CN113092440B - 一种基于中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP的食源性致病菌的核酸检测方法 - Google Patents

一种基于中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP的食源性致病菌的核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs‑ATP，涉及光化学分析技术与生物检测领域；本发明还公开一种基于品红亚硫酸试剂与SERS的核酸定性和/或定量检测传感器，通过纳米可控自组装制备中空金银核壳纳米雪花SERS纳米探针，与化学计量学方法和比色法结合构建稳态核酸可视化和精准定量模型，建立了通用的核酸检测方法，实现了各种核酸的便携性、高灵敏和特异性检测。

Description

一种基于中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP 的食源性致病菌的核酸检测方法
技术领域
本发明涉及光化学分析技术与生物检测领域，特别是涉及一种中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP。
背景技术
表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，简称 SERS)，是指在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中,在激发区域内,由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射(NRS)信号大大增强的现象。SERS克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点，可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息, 被广泛用于表面研究、吸附界面表面状态研究、生物大小分子的界面取向及构型、构象研究、结构分析等,可以有效分析化合物在界面的吸附取向、吸附态的变化、界面信息等。目前,SERS己被广泛应用于材料、化工、石油、高分子、生物、环保、地质等领域。
SERS探针通常是指以金属纳米粒子为载体，同时修饰具有SERS 活性的分子和具有特异性识别的功能的分子(如抗体、DNA等)的复合型纳米粒子。因其可以同时综合利用表面增强拉曼光谱的优势以及贵金属纳米粒子的特性而在检测分析领域有特殊应用价值，从而备受科学家们关注，也得到了广泛的发展与应用。
核酸是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，是生命的最基本物质之一。核酸的检测广泛应用于各个方面，例如早期肿瘤核酸标志物检测、刑侦工作中的快速鉴定、食品安全的快速检测、环境中细菌和病毒的快速监测、疫苗安全性检测、血液传染病的筛查等，因此建立通用的核酸快速检测方法具有非常重要的意义，而目前通用的、高灵敏度的核酸快速检测方法还未见报道。
因此，亟待开发一种通用的、高灵敏度的核酸快速检测方法，满足各种核酸的实时快速检测要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种中空金银核壳纳米花SERS纳米探针 HAu/AgSNFs-ATP，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP，所述中空金银核壳纳米花SERS纳米探针 HAu/AgSNFs-ATP的制备方法为：
(1)HAu/AgSNFs制备：在H3NO溶液和NaOH溶液的混合体系下加入AgNO3溶液，然后加入一定量的HAuCl4溶液和C6H5Na3O7溶液反应得到HAu/AgSNFs水溶液；
(2)HAu/AgSNFs的功能化修饰：在步骤(1)得到的HAu/AgSNFs 水溶液中与C6H7NS醇水混合溶液混合，反应后离心、清洗，得到所述中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP。
本发明还提供一种基于SERS的核酸定性和/或定量的检测传感器，所述核酸定性和/或定量检测传感器包括负载有所述的中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP的检测区。
进一步的，所述核酸定性和/或定量检测传感器还包括负载有聚多巴胺的样品预处理区和负载有扩增体系的扩增区。
本发明还提供一种根据所述的基于SERS的核酸定性和/或定量检测传感器的使用方法，所述使用方法为：
(1)将已知的不同浓度核酸的酸水解产物分别置于所述定量 SERS检测区后，对所述定量SERS检测区进行SERS光谱采集得到SERS 信号，用化学计量学方法来建立预测模型；
(2)将待测样品的酸水解产物置于所述定量SERS检测区后，对所述定量SERS检测区进行SERS光谱采集得到SERS信号；
(3)根据标准SERS图谱对待测样品中的核酸进行定性；根据预测模型对待测样品中的核酸进行定量。
本发明还提供一种基于品红亚硫酸试剂与SERS的核酸定性和/ 或定量检测传感器，所述核酸定性和/或定量检测传感器包括定性显色检测区和定量和/或定性SERS检测区，其中，定性显色检测区负载有品红亚硫酸试剂，定量和/或定性SERS检测区负载有所述的中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP。
进一步的，所述核酸定性和/或定量检测传感器还包括负载有聚多巴胺的样品预处理区和负载有扩增体系的扩增区。
本发明还提供一种根据所述的基于品红亚硫酸试剂和SERS的核酸定性和/或定量检测传感器的使用方法，所述使用方法为：
(1)将已知的不同浓度核酸的酸水解产物分别置于所述定性和/ 或定量SERS检测区后，对所述定性和/或定量SERS检测区进行SERS 光谱采集得到SERS信号，用化学计量学方法来建立预测模型；
(2)将待测样品的酸水解产物置于所述定性和/或定量SERS检测区后，对所述定性和/或定量SERS检测区进行SERS光谱采集得到 SERS信号；
(3)将待测样品的酸水解产物置于所述定性显色检测区后获得可视化信号；
(3)结果判定：
根据所述可视化信号对所述待测样品进行定性，所述可视化信号具体为：a、当定性显色检测区不显示颜色，表示检测结果为阴性；b、当定性显色检测区显示紫色，表示检测结果为阳性；
根据步骤(1)获得的标准SERS图谱对所述待测样品中的核酸进行定性；根据步骤(1)获得的预测模型对所述待测样品中的核酸进行定量。
本发明还提供一种根据所述的纳米探针HAu/AgSNFs-ATP或所述的基于SERS的核酸定性和/或定量的检测传感器或所述的基于品红亚硫酸试剂和SERS的核酸定性和/或定量检测传感器在定性和/或定量检测核酸中的应用。
本发明还提供一种根据所述的纳米探针HAu/AgSNFs-ATP或所述的基于SERS的核酸定性和/或定量的检测传感器或所述的基于品红亚硫酸试剂和SERS的核酸定性和/或定量检测传感器在制备定性和/ 或定量检测核酸的产品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：本发明提出了一种基于纸基SERS 传感的通用核酸快速检测方法，具体为本发明制备了一种中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP，可与核酸酸水解产物发生加成反应，生成新的官能团，与化学计量学方法和比色法结合构建稳态特异性致病菌可视化和精准定量模型，因此本发明建立的通用的核酸检测方法，实现了各种核酸的便携性、高灵敏和特异性检测，能够满足现场化检测需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同AgNO3浓度下制备的HAu/AgSNFs的透射电镜图，其中， A为0.1M AgNO3制备的HAu/AgSNFs，B为0.3M AgNO3制备的HAu/AgSNFs， C为0.5M AgNO3制备的HAu/AgSNFs，D为0.7M AgNO3制备的HAu/AgSNFs；
图2为不同AgNO3浓度下制备的HAu/AgSNFs-ATP的SERS图谱；
图3为纸基SERS/比色传感快速检测方法的流程示意图；
图4为金黄色葡萄球菌的PLS定量模型；
图5为大肠杆菌的PLS定量模型；
图6为沙门氏菌的PLS定量模型。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP的制备以及纸基SERS 传感快速检测方法的建立
步骤一，HAu/AgSNFs制备：在1mL H3NO溶液(1×10-2-6×10-2M) 和1mL NaOH溶液(0.01-0.08M)的混合体系下加入18mL AgNO3(0.1-1 M)溶液进行搅拌5-20min，然后加入10mL的HAuCl4溶液 (2×10-4-10×10-4M)和200μL C6H5Na3O7溶液(0.5％-1.5％，w/v)在 80-110℃反应5min得到HAu/AgSNFs。
步骤二，HAu/AgSNFs的功能化修饰：在10mL HAu/AgSNFs水溶液中加入30μL C6H7NS醇水混合溶液(0.01-1M)，搅拌反应15min后离心，清洗两次，最后分散在水溶液中得到基于HAu/AgSNFs-ATP的 SERS纳米探针。
不同AgNO3浓度下制备的HAu/AgSNFs纳米探针的透射电镜图如图1所示，由图1所可知，AgNO3浓度的不同会影响该纳米材料的形态，间接会影响其SERS效果，不同AgNO3浓度下制备的 HAu/AgSNFs-ATP优化SERS纳米探针的光谱优化图如图2所示，从TEM 图可以看出，随着AgNO3的添加，HAu/AgSNFs会从一开始的圆球状逐渐长出花瓣，由于尖端效应会产生更多的hotspots，所以其SERS 效应会增强。
步骤三，三维折纸设备的制备：用具有较高机械强度的纤维素纸通过将相关模具压缩在纤维素纸上形成相应的直径为1cm的反应腔室，将聚多巴胺材料负载在预处理区，将10μL扩增体系负载在扩增区，将20μL品红亚硫酸试剂以及HAu/AgSNFs-ATP分别负载在检测区的定性显色检测线以及定性和/或定量SERS检测线上。
步骤四，食源性致病菌的特异性检测方法建立：制备不同浓度的致病菌，然后分别对其进行加热粗提DNA，将粗提物滴加在预处理区对反应体系中的干扰物质进行吸附，然后折叠设备将预处理区和扩增区重合，在一定温度下进行基因扩增，扩增结束后，将扩增区置入酸性条件下对扩增产物进行酸水解；继续将扩增区和检测区进行折叠重合，进行相应的反应后，在可视化检测线可以得到可视化信号，对 SERS检测线进行SERS光谱采集，结合化学计量学方法，得到定量模型。
具体流程示意图如图3所示。
检测原理：核酸在强酸和高温下核酸完全水解为碱基，核糖或脱氧核糖和磷酸；在浓度略稀的无机酸中，最易水解的化学键被选择性的断裂，一般为连接嘌呤和核糖的糖苷键，从而产生脱嘌呤核酸。当糖苷键断开后形成醛基，一方面醛基可与无色品红亚硫酸溶液反应显紫色，另一方面醛基可与纳米探针HAu/AgSNFs-ATP上的氨基产生加成反应生成新的C＝N官能团，从而产生新的SERS信号。
拉曼位移一般为10-4000cm-1,对应于分子转动或振-转能级的跃迁，因此拉曼光谱一样可提供分子结构的信息。一般来说，不同的化合物给出的拉曼谱图也不同，由此可以对化合物进行定性分析鉴定。另一方面，不同化合物中同一基团或化学键又能给出波数相近的拉曼谱带，因此又可以进行官能团的鉴别。
实施例2纸基SERS传感快速检测方法的应用
2.1纸基SERS传感快速检测方法在细菌检测中的应用
2.1.1以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌为例，进行细菌的定性及定量检测
2.1.1.1金黄色葡萄球菌
分别将浓度为0-7cfu/mL的金黄色葡萄球菌进行加热粗提DNA，将粗提物滴加在预处理区对反应体系中的干扰物质进行吸附，然后折叠设备将预处理区和扩增区重合，进行基因扩增；扩增反应的总体积为20μL，其中包含一对引物P1和P2浓度分别为10-6M，体系中还包括浓度为5×10-4M的dNTPs,1×Isothermopol Buffer,以及Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶；扩增反应温度为62℃，反应时间为30min，扩增结束后，向扩增区加入0.5mM的HCl溶液在65℃反应5min后得到酸水解产物。
其中，扩增引物为：
P1：GGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTG(SEQ ID NO：1)；
P2：GCGCGGATCCATCTATAAGTGAC(SEQ ID NO：2)。
继续将扩增区和检测区进行折叠重合，进行相应的反应后，在可视化检测线可以得到可视化信号，对SERS检测线进行SERS光谱采集，结合化学计量学方法，得到PLS定量模型(如图4所示)。
以常规方法提取速冻食品样本中的DNA，将提取的DNA滴入预处理区对反应体系中的干扰物质进行吸附，然后折叠设备将预处理区和扩增区重合，进行基因扩增，扩增条件与扩增引物同上。扩增结束后，将扩增区置入酸性条件下对扩增产物进行酸水解；继续将扩增区和检测区进行折叠重合，进行相应的反应后，在可视化检测线可以得到可视化信号，对SERS检测线进行SERS光谱采集。
2.1.1.2饮用水中的大肠杆菌检测
具体方法同2.1.1.1，其中，扩增引物为：
P1：CGCTCGTTGCGGGACTTAACC(SEQ ID NO：3)；
P2：GCTGTCGTCAGCTCGTGTTG(SEQ ID NO：4)。
大肠杆菌PLS定量模型如图5所示。
2.1.1.3土壤中的沙门氏菌检测
具体方法同2.1.1.1其中，扩增引物为：
P1：TCTTACCCGCTGTATTTATGC(SEQ ID NO：5)；
P2：TAACCCGAACTATCTCAATCTGT(SEQ ID NO：6)。
沙门氏菌PLS定量模型如图6所示。
2.1.1.4总结
如图4-6所示，三种细菌的训练模型相关系数(Rc)范围为 0.9831-0.9893，预测集相关系数(Rp)范围为0.9755-0.9863，三种菌的定量模型均具有较好的预测能力，因此应用该方法对食源性致病菌的检测具有一定可行性。
实施例2纸基SERS传感快速检测方法的灵敏度实验
从图4-图6的SERS定量预测模型可以看出，在线性范围内，该方法对金葡菌的的最低检出限为10cfu/mL，对大肠杆菌的最低检出限为1cfu/mL，对沙门氏菌的最低检出限为10cfu/mL。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttcaaaag tgaaagacgg tcttg 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcggatcc atctataagt gac 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgctcgttgc gggacttaac c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgtcgtca gctcgtgttg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttacccgc tgtatttatg c 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taacccgaac tatctcaatc tgt 23

Claims (1)

1.一种基于中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP的食源性致病菌的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备不同浓度的致病菌，然后分别提取得到DNA，然后基因扩增分别得到扩增产物；
(2)所述扩增产物酸水解后分别置于SERS检测区进行反应，反应完成后分别进行SERS光谱采集得到SERS信号，用化学计量学方法建立预测模型；
(3)提取待测样品的DNA，基因扩增得到待测样品的扩增产物，之后酸水解后，将酸水解产物置于SERS检测区进行反应，反应完成后分别进行SERS光谱采集得到SERS信号；
(4)根据标准SERS图谱对待测样品中的核酸进行定性；根据所述预测模型对待测样品中的核酸进行定量；
所述SERS检测区含有中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP；
所述致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或沙门氏菌；所述致病菌为金黄色葡萄球菌时，所述基因扩增所用引物为SEQ ID NO：1-2所示序列；所述致病菌为大肠杆菌时，所述基因扩增所用引物为SEQ ID NO：3-4所示序列；所述致病菌为沙门氏菌时，所述基因扩增所用引物为SEQ ID NO：5-6所示序列；
所述中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP的制备方法为：
(1)HAu/AgSNFs制备：在H3NO溶液和NaOH溶液的混合体系下加入AgNO3溶液，然后加入HAuCl4溶液和C6H5Na3O7溶液反应得到HAu/AgSNFs水溶液；
(2)HAu/AgSNFs的功能化修饰：在步骤(1)得到的HAu/AgSNFs水溶液中与C6H7NS醇水混合溶液混合，反应后离心、清洗，得到所述中空金银核壳纳米花SERS纳米探针HAu/AgSNFs-ATP。
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