CN109439659A - 一种核酸适体核酶序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于核酸适体核酶序列和分子间裂分G‑四链体‑氯化血红素DNA酶自组装纳米线的高灵敏度检测探针、试剂盒及其制备方法和应用，尤其适用于三磷酸腺苷(ATP)的检测。本发明将核酸适体、Mg²⁺依赖的10‑23核酶、杂交链式反应以及G‑四链体‑血红素DNA酶酶促反应结合起来，实现了检测信号的逐步放大，大幅度提高了检测的灵敏度，检测灵敏度可达pmol/L级别，高出现有技术通常检测灵敏度水平nmol/L级别3个数量级。其中ATP核酸适体核酶探针工作性能优秀，检测灵敏度限为2pmol/L，特异性很好，常见的UTP、GTP、CTP等其它干扰物质对ATP检测基本不产生影响，能够满足医学临床诊断及机体代谢研究等对超高灵敏度的ATP检测方法需求，在产业中极具推广潜力和实际应用价值。

Description

一种核酸适体核酶序列

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于核酸适体核酶序列和分子间裂分G-四链体-氯化血红素DNA酶自组装纳米线的高灵敏度检测探针、试剂盒及其制备方法和应用，可用于三磷酸腺苷(ATP)的检测。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是一种高能磷酸化合物，被认为是一种在所有生物体生存和繁殖的细胞合成中必不可少的普遍能量来源，形象的说，它是一种通用的能量“货币”。自1929年Lohmann等人从糖分解代谢旺盛的肌肉中首次发现并提取ATP以来，它已被证实在生命细胞的脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢及维持生物体的正常机能等方面扮演着极其重要的角色。通过监测ATP含量的改变，可以评价多种药物，生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用；另外ATP也常作为微生物污染的一个指标，检测ATP含量能直接反映出其受污染程度。测定生物体中ATP的水平及其动态变化便成为监测生物体必不可少的手段(林小峰等，中国农学通报2013,29(36):33-38)。现有的检测方法包括高效液相色谱法、电化学法、质谱、核磁共振、X-射线衍射及分子动力学模拟、荧光法等，这类方法由于需要大型仪器设备、操作繁琐、灵敏度不高、检测复杂样品容易被干扰等缺点限制其进一步应用。

核酸适体(aptamer)是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡核苷酸片段。核酸适体作为一种新型的分子识别工具，具有亲和力高、特异性好、稳定性好、易合成、易修饰等优点。目前已有基于核酸适体检测ATP的方法，如CN106932577A公开了一种基于核酸适体的荧光偏振(荧光各向异性)对ATP实现检测的方法，虽然该发明无需昂贵的仪器设备，操作步骤简单，但是ATP的检测限最大仅为0.2μM，灵敏度偏低。

核酸适体核酶(Aptazymes)兼具核酸适体和DNA酶的优点，具有较高的靶目标识别特异性和催化信号放大，在许多分析应用中显示出其巨大的应用前景。然而，尽管在开发基于ATP核酸适体核酶的传感器方面已发展了相关的研究工作，但灵敏度依旧不高，检测性能在纳摩尔水平，如CN107653297A公开了一种基于核酸适体的检测试剂盒，包括含有分割成两段的核酸适体的颈环结构核酸，以核酸适体为ATP分子识别元件，激活DNA酶的催化活性，实现循环切割底物链，产生荧光检测信号，该发明对ATP的检测限为0.2nM，检测的线性范围为1nM到10μM。

基于适体的核酸性质，一些研究者也尝试利用核酸分子扩增技术将信号放大用于提高检测的灵敏度，这类技术包括环介导等温扩增、滚环扩增、链置换扩增、聚合酶链式反应以及连接酶链式反应等，此类方法一定程度上提升了方法的灵敏度，但这些技术依赖于DNA模板扩增，而扩增的模板序列增加了交叉污染的可能性，因此该类方法容易出现假阳性结果。在2004年，Dirks和Pierce首次引入了杂交链式反应(HCR)用于DNA检测，其具有和PCR技术相近的灵敏度，却不需要使用蛋白酶。杂交链式反应是2个DNA发夹之间的自组装杂交反应，在引发DNA存在时，通过部分互补序列重叠成一个长的双链DNA纳米线，纳米线定义为一种具有在横向上被限制在100纳米以下(纵向没有限制)的一维结构，DNA双螺旋结构的直径为2nm。由于不需要扩增DNA模板、信号放大不需要酶参与、假阳性率低等特点，该方法已经与多种技术相结合用于发展新型、高效生物传感器，如电化学方法、生物发光方法、荧光法等技术，如CN107860912A公开了一种双功能化核酸适体介导的A549肿瘤细胞检测方法，通过设计发夹催化自组装反应体系中的两发夹结构及触发序列，高效且特异地进行信号放大，再将该触发序列整合至特异性识别靶细胞A549表面粘蛋白1的适体上，从而采集荧光信号可分析获得受检细胞数量。然而，目前尚没有基于核酸适体、核酶和杂交链式反应的高灵敏度和高特异性的ATP检测方法，现有方法的ATP检测灵敏度通常仅能达到纳摩尔水平，而ATP的检测被已广泛应用于包括肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、多种重要细胞活性及微生物含量分析等诸多方面，随着研究的不断深入及痕量分析技术的发展，科学家们对更高灵敏度的ATP检测提出了强烈的需求，因而发展更高灵敏度的ATP检测方法对于医学临床诊断及机体代谢研究等方面具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单、成本低廉的基于核酸适体核酶和分子间裂分G-四链体-氯化血红素DNA酶自组装纳米线的高灵敏检测试剂及其制备方法和应用，尤其适用于ATP的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种核酸适体核酶探针，其包含A、A’、B、C、C’、D、E、E’、F、G、H、H’、K部分组成的茎环结构，其中A与A’、C与C’、E与E’、H与H’部分分别互补配对，依次形成茎环B、D、F、G部分，茎环B为核酶序列，茎环F为核酸适体序列，K为核酶的切割位点，茎环G和H’部分为杂交链式反应的引发链序列；在核酸适体底物存在的情况下，核酸适体结构域茎环F与底物结合并形成紧密的结构，并促进核酶催化核心中活性二级结构的形成从而激活核酸适体核酶，活化的核酸适体核酶能够从探针内部的切割位点K切断探针链，释放杂交链式反应的引发序列G和H’部分，与发夹探针P1和P2杂交形成DNA纳米线，在氯化血红素(hemin)插入后显示出增强的类过氧化物酶的催化活性，催化H₂O₂与2,2’-联氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)之间的反应产生绿色的阳离子自由基ABTS⁺。

优选的，所述核酶为10-23核酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述茎环F部分为核酸适体序列，其碱基数为6-35个，进一步为10-20个。

优选的，所述核酸适体序列为特异性识别ATP的核酸适体序列，其序列如SEQ IDNO.2所示。

优选的，所述A与A’部分的碱基数为5-15个。

优选的，所述C与C’部分的碱基数为2-10个。

优选的，所述E与E’部分的碱基数为2-10个。

优选的，所述H与H’部分的碱基数为5-18个。

优选的，所述杂交链式反应的引发链序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述核酸适体核酶探针的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种微球微载体，其包括经设计的生物素修饰的所述核酸适体核酶探针，并通过生物素-亲和素结合固定在微球上。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括所述微球微载体及发夹探针P1、P2，发夹探针P1的3’端与杂交链式反应的引发链序列3’端部分互补配对，发夹探针P1的5’端与发夹探针P2的5’端部分互补配对，发夹探针P2的3’端与发夹探针P1的3’端部分互补配对。

优选的，所述发夹探针P1的序列如SEQ ID NO.5所示，所述发夹探针P2的序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的所述试剂盒还进一步包括hemin、ABTS及H₂O₂。

本发明还提供了一种利用所述核酸适体核酶探针或所述微球微载体或所述试剂盒在金属、多肽、蛋白、有机分子、核酸、大分子聚合物等检测上的应用。

优选的，所述应用为在ATP检测中的应用。

本发明还提供了一种利用所述核酸适体核酶探针或所述微球微载体或所述试剂盒检测ATP的方法，其包括如下步骤：

(1)ATP核酸适体核酶二级结构的形成

生物素修饰的核酸适体核酶使用25mM HEPES缓冲液配置，取100μL 1μM的生物素化核酸适体核酶于EP管中，逐步缓慢退火；

(2)发夹探针P1和P2二级结构的形成

发夹探针P1和P2使用25mM HEPES缓冲液配置，分别取100μL 0.5μM的发夹探针P1和P2于EP管中，采用逐步缓慢退火。

(3)微球功能化

取100μL亲和素功能化微球于1.5ml的EP管中，离心，去除上清液，用100μLBinding/wash缓冲液洗涤3次，离心，去上清，将微球重新悬浮于30μL Binding/Wash缓冲液中，加入10uL 1μM的生物素化的核酸适体核酶，终体积为40μL，于室温孵育30min，每隔5分钟轻轻搅拌一次，用100μL Binding/wash缓冲液洗涤三次，离心去上清，加入100μLBinding/Wash缓冲液4℃保存。

(4)ATP检测

取5μL核酸适体核酶功能化微球，加入2μL不同浓度的ATP溶液，13μL HEPES缓冲溶液，37℃孵育5h，3500rpm离心5min，HEPES缓冲溶液洗涤三次，离心去上清，加入25μL 0.5μM的发夹探针P1和发夹探针P2，37℃孵育6h，离心去上清，使用0.1％PBS洗涤两次后加入25mmol/L Tris缓冲溶液19μL，以及1μL 100μM/L hemin，在37℃条件下避光反应1h，离心后使用Tris缓冲溶液洗涤除去未反应的hemin，以降低背景吸光度，在hemin孵育后的微球中加入50μL 4mM的ABTS和50μL 4mM的H₂O₂，在37℃条件下反应8min，之后离心分离，取上层清液，进行吸收检测；选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm-A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为ATP浓度为0时的背景值；

所述25mM HEPES缓冲液配置方法如下：25mM HEPES，100mM NaCl，20mM MgCl₂，pH＝7.4；

所述Binding/wash缓冲液配置方法如下：20mM Tris-HCl，pH＝7.5，1M NaCl，1mMEDTA，0.0005％Triton X-100；

所述步骤(1)中逐步缓慢退火条件如下：95℃5min，60℃5min，40℃5min，30℃10min，20℃15min，4℃保存；

所述步骤(2)中逐步缓慢退火条件如下：90℃5min，70℃5min，50℃10min，40℃15min，25℃20min，取出室温下放置30min，4℃保存。

为了进一步阐述本发明，本发明的技术原理如下：

首先，构建以微球为载体，将设计的生物素修饰的核酸适体核酶探针通过生物素-亲和素结合固定在微球上，离心，去除未固定的核酸适体核酶探针。核酸适体核酶探针序列包含核酸适体序列(特异性识别待检测底物)、Mg²⁺依赖的10-23核酶序列、杂交链式反应的引发序列(如附图1-2所示)。在没有待检测底物的情况下，核酸适体核酶不能形成稳定的活性结构，不能进行分子内切割，因此也不能引发杂交链式反应。当待检测底物存在时(如附图3所示)，核酸适体结构域与底物结合并形成紧密的结构，能够促进催化核心中活性二级结构的形成从而激活核酸适体核酶。活化的核酸适体核酶能够从探针内部的切割位点切断探针链，释放杂交链式反应的引发序列。引发序列与发夹探针P1的3’端序列杂交并将发夹探针P1的茎部打开释放P1的5’端。发夹探针P1释放的5’端序列与发夹探针P2的5’端序列反向完全互补并打开发夹探针P2的茎部结构，发夹探针P2释放的3’端序列与发夹探针P1的3’端序列完全互补并打开发夹探针P1的茎部结构，释放其5’端序列，如此周而复始，在微球表面形成DNA纳米线。由于发夹探针P1、发夹探针P2的5’游离末端及3’游离末端都包含富G序列，而且在组装的纳米线上通过杂交链式反应相互拉近并折叠形成分子间裂分G-四链体，构建成含有串联排列G-四链体的DNA纳米线。在Hemin插入后显示出明显增强的类过氧化物酶的催化活性，该酶能催化H₂O₂与2,2’-联氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)之间的反应产生绿色的阳离子自由基ABTS^·+，在420nm处存在最大吸收峰。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明将核酸适体、Mg²⁺依赖的10-23核酶、杂交链式反应以及G-四链体-血红素DNA酶酶促反应结合起来，实现了检测信号的逐步放大，大幅度提高了检测的灵敏度，检测灵敏度可达pmol/L级别，高出现有技术通常检测灵敏度水平nmol/L级别3个数量级。

(2)进一步地，本发明所述的ATP核酸适体核酶探针完全自主设计，将ATP核酸适体、10-23核酶、G-四链体-血红素DNA酶整合成一条探针，ATP与核酸适体结合后启动10-23核酶的切割活性，切割后释放出杂交链式反应的引发序列，在2个发夹探针参与情况下自行组装具有串联排列分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的DNA纳米线，从而实现进一步信号放大，该探针工作性能优秀，检测灵敏度限为2pmol/L，特异性很好，常见的UTP、GTP、CTP等其它干扰物质对ATP检测基本不产生影响，能够满足医学临床诊断及机体代谢研究等对超高灵敏度的ATP检测方法需求。

(3)本发明不仅灵敏度高、特异性好，而且操作简单、成本低廉，无需大型昂贵设备，检测时间短，结果可迅速识别，判断准确，在产业中极具推广潜力和实际应用价值。

附图说明

图1为本发明所述核酸适体核酶探针结构示意图。其中，包含A、A’、B、C、C’、D、E、E’、F、G、H、H’、K部分组成的茎环结构，A与A’、C与C’、E与E’、H与H’部分分别互补配对，依次形成茎环B、D、F、G部分，茎环B为核酶序列，茎环F为核酸适体序列，K为核酶的切割位点，茎环G和H’部分为杂交链式反应的引发链序列。

图2为用于检测ATP的核酸适体核酶探针序列结构示意图。

图3为基于核酸适体核酶和分子间裂分G-四链体-氯化血红素DNA酶自组装纳米线的ATP检测原理示意图。

图4为检测不同浓度ATP的结果图。其中，当ATP浓度达到10nmol/L时检测信号达到饱和(图4A)；当ATP浓度在5pmol/L-1nmol/L之间时，呈良好的线性关系(图4B)，回归方程为A_420nm＝0.256C_ATP+0.099(C_ATP:nmol/L)，线性相关系数R²＝0.990。

图5为抗干扰能力分析结果图。其中，UTP、GTP、CTP为干扰分子，检验它们对ATP检测的干扰程度。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 ATP核酸适体核酶探针设计

(1)ATP核酸适体核酶探针结构如下：

第一行“CATCTCTTC”与第二行“GAAGAGATG”部分(附图1中A和A’部分)互补杂交形成分子内的茎部；第二行“TACTTAAACA”与“TGTTTAAGTA”部分(附图1中H和H’部分)互补杂交形成分子内的茎环G；第一行“AGCGATCTA”(SEQ ID NO.1)为10-23核酶序列(附图1中B部分)，第一行“GGGGGAGTATTGCGGAGGA”(SEQ ID NO.2)部分为ATP核酸适体序列(附图1中F部分)，第二行“AGAAGAAGGTGTTTAAGTA”(SEQ ID NO.3)部分(附图1中G和H’部分)为杂交链式反应的引发序列，当没有ATP存在时，该序列由于A和A’部分杂交而被封闭在分子内的茎部，不能引发杂交链式反应。

(2)P1探针结构如下：

5’AGGGCGGGTGGGTGTTTAAGTTGGAGAATTGTACTTAAACACCTTCTTCTTGGGT 3’(SEQ IDNO.5)

P1探针为发夹结构，下划线部分序列相互杂交形成发夹结构的茎部；P1探针5’端包含3组连续的GGG，3’端包含1组GGG。

(3)P2探针结构如下：

5’TGGGTCAATTCTCCAACTTAAACTAGAAGAAGGTGTTTAAGTTGGGTAGGGCGGG 3’(SEQ IDNO.6)

P2探针为发夹结构，下划线部分序列相互杂交形成发夹结构的茎部；P2探针5’端包含1组GGG，3’端包含3组连续的GGG。

实施例2对不同浓度ATP的检测

(1)ATP核酸适体核酶二级结构的形成

生物素修饰的核酸适体核酶使用25mM HEPES缓冲液(25mM HEPES,100mM NaCl20mM MgCl₂,pH＝7.4)配置。为了减少非发夹二聚体的产生以及提高发夹结构的形成比例，采用逐步缓慢退火。取100μL 1μM的生物素化核酸适体核酶于EP管中，逐步退火条件如下：95℃5min，60℃5min，40℃5min，30℃10min，20℃15min，4℃保存。

(2)发夹探针P1和P2二级结构的形成

发夹探针P1和P2使用25mM HEPES缓冲液(25mM HEPES,100mM NaCl 20mM MgCl₂,pH＝7.4)配置。分别取100μL 0.5μM的发夹探针P1和P2于EP管中，为了减少非发夹二聚体的产生以及提高发夹结构的形成比例，采用逐步缓慢退火。逐步退火条件如下：90℃5min，70℃5min，50℃10min，40℃15min，25℃20min，取出室温下放置30min，4℃保存。

(3)微球功能化

取100μL亲和素功能化微球(1％，10mg/mL)于1.5ml的EP管中，离心(3500rpm,5min)，去除上清液。用100μL Binding/wash缓冲液(20mM Tris-HCl，pH＝7.5，1M NaCl，1mMEDTA，0.0005％Triton X-100)洗涤3次，离心，去上清。将微球重新悬浮于30μL Binding/Wash缓冲液中，加入10uL 1μM的生物素化的核酸适体核酶，终体积为40μL。于室温孵育30min，每隔5分钟轻轻搅拌一次以保证充分结合。用100μL Binding/wash缓冲液洗涤三次，离心去上清。加入100μL Binding/Wash缓冲液4℃保存。

(4)ATP检测及其灵敏度

取5μL核酸适体核酶功能化微球，加入2μL不同浓度的ATP溶液，13μL HEPES缓冲溶液，37℃孵育5h，3500rpm离心5min，HEPES缓冲溶液洗涤三次，离心去上清(3500rpm，3min)。加入25μL 0.5μM的发夹探针P1和发夹探针P2，37℃孵育6h，离心去上清(3500rpm，3min)。使用0.1％PBS洗涤两次后加入25mmol/L Tris缓冲溶液19μL(100mmol/L NaCl、2mmol/LMgCl₂、5mmol/L KCl)以及1μL 100μM/L hemin，在37℃条件下避光反应1h；离心后使用Tris缓冲溶液洗涤除去未反应的hemin，以降低背景吸光度。在hemin孵育后的微球中加入50μLABTS(4mM)和50μL H₂O₂(4mM),在37℃条件下反应8min，之后离心分离，取上层清液，进行吸收检测。我们选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm-A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为ATP浓度为0时的背景值。

当ATP浓度达到10nmol/L时检测信号达到饱和，见附图4A；当ATP浓度在5pmol/L-1nmol/L之间时，呈良好的线性关系，见附图4B，回归方程为A_420nm＝0.256C_ATP+0.099(C_ATP:nmol/L)，线性相关系数R²＝0.990。以空白组的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为2pmol/L。

实施例3 ATP检测的特异性

为了检验传感体系对ATP检测的特异性，选取了3种其他干扰分子(UTP、GTP、CTP)并分别检验了它们对ATP检测的干扰程度。4种小分子化合物的浓度为1nmol/L，从结果来看，ATP的检测信号远大于其他干扰分子的检测信号，见附图5，这就表明了该技术体系对ATP具有很高的特异性，能够满足产业临床应用。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>湖南工程学院

<120>一种核酸适体核酶序列

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<223>人工序列

<400>1

AGCGATCTA

<210>2

<211>19

<212>PRT

<223>人工序列

<400>2

GGGGGAGTATTGCGGAGGA

<210>3

<211>19

<212>PRT

<223>人工序列

<400>3

AGAAGAAGGTGTTTAAGTA

<210>4

<211>99

<212>PRT

<223>人工序列

<400>4

TTTTTTTTTTCATCTCTTCAGCGATCTAGGGGGAGTATTGCGGAGGATAGCACCCATGTTACTTAAACAGAAGAAGGTGTTTAAGTATrAGGAAGAGATG

<210>5

<211>55

<212>PRT

<223>人工序列

<400>5

AGGGCGGGTGGGTGTTTAAGTTGGAGAATTGTACTTAAACACCTTCTTCTTGGGT

<210>6

<211>54

<212>PRT

<223>人工序列

<400>6

TGGGTCAATTCTCCAACTTAAACTAGAAGAAGGTGTTTAAGTTGGGTAGGGCGGGG

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 一种核酸适体核酶序列

<141> 2018-11-13

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

agcgatcta 9

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gggggagtat tgcggagga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

agaagaaggt gtttaagta 19

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

tttttttttt catctcttca gcgatctagg gggagtattg cggaggatag cacccatgtt 60

acttaaacag aagaaggtgt ttaagtatra ggaagagatg 100

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

agggcgggtg ggtgtttaag ttggagaatt gtacttaaac accttcttct tgggt 55

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

tgggtcaatt ctccaactta aactagaaga aggtgtttaa gttgggtagg gcgggg 56

Claims (10)

1.一种核酸适体核酶探针，其包含A、A’、B、C、C’、D、E、E’、F、G、H、H’、K部分组成的茎环结构，其中A与A’、C与C’、E与E’、H与H’部分分别互补配对，依次形成茎环B、D、F、G部分，茎环B为核酶序列，茎环F为核酸适体序列，K为核酶的切割位点，茎环G和H’部分为杂交链式反应的引发链序列，如图1所示；在核酸适体底物存在的情况下，核酸适体结构域茎环F与底物结合并形成紧密的结构，并促进核酶催化核心中活性二级结构的形成从而激活核酸适体核酶。

2.根据权利要求1所述的核酸适体核酶探针，所述A与A’部分的碱基数为5-15个；所述C与C’部分的碱基数为2-10个；所述E与E’部分的碱基数为2-10个；所述H与H’部分的碱基数为5-18个；所述茎环F部分的碱基数为6-35个，优选为10-20个；所述茎环G和H’部分的碱基数为10-30个；所述核酶为10-23核酶，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述杂交链式反应的引发链序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的核酸适体核酶探针，所述核酸适体序列为特异性识别ATP的核酸适体序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的核酸适体核酶探针，所述核酸适体核酶探针的序列如SEQ IDNO.4所示。

5.一种包括权利要求1-4任一项所述的核酸适体核酶探针的微球微载体，所述核酸适体核酶探针经过生物素修饰，并通过生物素-亲和素结合固定在所述微球上。

6.一种包括权利要求5所述的微球微载体的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒还包括发夹探针P1、P2，发夹探针P1的3’端与杂交链式反应的引发链序列3’端部分互补配对，发夹探针P1的5’端与发夹探针P2的5’端部分互补配对，发夹探针P2的3’端与发夹探针P1的3’端部分互补配对；所述发夹探针P1的序列如SEQ ID NO.5所示，所述发夹探针P2的序列如SEQ ID NO.6所示。

8.一种利用权利要求1-4任一项所述核酸适体核酶探针或权利要求5所述微球微载体或权利要求6-7任一项所述试剂盒在金属、多肽、蛋白、有机分子、核酸、大分子聚合物等检测上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述应用为在ATP检测中的应用。

10.一种利用权利要求1-4任一项所述核酸适体核酶探针或权利要求5所述微球微载体或权利要求6-7任一项所述试剂盒检测ATP的方法，包括如下步骤：

(1)ATP核酸适体核酶二级结构的形成

生物素修饰的核酸适体核酶使用25mM HEPES缓冲液配置，取生物素化核酸适体核酶于EP管中，逐步缓慢退火；

(2)发夹探针P1和P2二级结构的形成

发夹探针P1和P2使用25mM HEPES缓冲液配置，分别取发夹探针P1和P2于EP管中，采用逐步缓慢退火；所述发夹探针P1的序列如SEQ ID NO.5所示，所述发夹探针P2的序列如SEQID NO.6所示；

(3)微球功能化

取亲和素功能化微球于EP管中，离心，去除上清液，用Binding/wash缓冲液洗涤，离心，去上清，将微球重新悬浮于Binding/Wash缓冲液中，加入生物素化的核酸适体核酶，于室温孵育，每隔5分钟轻轻搅拌一次，用Binding/wash缓冲液洗涤，离心去上清，加入Binding/Wash缓冲液4℃保存；

(4)ATP检测

取核酸适体核酶功能化微球，加入不同浓度的ATP溶液，HEPES缓冲溶液，37℃孵育5h，离心去上清，再用HEPES缓冲溶液洗涤，离心去上清，加入发夹探针P1和发夹探针P2，37℃孵育6h，离心去上清，使用PBS洗涤两次后加入Tris缓冲溶液及hemin，在37℃条件下避光反应1h，离心后使用Tris缓冲溶液洗涤除去未反应的hemin，以降低背景吸光度，在hemin孵育后的微球中加入ABTS和H₂O₂，在37℃条件下反应8min，之后离心分离，取上层清液，进行吸收检测；选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm-A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为ATP浓度为0时的背景值；

所述Binding/wash缓冲液配置方法如下：20mM Tris-HCl，pH＝7.5，1M NaCl，1mMEDTA，0.0005％TritonX-100；

所述步骤(1)中逐步缓慢退火条件如下：95℃5min，60℃5min，40℃5min，30℃10min，20℃15min，4℃保存；

所述步骤(2)中逐步缓慢退火条件如下：90℃5min，70℃5min，50℃10min，40℃15min，25℃20min，取出室温下放置30min，4℃保存。