球和铝离子的总量为2–10mg/mL，将空白试纸条在其中浸泡5–20分钟，取出干燥。

优选地，所述试纸条中荧光微球与铝离子的质量比为1:1.7。

本发明提供上述荧光微球、荧光微米探针或试纸条在检测槲皮素(Que)中的应用。

一种检测槲皮素的方法，步骤如下：

(1)将上述荧光微球溶解于乙醇溶液中后与铝盐溶液混合，再用乙醇溶液稀释至荧光微球的含量为50–100μg/ml，加入待测样品混合；

或者，将上述试纸条浸入待测样品后取出；

(2)以372nm为激发波长，测定510nm处的荧光发射强度进行定性或定量检测。

优选地，检测槲皮素的浓度线性范围为0-5×10^-5mol/L，最低检出限为2.32×10^{- 8}mol/L。

本发明中荧光微米探针识别槲皮素的机理为：由于槲皮素与金属离子良好的配位能力，槲皮素与荧光微米探针中的Al(III)结合形成PC-Al(III)-Que的三元体系，释放出荧光信号使体系荧光增强。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)相较于荧光淬灭型探针，本发明中荧光微米探针属于荧光增强型探针，用于槲皮素检测具有良好的专一性、抗干扰性和高的灵敏度，通过槲皮素与金属离子良好的配位能力释放出强烈的绿色荧光，体系荧光显著增强。

本发明的荧光微米探针为聚磷腈超支化微米级荧光微米探针，利用姜黄素作为荧光团，通过荧光团的羰基实现与金属离子的络合调节荧光变化，聚磷腈的超支化骨架有利于构建“姜黄素-金属离子-槲皮素”微米级反应器，提高复杂背景干扰下的荧光信号稳定性和传感性能，对槲皮素小分子的最低检测限为2.32×10^-8mol/L，并实现1min内的快速响应。

(3)本发明中的试纸条是一种可视化试纸条，使用方便，成本低廉，检测过程简便、抗干扰能力强、快速、灵敏，检测结果准确，对槲皮素的检测具有良好的选择性和灵敏性，可用于葡萄酒或饮料中槲皮素的快速检测。

附图说明

图1为实施例中荧光微米探针PC-Al(III)荧光选择性图，激发波长为372nm。

图2为实施例中荧光微米探针PC-Al(III)识别槲皮素的抗干扰性图，激发波长为372nm。

图3为实施例中光探针PC-Al(III)对槲皮素的响应时间图。

图4为实施例中荧光微米探针PC-Al(III)识别槲皮素的稳定性。

图5为实施例中荧光微米探针PC-Al(III)识别槲皮素的荧光滴定图，激发波长为372nm。

图6为实施例中荧光微米探针PC-Al(III)识别槲皮素的最低检测限图，激发波长为372nm。

图7为实施例中试纸条检测槲皮素的效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

制备荧光微米探针PC-Al(III)的过程中所使用的化学试剂、溶剂均购自探索公司，金属离子等均购自阿拉丁试剂公司，采用英国爱丁堡FS-5荧光分析仪记录荧光光谱。

实施例1荧光微球和荧光微米探针的制备

(一)荧光微球的制备

250mL圆底烧瓶中，将0.10g(0.30mmol)六氯环三磷腈(HCCP)和0.32g(0.90mmol)姜黄素溶于50mL乙腈中，待六氯环三磷腈和姜黄素完全溶解于乙腈溶液后，加入2mL三乙胺(约27mmol)，室温下搅拌8h。反应完全后，离心得到下层沉淀物，用乙醇和纯净水洗涤至上清液澄清为止。将所得到的沉淀物50℃真空干燥12h，得到粒径为0.5–2μm的淡黄色粉末即为荧光微球，技术路线为：

(二)荧光微米探针PC-Al(III)的制备

用乙醇溶液配制浓度为12mg/mL的PC溶液，用纯净水配制浓度为100mg/mL的Al(NO₃)₃·9H₂O水溶液(铝离子浓度为7mg/mL)，在2mL的乙醇溶液中加入10μL的PC溶液和10μL的Al(III)溶液，混合均匀，得到荧光微米探针PC-Al(III)。

(三)试纸条的制备

配制10mg/ml的槲皮素乙醇溶液，先加入2mL乙醇溶液稀释至0.5mg/mL，再加入相当于PC质量浓度1.7倍的铝离子溶液配成PC-Al(III)探针溶液。然后从普通滤纸上切下合适大小的测试条，将其浸入到PC-Al(III)乙醇悬浮液中10分钟，取出试纸条，直到在室温下完全干燥。

实施例2荧光专一选择性测试

配制12mg/mL的PC的乙醇溶液和100mg/ml的Al(III)水溶液，在比色皿中加入2mL的乙醇溶液、10μL的PC溶液以及10μL的Al(III)水溶液，用荧光光谱仪考察荧光微米探针PC-Al(III)对槲皮素小分子的选择性。

结果如图1所示，在372nm处激发条件下，单独的荧光微米探针PC-Al(III)在乙醇溶液中在510nm处具有微弱的荧光发射强度，当加入槲皮素后，在510nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它物质时，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化，表明荧光微米探针PC-Al(III)对槲皮素在乙醇溶液中具有较好的荧光专一选择性。

实施例3抗干扰性测试

配制12mg/mL的PC的乙醇溶液和100mg/mL的Al(III)水溶液，在26个干净的荧光比色皿中，分别加入2mL的乙醇溶液和10μL的PC溶液和10μL的Al(III)溶液，再分别加入10μM的槲皮素和100μM的其他分析物，如：

其它类小分子：半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、葡萄糖(Glu)、抗坏血酸(AA)、单宁(Tannin)、儿茶酚(Catechol)、芦丁(Rutin)、大豆素(Daidzein)、黄芩素(Baicalein)；

阳离子：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺,Zn²⁺、Cd²⁺、Sn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺；

阴离子：Cl^-、ACO^-、H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、CO₃ ^2-、SO₄ ^2-。

在荧光光谱仪上检测，绘制不同分析物对应的最高荧光强度的柱状图，得到荧光发射柱状图，如图2所示，证明荧光微米探针PC-Al(III)对槲皮素在乙醇溶液中的识别不受上述其他分析物的干扰，具有较好的抗干扰性。

实施例4响应时间测试

配制12mg/mL的PC的乙醇溶液和100mg/mL的Al(III)水溶液，在比色皿中加入2mL的乙醇溶液，10μL的PC溶液以及10μL的Al(III)溶液，用荧光光谱仪检测探针PC-Al(III)对槲皮素小分子的响应时间，可以在1min内实现对槲皮素的检测，如图3所示，证明荧光微米探针PC-Al(III)对槲皮素能够快速响应，可以在乙醇溶液中实现对槲皮素的快速检测。

实施例5稳定性测试

配制12mg/mL的PC的乙醇溶液和100mg/mL的Al(III)水溶液，在比色皿中加入2mL的乙醇溶液、10μL的PC溶液以及10μL的Al(III)溶液并保持在0–120min内测定其对槲皮素的检测效果，如图4所示，荧光探针PC-Al(III)的荧光和荧光微米探针PC-Al(III)对Que检测的荧光强度在2h内几乎没有变化，结果表明荧光微米探针PC-Al(III)在乙醇溶液体系中表现出良好的稳定性。

实施例6线性回归方程

配制12mg/mL的PC的乙醇溶液、100mg/mL的Al(III)水溶液和2mmol/L浓度的槲皮素溶液，将2mL的乙醇溶液、10μL的PC和10μL的Al(III)水溶液加到干净的荧光比色皿中，逐渐加入槲皮素溶液的体积分别为0、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL同时以372nm为激发波长，在荧光光谱仪上测定510nm处的荧光发射强度，以槲皮素的浓度为横坐标，以510nm处的荧光强度为纵坐标，得到槲皮素浓度的工作曲线，线性回归方程为：F_510nm＝7.5×10¹⁰C，C的单位为mol/L，如图5所示。

实施例7最低检出限实验

配制12mg/mL的PC的乙醇溶液和100mg/ml的Al(III)水溶液，将2mL的乙醇溶液、10μL的PC和10μL的Al(III)水溶液加到干净的荧光比色皿中，测定其对不同浓度的槲皮素的响应强度，随着槲皮素浓度的增加，体系荧光发射强度在510nm处不断增强，发现溶液荧光发射强度在槲皮素浓度线性范围为0-5×10^-5mol/L(R²＝0.997)，经计算(3σ/k)得出该探针分子对槲皮素的检出限为2.32×10^-8mol/L(见图6)，表明该荧光微米探针PC-Al(III)可用于葡萄酒等饮料中槲皮素的检测。

实施例8试纸条实验

配制0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM等浓度梯度的槲皮素溶液，将实施例1制备的测试条浸入上述溶液中1min，然后取出，在室温下干燥，在365nm荧光下观察不同浓度的槲皮素引起的试纸条荧光变化，如图7所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光微球，其特征在于，是姜黄素与六氯环三磷腈形成的共聚物。

2.根据权利要求1所述的荧光微球，其特征在于，粒径为0.5–2μm。

3.权利要求1或2所述荧光微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)环三磷腈和姜黄素溶于有机溶剂；

(2)加入三乙胺，反应4–12小时。

4.权利要求3所述荧光微球的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中，六氯环三磷腈与姜黄素的摩尔比为1:1.5–5；

步骤(2)中，六氯环三磷腈与三乙胺的摩尔比为1:50–150。

5.一种荧光微米探针，为权利要求1或2所述荧光微球与铝离子的混合物。

6.权利要求5所述荧光微米探针的制备方法，其特征在于，步骤包括：将权利要求1或2所述的荧光微球溶解于乙醇溶液，再与铝盐溶液混合得到。

7.一种试纸条，含有权利要求1或2所述的荧光微球与铝离子。

8.权利要求1或2所述荧光微球、权利要求5所述荧光微米探针或者权利要求7所述试纸条在检测槲皮素方面的应用。

9.一种检测槲皮素的方法，其特征在于，步骤包括：

(a)将权利要求1或2所述荧光微球溶解于乙醇溶液中，再与铝盐溶液混合，加入待测样品混合；

或者，将权利要求7所述试纸条浸入待测样品后取出；

(b)以372nm为激发波长，测定510nm处的荧光发射强度，进行定性或定量检测。

10.根据权利要求9所述检测槲皮素的方法，其特征在于，步骤(a)的混合体系中，荧光微球与铝离子的质量比为1:1–2。

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