CN109082480B - 一种dna编导的变色银纳米簇用于同时检测两种hiv dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明利用银纳米簇(AgNCs)作为免标记的荧光生物传感平台用于同时检测两种HIV DNA。该荧光传感平台基于银纳米簇的两个特点：(1)富鸟嘌呤(G)序列能成倍增强银簇荧光；(2)相邻的两个AgNCs相互挤压能明显增强荧光。在单链两端设计不同的合成AgNCs的模版，获得两种不同发光峰的信号以避免信号干扰，与该单链错配的DNA链设计为一端为富‑G序列，另一端为合成银簇挤压对的模板。目标物与互补DNA完全配对，破坏了AgNCs的高荧光，使荧光信号减弱。仅需一种变色银纳米簇作为荧光探针就可以得到两个较宽的检测范围(0.2‑700nm)，检测限均低至0.2nM，还可实现对多种DNA或miRNA高灵敏性检测，从而提高生物分析的准确性和实用性。

Description

一种DNA编导的变色银纳米簇用于同时检测两种HIV DNA的 方法
技术领域
本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种DNA编导的变色银纳米簇用于同时检测两种HIV DNA的方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染并破坏宿主的免疫系统时，免疫系统的功能会逐渐丧失并伴随着许多疾病的发生，严重时还会导致死亡。因此，精确的检测HIV基因对于感染者的及早发现与及时治疗具有重要的意义。
几十年来，已发展了许多用于单目标HIV基因检测的方法，包括表面增强拉曼散射法(SERS)、荧光法、比色法、和电化学技术等。其中荧光法由于操作简便，观察直观而被普遍使用。Das等人设计了一种需要单端标记，并且核酸链和材料之间能通过π-π共轭紧密接触而淬灭荧光的新型荧光探针[Das,G.；Biswal,B.P.；Kandambeth,S.；Venkatesh,V.；Kaur,G.；Addicoat,M.；Heine,T.；Verma,S.；Banerjee,R.Chem.Sci.2015,6,3931-3939]。该探针的荧光强度的改变可以证明目标DNA的存在。但是修饰成本高，材料的分离和净化耗时长以及操作繁琐等问题增加了该方法的难度。贵金属纳米簇由于其具有荧光发射特性，被认为是有机荧光团和量子点在化学传感、生物测定和生物成像领域中的替代品。特别是银纳米簇(AgNCs)已经引起了相当大的关注。为了提高HIV检测的准确性和可靠性，本发明致力于设计一种基于变色银纳米簇的荧光传感探针，实现两种HIV DNA的同时检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA编导的变色银纳米簇用于同时检测两种HIV DNA的方法。
本发明的内容如下：
探针的设计为：
(1)DNA探针由两条部分互补的ssDNA组成，分别为cDNA和P链；
(2)cDNA链由富含G的序列、合成AgNCs的富C序列、HIV-2序列互补的序列和与HIV-1互补链部分配对的碱基序列四个部分组成；
(3)P链由能合成黄绿色荧光的AgNCs的序列、能合成橙红色光的AgNCs的序列、HIV-1序列互补的序列和与HIV-2互补链部分配对的碱基序列四个部分组成。
进一步的，由上述DNA探针合成带有DNA模板化的AgNCs的探针。
cDNA和P链的序列号为：
cDNA链：
5'-CCTCCTTCCTCC/ATGTGGAAAATCTCTAGCAGTTATTATTATTATTATAGGCCCAGCCCTCACCAT/GGGTGGGTGGGTGGGT-3'
P链：
5'-CCCACCCACCCACCC/ATGTGGAAAATCTCTAGCAGTATAATAATAATAATAGTGAGGGCTGGGCCTCAT/CCCTAACTACCC-3'
获得黄绿色荧光AgNCs的DNA序列为CCCACCCACCCACCC，获得橙红色荧光AgNCs的DNA序列为CCCTAACTACCC，与橙红色荧光AgNCs配对的AgNCs的DNA序列为CCTCCTTCCTCC。
本发明中所涉及的DNA均可由本领域常规技术合成，具体由上海生工有限公司合成。
DNA模板化的AgNCs的合成所用的缓冲液是磷酸缓冲液(PBS)，其浓度为20mM，pH为7.0。
本发明的工作原理为：
(1)在加入目标DNA之前，富含G的序列能增强一端的AgNCs的荧光，而另一端AgNCs荧光的增强依赖于两个AgNCs之间的相互挤压。
(2)加入目标DNA之后，探针和目标DNA之间的杂交会打开探针的错配双链结构，导致cDNA链与P链分离，从而荧光信号减弱。
我们用荧光信号的强度变化来验证本发明的可行性。探针在加入目标DNA之前，显示出强的荧光信号，加入目标DNA之后，荧光信号显著降低，该现象证明了原理的可行性。
发射黄绿色荧光的AgNCs，其荧光显示最大发射强度在565nm处，而发射橙红色光的AgNCs，在630nm处呈现最大发射强度的荧光。
在本发明中，我们使用上述探针来同时检测两种HIV DNA(HIV-1和HIV-2)。
通过使用该检测方法，HIV-1与HIV-2的检测限均为0.2nM，具有高灵敏度。
在本发明中，最佳的实验条件为：pH为7.0，DNA模板与试剂的用量比例为DNA：Ag+：NaBH4＝1：20：20，温度为37℃，反应时间为40分钟。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)这种同时检测的分析方法经济简单，仅用单一的多变色AgNCs荧光探针就可以实现两种HIV DNA的同时检测。
(2)该方法解决了荧光染料标记存在的费用昂贵、操作复杂等问题。
(3)由于制备简单，发射范围大，无需标记等特点，以DNA为模板的AgNCs为检测各种分析物提供了一个高效的平台。
附图说明
【图1】为同时检测两种HIV DNA的工作原理图。
【图2】为本发明用到的DNA序列。
【图3】为两种HIV DNA同时检测的可行性验证。
【图4】为合成AgNCs的pH优化。
【图5】为探针与Ag+和NaBH4比例的优化。
【图6】为反应温度的优化。
【图7】为反应时间的优化。
【图8】为同时对两HIV DNA分析定量的荧光光谱图。
【图9】为同时检测HIV DNA的线性关系曲线。
【图10】为同时检测DNA的选择性考察。
【图11】为同时检测病毒DNA的加标回收率考察。
【图12】为原理可行性和银纳米簇的紫外表征。
【图13】为同时检测两种HIV DNA干扰性的探究。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1
基于变色银纳米簇的荧光探针的设计
(1)本实施例中DNA探针的设计：
1)DNA探针由两条部分互补的ssDNA组成，分别为cDNA和P链；
2)cDNA链由富含G的序列，合成AgNCs的富C序列，与HIV-2序列互补的序列和与HIV-1互补链部分配对的碱基序列四个部分组成；
3)P链由能合成黄绿色荧光的AgNCs的序列，能合成橙红色光的AgNCs的序列，与HIV-1序列互补的序列和与HIV-2互补链部分配对的碱基序列四个部分组成。
本实施例中涉及到的DNA序列如图2所示。
(2)DNA模板化的AgNCs的合成：
将10μL序列P(500nM)溶于170μL的PBS缓冲液(20mM，pH 7.0)中。然后，将P溶液在90℃下加热5分钟，然后快速冷却并保持在冰中1小时。为了合成黄绿色和橙红色发光的AgNCs，将10μLcDNA与相同浓度的上述P溶液杂交。之后，向上述混合物中加入5μL的AgNO3(10μM)，剧烈摇动5秒钟后，加入5μL新制备的NaBH4(10μM)溶液，再剧烈搅拌1分钟，在室温下将溶液在黑暗中保持4小时后，再进行荧光测量。
实施例2
基于银纳米簇的荧光探针同时检测两种HIV DNA可行性的验证
本发明同时使用以565nm和630nm发射峰为模板的发光AgNCs检测HIV-1和HIV-2，工作原理如图1。
本实施例中我们用荧光光谱法来验证原理的可行性。
荧光光谱法检测的条件为：
待测物的浓度：HIV-1和HIV-2分别为500nM
仪器：RF-5301PC荧光分光光度计
仪器参数：激发波长：500nm和580nm，发射波长：565nm和630nm，激发狭缝：5nm，发射狭缝：5nm
具体的实验操作为：
(1)首先在不存在目标DNA(HIV-1和HIV-2)的情况下，将10μL的P(500nM)和10μLcDNA溶液错配杂交，溶解于150μL的PBS缓冲液(20mM，pH 7.0)中，将混合溶液在90℃加热5分钟，再快速冷却并保持在冰中1小时。
(2)然后，10μL的两种目标DNA(500nM)一起加入，再将10μL的AgNO3(20μM)加入上述混合物中，剧烈振荡5秒钟，之后向其中加10μL现制的NaBH4(20μM)溶液达到最后的200μL的体积并剧烈搅拌2分钟。
(3)混合后的最终溶液应在室温下避光保存4小时后，再进行荧光光谱测量。
在荧光光谱图(图3)中，图3a中从下至上分别是背景荧光强度曲线、探针P和HIV-1存在时的荧光强度曲线、探针P存在时的荧光强度曲线。图3b中从下至上分别是背景荧光强度曲线、探针P和HIV-2存在时的荧光强度曲线、探针P存在时的荧光强度曲线。从图中我们可以看到在HIV-1和HIV-2存在下565nm和630nm的荧光在一段时间后显著降低，该现象证实了实验原理的可行性。
实施例3
实验条件的优化
(1)PH的优化
由于缓冲液的pH对合成AgNCs有一定的影响，所以必须优化实验的pH环境。我们选择6.4、6.8、7.0、7.2、7.6五个pH值做了一个细致的优化，荧光差值在不同pH下的差异从图4中可明显可以看出，在pH为7.0时，得到的荧光差值是最高的，所以在接下来的实验中，选择7.0为体系的最佳pH。(I0是加入目标DNA之前的荧光强度，I是加入目标物之后的荧光强度)。
(2)试剂和DNA模版的用量配比的优化
确定好pH后，对试剂和DNA模版的用量配比做一系列的优化工作，以便合成的AgNCs是最佳的荧光效果。在实验中，DNA：Ag+：NaBH4比例用量优化显示在图5中，由于荧光纳米材料的合成关系到信号输出效果的好坏，在优化过程中，利用有无目标物存在时的荧光差作为优化的最佳结果比较合理。从图中我们可以观察到，浓度比例确定为1:20:20时，显示出最好的结果。
(3)实验温度的优化
对于核酸的杂交反应来说，基本是常温状态下即可进行，但是为了使杂交的效率更高，温度的优化是必不可少的环节。我们分别在25、30、35、37和40℃的不同温度下检测目标DNA杂交的情况，观察发现(图6)，对于HIV-1来说，35℃得到最佳的效果；HIV-2则是在37℃时候是最有效率的。综合考虑，选择了接近人体温度的37℃作为最佳温度。
(4)反应时间的优化
在最佳温度条件下，又优化了反应时间，先测几组空白值，再将加入目标DNA后的溶液每隔十分钟测一次。在图7的曲线中我们看到在40分钟以后，反应的荧光差基本就达到稳定，为了在体系稳定后最短的时间内实现同时检测，我们选择40分钟作为一个最佳的检测时间。
实施例4
探针性能检测以及灵敏度分析
为了评估该方法的灵敏度，在最佳的实验条件下将探针(500nM)与不同浓度(0.2-700nM)的HIV-1和HIV-2在室温下杂交5h。如图8所示，在HIV-1和HIV-2浓度从0.2增加到700nM后，观察到两图中荧光强度逐渐降低。该现象说明本发明中的探针具有很好的检测性能。
本实验在0.2-700nM之间获得良好的线性，HIV-1和HIV-2的定量测量显示在图9中。通过使用这种方法，得到HIV-1和HIV-2的检测限均为0.2nM，因此证明该方案拥有高灵敏度。
实施例5
选择性分析实验
控制其他条件不变，分别设计了HIV-1与相应的单、双、三碱基错配和任意有别于目标DNA序列的实验对比检测。结果发现(图10)目标物HIV-1的存在下观察到明显的荧光降低现象(I0-I)，而与碱基错配DNA相互作用后荧光强度差值小。类似的，在HIV-2加入到含有探针的溶液中后，对比错配的DNA来说也只有目标物HIV-2才可以导致一个大的荧光差产生。通过选择性实验可以看出，我们设计的方案具有很高的特异性。
实施例6
血清加标回收实验
将人血清液高速离心，吸取上清液并用二次超纯水稀释500倍。从线性方程上选取三个不同浓度的HIV-1和HIV-2加入到稀释的人血清样品中，控制其他条件不变，检测目标物的回收率。实验结果如图11所示。
从图中数据得出很好的回收效果，由此表明本发明开发的检测方法为在生物流体中特异性检测HIV DNA提供了巨大潜力。
实施例7
紫外表征实验
实验中，利用UV作为银纳米簇的表征手段。
具体操作如下：
1)将两组200μL序列P(2μM)溶于PBS缓冲液(20mM，pH 7.0)中。然后，在90℃水浴锅中，两份含P溶液水浴5分钟，再突然在冰中冷却1小时。
2)为了验证合成黄绿色和橙红色发光的AgNCs具有高效性，将200μLcDNA与相同浓度的上述P溶液杂交。再在其中一组中加入等浓度的两种目标DNA，另一组加入相同体积的缓冲液。
3)之后，向上述混合物中加入100μL的AgNO3(200μM)，然后剧烈摇动5秒钟，再加入新制备的100μL的NaBH4(200μM)溶液，剧烈搅拌1分钟。
4)室温下将溶液在黑暗中保持4小时后，在紫外分光光度计测量在不同波长处获得两种紫外特征光谱。
从图12中我们可以看到，探针在加入了Ag+和还原剂NaBH4后，分别在500nm和580nm出现了特征的吸收峰，这两个吸收峰分别对应着565nm和630nm两处的发射波长。而加入了目标DNA后，由于目标DNA竞争了互补的DNA序列，从而破坏了两端银簇的强荧光状态，观察不到明显的紫外吸收峰的存在。
实施例8
目标物共存时干扰性的探究
在最佳条件下，用同时在565nm和630nm处有荧光的探针对HIV-1和HIV-2基因进行多重分析。在HIV-1(500nM)和HIV-2(500nM)同时存在下，互补链被竞争下来分别与相应的目标DNA杂交。通过发黄绿光的AgNCs和发射橙红色的AgNCs证实了可同时对两个目标DNA的互不干扰分析(图13)。
如图13a所示，在没有目标DNA的情况下，两个AgNCs都显示非常强的荧光。仅有HIV-1存在时565nm处产生低发射但是不影响橙红色AgNCs荧光强度(图13b)。类似地，HIV-2单独存在仅导致在630nm处的低发射，而发射黄绿光的AgNCs发射仍然最高(图13c)。最后，在同时添加两种DNA时，观察到565nm和630nm处的低荧光强度发射峰(图13d)，表明这种分析方法能成功检测到多种核酸并且能做到互不干扰。
Figure IDA0001857717350000011
Figure IDA0001857717350000021
Figure IDA0001857717350000031
Figure IDA0001857717350000041

Claims (2)

1.一种基于变色银纳米簇的病毒DNA检测探针，其特征在于：
(1)DNA探针由两条部分互补的ssDNA组成，分别为cDNA和P链；
(2)cDNA链包含富含G的序列(加粗序列)、合成橙红色荧光的AgNCs的序列(双下划线序列)、与HIV-1互补链部分配对的碱基序列(下划线序列)三个部分组成，cDNA链序列如下：
Figure FDA0003245484400000011
(3)P链包含能合成黄绿色荧光的AgNCs的序列(加粗部分)、能合成橙红色荧光的AgNCs的序列(双下划线序列)、与HIV-2序列互补的序列(下划线序列)三个部分组成，P链序列如下：
Figure FDA0003245484400000012
(4)DNA探针进一步合成带有AgNCs的DNA检测探针。
2.根据权利要求1所述的一种基于变色银纳米簇的病毒DNA检测探针，其特征在于，合成带有AgNCs的DNA检测探针所用的缓冲液是磷酸缓冲液，其浓度为20mM，pH为7.0。
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