CN113720794A - 基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，向金纳米粒子水溶液中加入真菌毒素适配体水溶液，进行孵育，然后加入待测样品溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算这两者的紫外吸收值的比值A620 nm/A520 nm，通过溶液颜色变化或者A620 nm/A520 nm值对样品中真菌毒素进行定性或定量检测，所述真菌毒素优选为赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1。本发明方法简单、快速、现象直观，降低了检测成本，提高了检测的效率，可应用于赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的现场快速检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中多种真菌毒素（赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1）的方法，属于生物毒素检测技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是毒性最强的真菌毒素之一，
具有极强的致癌性、致畸性、致突变性的真菌毒素，广泛分布于自然界，其中以黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性最强，会导致急性癌症、肝损伤和肝硬化。赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素，它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素，赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A (OTA），在霉变谷物、饲料等中最常见。
目前检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的方法有液相色谱法、气相色谱法、质谱法和毛细管电泳法、基于抗原抗体反应的免疫学方法等，这些方法可以获得准确和灵敏的结果，但需要繁琐的样品预处理和训练有素的人员。此外，昂贵和复杂的仪器也限制了这些方法在快速检测中的应用。金纳米颗粒（AuNPs）具有特殊的光学特性，在最大吸收波长处具有局部表面等离子体共振（LSPR）效应，在电解质溶液（高浓度NaCl）中能引起相应颜色变化，因此，在比色检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1方面有相关的报道。
CN107991293A公开了一种用于黄曲霉毒素B1的可视化检测方法，将疏基化黄曲霉毒素B1适配体DNA1和疏基化适配体的互补链DNA2分别与纳米金连接形成适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针，利用竞争法：当待测物中含有靶标时，靶标与适配体结合，适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈游离状态，在高盐浓度下，纳米金易发生聚集，颜色由红色变蓝色；当待测物中不含靶标时，在高盐浓度下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色；随着靶标浓度增大，纳米金颜色由红色渐变为蓝色，通过测定溶液在200～800 nm的紫外-可见光谱，即可实现对待测物中黄曲霉毒素B1的定量检测。该方法虽然取得了良好的检测结果，但这种方法构建适配体比色传感器步骤较为复杂，需要互补探针的参与。
曾宪冬等报道了一种基于核酸适配体-金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素 A的方法（曾宪冬, 曾灼祥, 陈兴会. 基于核酸适配体-金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A[J]. 食品安全导刊, 2018.），该研究基于核酸适配体作为生物识别元件，金纳米粒子作为比色探针，建立了一种适用于 OTA 检测的比色适配体传感器。该方法通过两条末端巯基化且与 OTA 核酸适配体部分互补的DNA链对金纳米粒子进行功能化处理，OTA 核酸适配体链作为连接链，与两条部分互补链杂交，使功能化的金纳米粒子发生聚集，当溶液中加入 OTA 时，OTA与核酸适配体的结合使其 DNA 构象发生改变，从而造成适配体链与互补的 DNA 链发生解链，团聚的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中，颜色由蓝紫色变成红色。该方法检测的灵敏度还需进一步提升。
CN107723347A公开了一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，该方法借助于赭曲霉毒素A适配体特异性识别赭曲霉毒素A分子，从而使得与适配体部分碱基互补的DNA分子解离下来，以解离下的DNA分子为模板，并以与模板互补的金纳米粒子修饰的两种DNA分子和与模板序列相同的两种DNA分子为探针，通过连接酶链式反应进行扩增，在不同浓度赭曲霉毒素A的条件下，随着赭曲霉毒素A浓度的增加，解离下的用于连接酶链式反应的模板DNA分子越多，则DNA探针修饰的金纳米粒子的组装程度越大，金纳米粒子颜色越深，根据赭曲霉毒素A的浓度与紫外吸收比值A620/A520的对应关系，从而对赭曲霉毒素A的含量进行检测。该方法虽然取得了良好的检测结果，但这种方法构建适配体比色传感器步骤复杂，需要扩增过程，花费时间长，限制了其现场应用。
发明内容
针对现今检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的适配体比色方法存在的不足，本发明提供了一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，尤其是检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的方法，该方法无需对检测的样品进行复杂的前处理，不需要借助复杂大型的仪器，核酸适配体无需标记，只需把合成好的适配体直接与纳米金吸附结合，然后加入待测样品和高浓度的盐，孵育后即可检测，操作简单。本方法可以应用于现场快速筛查，检测结果灵敏度高、检测限低，且现象直观，既可以通过颜色的变化进行定性的检测，又可以进行定量的检测，不需要专业的仪器操作人员，降低了检测成本，提高了检测的效率，可实现对OTA和AFB1的快速检测。
本发明具体技术方案如下：
一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：
（1）向金纳米粒子（AuNPs）水溶液中加入真菌毒素的适配体水溶液，进行孵育，然后分别加入不同浓度的真菌毒素溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算紫外吸收值的比值A620 nm/A520 nm；
（2）以真菌毒素浓度为横坐标，以对应的A620 nm/A520 nm为纵坐标，绘制标准曲线；
（3）将待测的大米样品粉碎，用甲醇进行萃取，然后离心取上清液，将上清液用甲醇稀释，得待检样品溶液；
（4）按照步骤（1）的方式，将真菌毒素溶液替换为待检样品溶液，向金纳米粒子（AuNPs）水溶液中加入真菌毒素的适配体水溶液，进行孵育，然后加入待检样品溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520nm处的紫外吸收值，计算紫外吸收值的比值A620 nm/A520 nm；
（5）将待检样品的A620 nm/A520 nm比值带入标准曲线，计算得到待检样品中真菌毒素的含量。
进一步的，所述真菌毒素优选为赭曲霉毒素A（OTA）或黄曲霉毒素B1（AFB1）。不同的真菌毒素在检测时选择与之相适应的适配体。
进一步的，步骤（1）和（4）中，当真菌毒素为赭曲霉毒素A时，赭曲霉毒素A的适配体为5’端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5’SH-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’，如SEQ ID NO：1所示；当真菌毒素为黄曲霉毒素B1时，黄曲霉毒素B1的适配体为5’端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5’ SH-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’，如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，步骤（1）和（4）中，金纳米粒子溶液中，金纳米粒子的粒径为15-25 nm，金纳米粒子的浓度为0.2-0.25 mM（mmol/L）。所述金纳米粒子可以采用现有技术中公开的各种方法进行制备，只要粒径符合要求即可。
在本发明某一具体实施方式中，公开了一种金纳米粒子的制备方法，如下：
取浓度0.01-0.1wt% 的HAuCl4水溶液，将其在搅拌下煮沸，然后加入1-5wt%的柠檬酸钠水溶液，当溶液由紫色变成红色后，再煮沸15-20 min，冷却至室温，过滤，得到金纳米粒子水溶液。该方法所得金纳米粒子的粒径为18.56 ± 6.124 nm。
进一步的，步骤（1）和（4）中，当真菌毒素为赭曲霉毒素A时，赭曲霉毒素A的适配体在金纳米粒子水溶液中的浓度为0.65-0.75 μM（μmol/L）；当真菌毒素为黄曲霉毒素B1时，黄曲霉毒素B1适配体在金纳米粒子水溶液中的浓度为0.28-0.3 μM（μmol/L）。
进一步的，步骤（1）和（4）中，在加入氯化钠后的溶液体系中氯化钠的浓度为25-34mM（mmol/L）。
进一步的，步骤（1）和（4）中，每次孵育时，均在室温下以200-250 rpm的速度孵育20-30 min。
进一步的，步骤（3）中，将待测的大米样品粉碎，取0.5-1.0 g加入1.5-2 mL甲醇，室温震荡混匀10-15 min，超声萃取10-15 min，然后离心收集上清液，将上清液用甲醇稀释10-20倍，作为待检样品溶液待用。
进一步的，步骤（4）中，当真菌毒素为赭曲霉毒素A时，当观察到颜色由红色变为蓝色，则表示样品中含有赭曲霉毒素A。同样，当真菌毒素为黄曲霉毒素B1时，当观察到颜色由红色变为蓝色，表示样品中含有黄曲霉毒素B1。
本发明实验原理为：本发明以巯基修饰的OTA和AFB1适配体作为单链寡核苷酸分子，能够与金纳米粒子高效结合，且在NaCl溶液中保持胶体的稳定性，溶液颜色不发生变化，为红色；当待测物中存在靶标时，适配体与靶标结合，适配体脱离AuNPs，加NaCl后导致AuNPs聚集，溶液颜色由红色变成蓝色，发生明显的表面等离子体共振偏移；当待测物中没有靶标时，适配体吸附在AuNPs上，防止其聚集。在检索过程中，当样品中含有OTA或AFB1时，肉眼可以看出这一过程中溶液颜色的变化，通过此体系的颜色变化可以直观可视化的实现定性分析，通过紫外分光光度计测定吸光度可以实现定量分析。本发明方法具有一定的可推广性，对于其他的真菌毒素，可以采用相同的思路替换成相应的适配体进行检测。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明方法简单、快速、现象直观，无需对检测的样品进行复杂的前处理，核酸适配体无需标记，不需要借助复杂大型的仪器，不需要专业的仪器操作人员，降低了检测成本，提高了检测的效率，可应用于赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1等真菌毒素的现场快速检测分析。
2、本发明与传统的高效液相色谱法和质谱联用法相比，成本低、时间短、操作简单，解决了传统仪器检测方法设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品筛选的不足。
3、本发明与免疫学方法相比，检测限更低、检测更为准确，不会产生假阳性等干扰结果。
4、本发明与现有的生物传感器相比，直接将核酸适配体溶液与金纳米粒子溶液混合，通过氯化钠的加入能够简单、快速的得到检测结果，操作简单，具有较高的稳定性和重现性，选取合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点的核酸适配体作为主要的识别元件，提升了比色分析方法的灵敏度和选择性。
5、本发明方法为其他真菌毒素的检测提供了一种新的思路，在本发明方法上进行改进，可以实现其他真菌毒素的检测。
附图说明
图1不同NaCl浓度下的紫外吸收光谱图（a）和A620 nm/A520 nm曲线（b）。
图2 不同浓度OTA适配体和AFB1适配体的紫外吸收光谱图，其中a. OTA适配体，d.AFB1适配体。
图3 OTA和AFB1标准曲线图，a. OTA，b. AFB1。
图4 OTA和AFB1特异性实验结果图，a. OTA，b. AFB1。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
下述实施例中，所用的适配体为5’端巯基化的适配体，其中，OTA适配体的核苷酸序列为5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’，AFB1适配体的核苷酸序列为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’，均委托上海生工生物工程有限公司合成。
下述实施例中，适配体溶液是将OTA和AFB1适配体分别溶于水中配置而得。
实施例1
1）制备Au纳米粒子
将锥形瓶和磁珠用王水浸泡两天两夜，然后用超纯水清洗干净并烘干。取HAuCl40.01wt% 50 mL，在搅拌下煮沸，快速加入1 mL 1wt%柠檬酸钠水溶液，当溶液由紫色变成红色后，再煮沸15 min，冷却至室温，然后用0.22 µm过滤膜过滤，即为金纳米粒子（AuNPs）溶液，金纳米粒子的浓度为0.23 mM，金纳米粒子的粒径为18.56 ± 6.124 nm，置于4℃冰箱中避光保存备用。
）优化NaCl浓度
取100 μL AuNPs溶液于96孔透明微孔板中，加入20 μL各种浓度的NaCl溶液，以使微孔板中分别达到最终NaCl浓度为8.33 mM、16.66 mM、25.00 mM、33.33 mM、41.66 mM、50.00 mM。室温下以240 rpm的速度孵育20 min，观察溶液颜色变化，并在350-850 nm波长范围内测定吸光度值。蒸馏水用作阴性对照。
不同氯化钠浓度下所得光谱图如图1a所示。从图中可以看出，随着NaCl的加入，520 nm处的紫外强度降低，620 nm处的强度升高。肉眼可见，随着氯化钠浓度的升高，溶液颜色从红色到蓝色进行变化，当氯化钠浓度达到33.33 mM时，AuNPs的颜色立即转变，在高于33.33mM的NaCl溶液中，金纳米粒子的强烈沉淀使得比色传感器难以用肉眼区分颜色变化。从图1b看，在氯化钠浓度25-33.33 mM范围内时，A620 nm/A520 nm的比值较大，具有很大的区别。综合而言，选择氯化钠的浓度为25-34 mM，最佳浓度为33.33 mM。
）优化OTA和AFB1适配体浓度
取100 μL AuNPs溶液于96孔透明微孔板中，分别加入20 μL各种浓度的OTA和AFB1适配体溶液，以使微孔板中分别达到最终OTA适配体浓度为0.028 μM、0.14 μM、0.28 μM、0.71 μM；AFB1适配体浓度为0.071μM、0.142 μM、0.214 μM、0.286 μM。室温下，以240 rpm的速度孵育20 min，观察溶液颜色变化，350-850 nm波长范围内测定吸光度值。随后，在每个孔中加入20 μL NaCl溶液，使孔中氯化钠最终浓度均为33.33 mM，室温下以240 rpm的速度孵育20 min，首先观察溶液颜色变化，然后在350-850 nm波长范围内测定吸光度值。蒸馏水用作阴性对照。
如图2a为OTA的实验结果图，从图中可以看出，随着OTA适配体浓度的增加，溶液的颜色和吸收光谱与仅AuNPs的越相近，因此，优选0.71 μM适配体作为最优适配体浓度来构建适配体比色传感器。
如图2d为AFB1的实验结果图，从图中可以看出，随着AFB1适配体浓度的增加，溶液的颜色和吸收光谱与仅AuNPs的越相近，因此，优选0.286 μM适配体作为最优适配体浓度来构建适配体比色传感器。
）最优检测条件的确定
根据步骤2）、3）的实验结果，确定了本发明最佳检测条件：100 μL AuNPs溶液，加入20 μL OTA适配体溶液或AFB1适配体溶液，使OTA适配体浓度达到0.71 μM，AFB1适配体浓度达到0.286 μM，室温下以240 rpm的速度孵育20 min，得到OTA或AFB1适配体比色传感器。在每个孔中加入10 μL OTA或AFB1溶液，孵育20 min。再加入20 μL NaCl溶液，使NaCl的终浓度为 33.33 mM，孵育20 min，观察溶液颜色变化，测定620 nm和520 nm的紫外吸收值，然后得到A620 nm/A520 nm的比值。
）灵敏性分析
按照上述确定的最佳检测条件，在每个孔中加入100 μL AuNPs溶液，加入20 μLOTA适配体溶液或AFB1适配体溶液，使OTA适配体浓度达到0.71 μM，AFB1适配体浓度达到0.286 μM，室温下以240 rpm的速度孵育20 min，再在每个孔中加入10 μL不同浓度的OTA溶液，使OTA终浓度为0.066-666.66 pg/mL，孵育20 min，再加入20 μL NaCl溶液，使氯化钠的终浓度为 33.33 mM，孵育20 min，测定620 nm和520 nm的紫外吸收值，然后得到A620 nm/A520 nm的比值，以OTA或AFB1浓度为横坐标，以A620 nm/A520 nm的比值为纵坐标做标准曲线，结果如图3所示。
如图3a所示为OTA-A620 nm/A520 nm的标准曲线，反应体系的颜色从红色变为浅蓝色，A620 nm/A520 nm值与OTA浓度的对数呈线性比例，线性方程y = 0.047LogCOTA + 0.6959，相关系数R2 = 0.9967。根据三倍空白标准偏差除以标曲的斜率计算出OTA检测限为 0.015 ng/mL 。
如图3b所示为AFB1-A620 nm/A520 nm的标准曲线，反应体系的颜色从红色变为蓝色，将A620 nm/A520 nm的值和AFB1的浓度值进行拟合，得到回归方程y= 0.023LogC AFB1 + 0.6069，R2 = 0.9966。根据三倍空白标准偏差除以标曲的斜率计算出AFB1检测限为 0.125 ng /mL 。
）特异性验证
将赭曲霉毒素A（OTA）、赭曲霉毒素B（OTB）、赭曲霉毒素C（OTC）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）生物毒素作为对照目标分子，验证此方法的特异性。
按照上述步骤（5）的方法，将OTA或AFB1溶液换成66.66 pg/mL的上述6种生物毒素的溶液，结果如图4所示。如图4(a)所示，当加入的是OTA适配体时，除了含有OTA的溶液产生可辨别为蓝色的颜色变化外，其他几种生物毒素均未引起金纳米粒子发生明显的颜色变化，且仅含有OTA的溶液的A620 nm/A520 nm值产生了明显的变化，其他生物毒素的A620 nm/A520 nm值均无明显变化。如图4(b)所示，当加入的是AFB1适配体时，含有AFB1的溶液颜色变化十分明显，呈现蓝色，其他几种生物毒素的溶液颜色仅有微变，且含有AFB1的溶液的A620 nm/A520 nm值远高于其他生物毒素的A620 nm/A520 nm值。结果表明，本发明基于适配体的比色传感器对OTA和AFB1表现出优异的选择性。
）加标回收实验
样品提取：称取0.500 g 粉碎的大米样品，加入1.5 mL甲醇溶液，室温震荡混匀15min，超声萃取15 min，4℃ 10000 rpm离心15 min，收集上清液，用0.45 um过滤膜过滤，提取液用甲醇稀释10倍，作为待检样品溶液待用。
在阴性提取样本大米中分别添加不同浓度的赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1，测定添加回收结果，具体如下表1所示：
结果显示，OTA的回收范围在95%-102% 之间，AFB1的回收范围在94%-103% 之间，都具有良好的样品回收率，此方法可以用于实际样本中OTA和AFB1的检测。
序列表
<110> 海南大学
<120> 基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
Claims (10)
1.一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，其特征是，所述真菌毒素为包括以下步骤：
（1）向金纳米粒子水溶液中加入真菌毒素的适配体水溶液，进行孵育，然后分别加入不同浓度的真菌毒素溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算紫外吸收值的比值A620 nm/A520 nm；
（2）以真菌毒素浓度为横坐标，以对应的A620 nm/A520 nm为纵坐标，绘制标准曲线；
（3）将待测的大米样品粉碎，用甲醇进行萃取，然后离心取上清液，将上清液用甲醇稀释，得待检样品溶液；
（4）按照步骤（1）的方式，将真菌毒素溶液替换为待检样品溶液，观察溶液颜色的变化，测定620 nm和520 nm处的紫外吸收值，得到待检样品的A620 nm/A520 nm比值；
（5）将待检样品的A620 nm/A520 nm比值带入标准曲线，计算得到待检样品中真菌毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述真菌毒素包括赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：赭曲霉毒素A的适配体为5’端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5’ SH-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；黄曲霉毒素B1核苷酸序列为5’端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5’ SH-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征是：步骤（1）和（4）中，赭曲霉毒素A的适配体在金纳米粒子水溶液中的浓度为0.65-0.75 μM；黄曲霉毒素B1适配体在金纳米粒子水溶液中的浓度为0.28-0.3 μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）和（4）中，金纳米粒子的粒径为15-25nm，金纳米粒子的浓度为0.2-0.25 mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）和（4）中，氯化钠在加入氯化钠后的溶液体系中的浓度为25-34 mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）和（4）中，每次孵育时，均在室温下以200-250 r/min的速度孵育20-30min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（3）中，将待测的大米样品粉碎，取0.5-1.0 g加入1.5-2 mL甲醇，室温震荡混匀10-15 min，超声萃取10-15 min，然后离心收集上清液，将上清液用甲醇稀释10-20倍，作为待检样品溶液待用。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征是：步骤（4）中，若观察到溶液颜色由红色变为蓝色，则表示样品中含有赭曲霉毒素A或黄曲霉毒素B1。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）中，金纳米粒子水溶液的制备方法为：取浓度0.01-0.1wt% 的HAuCl4水溶液，将其在搅拌下煮沸，然后加入1-5wt%的柠檬酸钠水溶液，当溶液由紫色变成红色后，再煮沸15-20 min，冷却至室温，过滤，得到金纳米粒子水溶液。
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