CN112710646A - 一种用于检测核酸的免标记银纳米簇分子信标的合成方法 - Google Patents

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Abstract

一种免标记检测核酸的荧光生物传感器，它涉及荧光生物传感器的制备方法，用途及检测方法。本发明的目的是：构建并制备一种新型的可用于检测核酸的荧光生物传感器，通过对显著增高的荧光强度的检测实现对核酸的超高灵敏度检测。方法：一、合成DNA‑Ag纳米簇；二、基于茎环结构与靶DNA结合，构建荧光生物传感器，实现对核酸的免标记检测。三、根据步骤二绘制标准曲线。本发明可获得一种免标记检测核酸的荧光生物传感器的方法。

Description

一种用于检测核酸的免标记银纳米簇分子信标的合成方法
技术领域
本发明属于荧光生物传感器技术领域，具体涉及一种荧光生物传感器的制备及免标记检测核酸的应用。
背景技术
分子信标(MB)是一种发夹状茎环结构的寡核苷酸探针，发明于1996年。分子信标在两个终端分别含有荧光基团和猝灭基团。靶标DNA存在时，环状区可以与靶DNA杂化，破坏发夹状结构，荧光基团和猝灭基团由于空间距离增加而发出荧光。与此相反的是靶标DNA不存在时，分子信标的茎干区碱基互补，荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生荧光猝灭，基于荧光共振能量转移原理，分子信标被广泛应用于核酸检测分析，DNA-蛋白质的相互作用，DNA芯片和DNA传感器。金属纳米簇分子信标可以优化传统分子信标法复杂的标记过程，昂贵的成本和长时间的检测。
在荧光金属纳米簇中，银纳米簇一直是研究的热点。银纳米簇是由几个或数十个原子构成的一种极小的粒子，处于银原子和纳米颗粒之间的一种过渡态，具有优良的光化学性质。化学法，光分解法，辐射分解法和声化学法等均可以合成银纳米簇。除此之外还可以利用丰富的模板来制备银纳米簇例如蛋白质，树枝状大分子，DNA及其类似物等。由DNA为模板合成的银纳米簇具有光化学稳定，荧光量子产量高，生物相容性良好，无毒水溶等优点。所以DNA模板的荧光银纳米簇备受关注。核酸序列对合成的银纳米簇有很大的影响。富G序列对银纳米簇有荧光强作用，所以目前DNA模板通常包括含有胞嘧啶的成簇序列，激活银纳米簇的富G序列和连接成簇序列和激活序列的连接臂三部分，但具体的DNA序列对合成银纳米簇的原理还有待进一步探索。
传统的分子信标法需要用有毒的染料等对荧光生物传感器进行标记，标记过程十分复杂且漫长，检测灵敏度还有可提升空间。基于此，我们提出了合成银纳米簇免标记检测核酸(HIV)，本方法操作简单，实验成本有效降低，反应灵敏、迅速，特异性好，耗时短，无毒水溶性好。
发明内容
基于此，本发明提供了一种检测核酸的荧光生物传感器。将银纳米簇与分子信标相 结合，靶标DNA存在时会与分子信标结合导致荧光强度显著增高实现对核酸的检测。以单 链DNA序列为模板合成可以发出稳定荧光的银纳米簇，利用其茎环结构发明了一种新型免 标记检测核酸的方法，本方法实验成本低且灵敏度高。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的：本发明的荧光生物传感器是以特定的DNA链为模板，合成DNA-Ag纳米簇，利用茎环结构与靶标DNA特异性结合实现核酸检测。以一条单链的DNA为模板，目标DNA不存在时模板DNA成环，不能合成银纳米簇，当目标DNA存在时，与模板DNA结合，打开环状结构，形成荧光银纳米簇。随目标DNA浓度升高，荧光强度逐渐升高，从而达到检测核酸的目的。本发明为检测核酸提供了一种新方法，实验成本低且灵敏度高。
用于免标记检测核酸的银纳米簇分子信标的设计与合成的制备方法是按以下步骤完成的：(1)合成DNA-Ag纳米簇：①将10uL单链DNA1浓度为(10µM~100µM)加入小管与50µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)混合，加入40uL水，在室温条件下震荡30min；②将100µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)和80uL水加入到上述混合液中。随后将10µLAgNO3溶液(浓度为40µM~200µM)10µLNaBH4(浓度为40µM~200µM)加入到混合溶液中，该混合溶液在25OC下水浴震荡6h。荧光Ag纳米簇形成； (2)根据上述步骤，进行核酸检测；(3)绘制标准曲线：首先将10µLDNA1分别加入到编号为①到⑦的7个小管中，其中，①号不加HIV溶液，②号加入0.01µM HIV溶液，③号加入0.05µM HIV溶液，④号加入0.1µM HIV溶液，⑤号加入0.5µM HIV溶液，⑥号加入1µM HIV溶液，⑦号加入未知浓度HIV溶液；分别向编号为①到⑦的混合溶液中分别依次加入10µLDNA1(10µM~100µM)、50µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、40µLH2O，室温下震荡30min，再将100µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、80µLH2O、10µLAgNO3(40µM~200µM)、10µLNaBH4(40µM~200µM)加入到混合液中，震荡5min后25OC水浴6小时得到编号为①到⑦的待测液。用1mL比色皿，编号为①不加HIV溶液的作为空白参比，测定490nm处编号为①到⑥的待测液的荧光强度；其中，从编号为①到⑥，以HIV浓度为纵坐标，以体系的荧光强度为横坐标，可以绘制出标准曲线；⑦号未知浓度HIV溶液样品可以通过该标准曲线查出它的浓度。
本发明的优点一、利用免标记分子信标代替了传统的有机染料标记分子信标，实验成本低，无毒，便捷。二、利用特定DNA序列合成银纳米簇从而提高检测核酸的灵敏度。三、使用的仪器及试剂价格低廉，操作简单，快速。
附图说明
图1为检测核酸的可行性图。其中(A)为不添加目标DNA(HIV)，(B)为添加了目标DNA(HIV)。从图1可知该方法检测核酸可行。
图2为荧光强度与核酸浓度的标准曲线图 ，浓度范围是0-1µM。从图2的标准曲线可知此荧光生物传感器的检测限为1nM。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施方式及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施方式及实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围；下面通过具体实施方式及具体实施例说明本发明，但本发明不受下述实施方式及实施例的限定。
具体实施方式一：本实施方式是一种检测核酸的荧光生物传感器的制备方法是按以下步骤完成的：
(1)合成DNA-Ag纳米簇：①将10uL单链DNA1浓度为(10µM~100µM)加入小管与50µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)混合，加入40uL水，在室温条件下震荡30min；②将100µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)和80uL水加入到上述混合液中；随后将10µLAgNO3溶液(浓度为40µM~200µM)10µLNaBH4(浓度为40µM~200µM)加入到混合溶液中，该混合溶液在25OC下水浴震荡6h。荧光Ag纳米簇形成。
(2)根据上述步骤，进行DNA检测。
(3)绘制标准曲线：首先将10µLDNA1分别加入到编号为①到⑦的7个小管中，其中，①号不加HIV溶液，②号加入0.01µM HIV溶液，③号加入0.05µM HIV溶液，④号加入0.1µMHIV溶液，⑤号加入0.5µM HIV溶液，⑥号加入1µM HIV溶液，⑦号加入未知浓度HIV溶液；分别向编号为①到⑦的混合溶液中分别依次加入10µLDNA1(10µM~100µM)、50µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、40µLH2O，室温下震荡30min，再将100µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、80µLH2O、10µLAgNO3(40µM~200µM)、10µLNaBH4(40µM~200µM)加入到混合液中，震荡5min后25OC水浴6小时得到编号为①到⑦的待测液；用1mL比色皿，编号为①不加HIV溶液的作为空白参比，测定490nm处编号为①到⑥的待测液的荧光强度；其中，从编号为①到⑥，以HIV浓度为纵坐标，以体系的荧光强度为横坐标，可以绘制出标准曲线；⑦号未知浓度HIV溶液样品可以通过该标准曲线查出它的浓度。
本实施方式的优点：一、利用免标记分子信标代替了传统的有机染料标记分子信标，实验成本低，无毒，便捷；二、利用特定DNA序列合成银纳米簇从而提高检测核酸的灵敏度；三、使用的仪器及试剂价格低廉，操作简单，快速；
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤(1)①中单链DNA1浓度为33µM；其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤(2)①中将含有100mmol/L的Tris缓冲溶液(pH=7.4)加入到上述双链DNA溶液中；其它步骤与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤(2)②中经过振动搅拌后，将10µLAgNO3溶液(浓度为180µM)、10µLNaBH4(浓度为180µM)加入到混合溶液中，该混合溶液在25℃下震荡6h。荧光Ag纳米簇形成；其它步骤与具体实施方式一至四相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：本实施方式是一种检测核酸的荧光生物传感器的制备方法是按以下步骤完成的：
(1)合成DNA-Ag纳米簇：
①将10uL单链DNA1浓度为(10µM~100µM)加入小管与50µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)混合，加入40uL水，在室温条件下震荡30min；
②将100µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)和80uL水加入到上述混合液中。随后将10µLAgNO3溶液(浓度为40µM~200µM)10µLNaBH4(浓度为40µM~200µM)加入到混合溶液中，该混合溶液在25OC下水浴震荡6h。荧光Ag纳米簇形成；
(2)根据上述步骤，进行DNA检测；
(3)绘制标准曲线：首先将10µLDNA1分别加入到编号为①到⑦的7个小管中，其中，①号不加HIV溶液，②号加入0.01µM HIV溶液，③号加入0.05µM HIV溶液，④号加入0.1µMHIV溶液，⑤号加入0.5µM HIV溶液，⑥号加入1µM HIV溶液，⑦号加入未知浓度HIV溶液；分别向编号为①到⑦的混合溶液中分别依次加入10µLDNA1(10µM~100µM)、50µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、40µLH2O，室温下震荡30min，再将100µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、80µLH2O、10µLAgNO3(40µM~200µM)、10µLNaBH4(40µM~200µM)加入到混合液中，震荡5min后25OC水浴6小时得到编号为①到⑦的待测液。用1mL比色皿，编号为①不加HIV溶液的作为空白参比，测定490nm处编号为①到⑥的待测液的荧光强度；其中从编号为①到⑥，以HIV浓度为纵坐标，以体系的荧光强度为横坐标，可以绘制出标准曲线；⑦号未知浓度HIV溶液样品可以通过该标准曲线查出它的浓度。

Claims (4)

1.一种免标记检测核酸的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)合成DNA-Ag纳米簇：①将10uL单链DNA1浓度为(10µM~100µM)加入小管与50µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)混合，加入40uL水，在室温条件下震荡30min；②将100µL的Tris缓冲溶液(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)和80uL水加入到上述混合液中；随后将10µLAgNO3溶液(浓度为40µM~200µM)10µLNaBH4(浓度为40µM~200µM)加入到混合溶液中，该混合溶液在25OC下水浴震荡6h，荧光Ag纳米簇形成；(2)根据上述步骤，进行核酸检测；(3)绘制标准曲线：首先将10µLDNA1分别加入到编号为①到⑦的7个小管中，其中，①号不加HIV溶液，②号加入0.01µM HIV溶液，③号加入0.05µM HIV溶液，④号加入0.1µM HIV溶液，⑤号加入0.5µM HIV溶液，⑥号加入1µM HIV溶液，⑦号加入未知浓度HIV溶液；分别向编号为①到⑦的混合溶液中分别依次加入10µLDNA1(10µM~100µM)、50µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、40µLH2O，室温下震荡30min，再将100µLTris(pH=7.4)(100mmol/L~150mmol/L)、80µLH2O、10µLAgNO3(40µM~200µM)、10µLNaBH4(40µM~200µM)加入到混合液中，震荡5min后25OC水浴6小时得到编号为①到⑦的待测液；用1mL比色皿，编号为①不加HIV溶液的作为空白参比，测定490nm处编号为①到⑥的待测液的荧光强度；其中，从编号为①到⑥，以HIV浓度为纵坐标，以体系的荧光强度为横坐标，可以绘制出标准曲线；⑦号未知浓度HIV溶液样品可以通过该标准曲线查出它的浓度。
2.根据权利要求1所诉的一种免标记检测核酸的荧光生物传感器，其特征在于步骤一①中所述的单链DNA1序列为gag att tcc cac ccc tcc caa gtc agt gtg gaa aat ctctag c。
3.根据权利要求1所诉的一种免标记检测核酸的荧光生物传感器，其特征在于步骤一②中所述的硝酸银组分的最终浓度为24µmol/L。
4.根据权利要求1所诉的一种免标记检测核酸的荧光生物传感器，其特征在于步骤一②中所述的硼氢化钠组分的最终浓度为24µmol/L。
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