CN110468181A

CN110468181A - 一种双重扩增法检测dna或蛋白质的方法

Info

Publication number: CN110468181A
Application number: CN201910758302.8A
Authority: CN
Inventors: 刘卓靓; 王建方; 陶呈安; 邹晓蓉; 王芳; 黄坚; 李玉姣; 阳绪衡
Original assignee: National University of Defense Technology
Current assignee: National University of Defense Technology
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-11-19

Abstract

本发明公开了基于双重扩增法检测目标DNA或蛋白质的方法，包括如下步骤：（1）将待测样品与探针孵育，孵育条件为：20‑40℃，0.5‑1h；（2）将核酸内切酶加入，孵育条件为：20‑40℃，1‑3h；孵育时，核酸内切酶对探针进行切割，释放出含有3’OH的DNA片段。（3）加入末端转移酶（TdT）以及dNTP，DNA缺口端生成G四链体的长链DNA；（4）将经步骤（3）反应后的溶液加入MES缓冲以及高铁血红素（hemin），孵育15‑60min。再加入ABTS及H₂O₂用紫外检测。根据吸收光信号的强弱实现对目标DNA或蛋白质的检测。该方法是一种简便、信号放大、灵敏检测生物分子的新方法。

Description

一种双重扩增法检测DNA或蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及本发明属于生物技术领域，具体涉及双重扩增法检测微量DNA或蛋白质的生物分子检测方法。

背景技术

微量核酸或者蛋白质是常见的生物标志物，对其特异、灵敏检测对于突变分析、疾病早期诊断等具有重要意义。然而，检测低表达水平生物标志物是相当具有挑战性的。现有的生物标志物检测方法在实际应用中存在一些不足。例如，Northern Blotting灵敏度相对较低、操作耗时。免疫学方法需要较长的测试周期和相对较高的医疗条件。聚合酶链反应敏感度方面的明显优势，但可能的复制错误、严格的实验条件限制了其应用。因此，高灵敏度、低复杂性、成本低、方法简便，针对具体生物标志物的灵敏检测亟待发展。

视觉检测由于其检测现象明显、便于操作、成本较低引起了人们的特别兴趣。金纳米粒子由于其分散程度以及装配情况不同，导致局部表面等离子体共振中的不同，同时溶液的颜色从红色到蓝色，很容易观察到。金纳米粒子作为比色生物传感器的信号发生器在很多文献中报道。然而，金纳米粒子的合成需要严格的条件，尺寸控制也很困难，以及非特异性的金纳米粒子聚集导致假阳性信号输出等使得人们开始寻求更好的比色探针。近年来，鸟嘌呤四链体作为一种具有特殊功能的核酸结构引起了广大科研工作者的注意，基于鸟嘌呤四链体的比色法越来越受到重视。鸟嘌呤四链体可以与高铁血红素(hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的核酶，催化底物颜色的变化。但是目前已报道的基于鸟嘌呤四链体的方法，是通过将鸟嘌呤四链体的序列以发卡、双链封闭，或者以模板的互补链形式出现，如果前期的对于探针DNA处理不恰当，会导致鸟嘌呤四链体序列封闭不完全，从而引起较高的背景信号。而通过模板生成的鸟嘌呤四链体由于其在设计过程中要将互补序列引入设计中，一定程度增加了设计难度。因此，如何更方便的实现低浓度的核酸以及蛋白质的检测是一个急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在克服现有技术的不足，利用末端转移酶TdT生成的随机排列的鸟嘌呤四链体结合内切酶辅助放大功能，实现对目标分子检测的二次放大，提供一种基于双重扩增法超灵敏检测目标DNA和蛋白质的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种双重扩增法检测DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、将待测样品与识别探针或一起孵育，得到A溶液；

S2、在A溶液中加入核酸内切酶溶液孵育，得到B溶液；

S3、在B溶液中加入TdT以及dNTP，生成含G四链体的长链DNA的C溶液；

S4、在C溶液中加入MES缓冲液、血红素孵育后加入ABTS及H₂O₂进行检测。

优选的，所述待测DNA样品为含有限制性内切酶酶切位点的目标DNA。

优选的，所述DNA的识别探针的序列是与待测DNA的序列互补，所述DNA的识别探针的序列中含有限制性内切酶酶切位点。

所述内切酶种类以及酶切位点可参考NEB公司关于限制性内切酶产品网页(http://www.neb-china.com/technology.asp？SortID＝194)。

一种双重扩增法检测蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、将待测样品与识别探针、放大探针一起孵育，得到A溶液；

S2、在A溶液中加入核酸内切酶溶液孵育，得到B溶液；

所述蛋白质为具有对应核酸适配体的蛋白质。具体对应核酸适配体应用SELEX技术可特异性找出。

优选的，所述蛋白质的识别探针包含三个部分，第一部分为蛋白质对应核酸适配体序列；第二部分为限制性内切酶切刻位点；第三部分为封闭发夹序列；所述蛋白质的识别探针的连接顺序为核酸适配体序列-限制性内切酶切刻位点-封闭发夹序列。

所述蛋白质的放大探针的序列长度不超过20bp，所述蛋白质的放大探针被限制性内切酶切割成两段不超过10bp长的短片段，所述蛋白质的放大探针包含与蛋白质识别探针一致的限制性内切酶切刻位点。

由于切割后的放大探针的长度短，不能稳定与识别探针杂交，而游离到溶液中，又与识别探针杂交，接着被限制性内切酶Nb.BbvCI切断，形成更多的短片段，实现了第一重信号放大。

优选的，所述蛋白质为溶菌酶，所述溶菌酶对应的核酸适配体为：5’-GCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGC-3’(SEQ ID NO.9)；

优选的，所述蛋白质为anti-mucin-1(MUC-1)蛋白，所述MUC-1蛋白对应的核酸适配体为：5’-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAAGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC-3’(SEQ ID NO.10)；

优选的，所述蛋白质为human cardiac troponin I(重组人肌钙蛋白I)，所述重组人肌钙蛋白对应的核酸适配体Tn2为：

5’-GGCAGGAAGACAAACACCCAACCGAGGATGCAACGCTTGTTGTCATACTGTGATGTTGGTCTGTGGTGCTGT-3’(SEQ ID NO.11)；

优选的，所述蛋白质为凝血酶，所述凝血酶对应的凝血酶核酸适配体为：

5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’(SEQ ID NO.12)。

所述步骤S1中DNA或蛋白质的识别探针为针对检测目标具体设计。优选的，所述DNA或蛋白质的识别探针序列的3’端为非羟基基团封闭。

优选的，所述DNA或蛋白质的识别探针序列的3’端为磷酸、氨基、双脱氧碱基中的任一种基团封闭。

DNA或蛋白质的识别探针的3’端如果含有OH，TdT会以识别探针为引物进行扩增，从而导致极大的背景信号，无法有效对目标分子检测。此处用其他基团封闭识别探针，可以避免背景信号的产生。

优选的，所述DNA或蛋白质的识别探针的3’端为磷酸基团封闭。

磷酸基团是非羟基基团，不会被TdT作为扩增对象，不会产生背景信号。而且磷酸基团生物相容性好，性质稳定，更易修饰。

优选的，S1中A溶液体积为5-10μL，S2中B溶液中含有2～20个单位的限制性内切酶，S3中C溶液体积为10-15μL。

优选的，S2中孵育条件为20-40℃，1-3h。

孵育温度过低酶不能有效工作，切刻效率低导致信号低。而温度过高会导致酶失活，没有切刻产物，无信号输出。

优选的，C溶液中底物dNTP的浓度为1-10mM，TdT反应体系中含有2-10个单位的TdT。

优选的，按重量百分比计，S3中所述dNTP含有dGTP 55-65％，dATP 35-45％，dTTP10-0％。

优选的，按重量百分比计，S3中所述dNTP含有dGTP60％，dATP 40％。

在本发明的一个实施例中，dNTP含有dGTP 60％，dATP 40％时，TdT扩增产生的长链DNA形成的DNAzyme催化效率最高。

优选的，S4中加入ABTS为54.8-164.6μg，加入H₂O₂为3.4-10.2μg。

优选的，S4中所述检测的波长为410-420nm。

下面对本发明作进一步说明：

针对微量核酸和蛋白质检测难度高、检测限高等问题，本发明首次提出了基于双重扩增法超灵敏检测DNA或以凝血酶为代表的蛋白质的方法，利用核酸内切酶的切割放大以及TdT酶原位合成鸟嘌呤四链体实现微量核酸和蛋白质高灵敏检测的技术原理(图1)。将待测样品与探针混合孵育，加入对应的核酸内切酶启动切割步骤；然后在所得溶液继续加入dNTP底物以及TdT进行扩增，最后加入血红素，催化ABTS被H₂O₂氧化变色，利用吸光度的变化来实现目标物的检测。每10-15μL的TdT反应体系中含有2-12个单位的TdT；底物dNTP的质量含量组成为45％-55％dGTP，35％-45％dATP，5％-15％dTTP，优选地，底物dNTP的质量含量组成为60％dGTP，40％dATP；反应时间为60-180分钟，温度为20-40℃；选取吸光度波长为410nm-420nm。

该方法使用非标记、含有特定组成的dNTP作为TdT延伸单体，核酸内切酶切断的探针作为引物由TdT聚合生成长链DNA，此长链DNA可以形成连续多个的鸟嘌呤四链体结构，鸟嘌呤四链体结构高铁血红素(hemin)并能催化底物ABTS与H₂O₂的反应。

以检测微量核酸为例，目标DNA的序列为5’-GAA GGA CCT CTT ATT CGA TCC TTT-3’，对应的我们设计的识别探针为5’-AAA GGA TCG AAT AAG AGG TCC TTC-PO₄ ^3--3’。当没有目标DNA存在时，不会形成核酸内切酶的识别位点，不会启动切割步骤，此时由于所有探针都是由磷酸封闭3’端，不能作为TdT的合成引物，没有随机排列的鸟嘌呤四链体长链生成，也没有后续的催化信号。当有目标核酸存在时，目标核酸会与识别探针杂交，形成双链结构。此时，双链结构中含有切刻内切酶Nt.AlwI的特异性识别切刻位点(5'GGATCNNNN/N3'|3'CCTAGNNNNN 5'，“/”代表切刻位点，“N代表任意碱基)，切刻内切酶Nt.AlwI会切断识别探针中5’-AAA GGA TCG AAT/AAG AGG TCC TTC-PO₄ ^3--3’中T与A处，产生5’-AAA GGA TCGAAT-OH-3’以及5’-AAG AGG TCC TTC-PO₄ ^3--3’两个片段。此时由于识别探针被切断成两个短片段，双链杂交结构稳定性减弱，目标核酸会从原有的双链结构中解离下来，与新的识别探针杂交，这时候切刻内切酶Nt.AlwI又会进行下一轮的切刻，产生更多的5’-AAA GGA TCGAAT-OH-3’片段。此时，一个目标核酸的加入，由于切刻内切酶Nt.AlwI的对于多个探针核酸的切断产生多个短片段，实现了第一重信号放大。而含有3’OH的5’-AAA GGA TCG AAT-OH-3’片段可以作为下一步放大TdT的延伸引物，TdT可以聚合产生多个DNAzyme实现第二次信号放大。经过两次信号放大，可以实现对超微量目标核酸的检测。对于其他序列的目标核酸，可以根据目标核酸的序列特点，选择包含的限制性内切酶位点的酶以及设计对应的识别探针。

以检测微量蛋白为例，选取目标蛋白质为凝血酶，识别探针为：5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGCTGATTTTTGAGCCTCAGCAGTCACCC-PO₄ ^3-3’，放大探针为：5’-TTTTTAGACTGCTGAGGC-PO₄ ³-3’。其中识别探针包含三个部分，AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT(5’-3’)为凝血酶核酸适配体序列，能识别并结合凝血酶。第二部分是识别探针经过退火处理后，形成的发夹结构，含有一段13个碱基互补的茎部，起着封闭发夹的作用。第三部分是CCTCAGC(5’-3’)的限制性内切酶切刻位点，作为信号引发部分。当没有目标物凝血酶存在时，发夹处于关闭状态，不会与放大探针杂交，此时内切酶不会切割放大探针。当有目标物凝血酶存在时，识别探针结合凝血酶，打开发夹结构，再与放大探针杂交，此时限制性内切酶可以对放大探针切割，放大探针切成两段5’-TTTTTAGACTGC-OH-3’和5’-TGAGGC-PO₄ ³-3’，由于放大探针的长度减短，不能稳定与识别探针杂交，而游离到溶液中，接着新的放大探针又会与识别探针杂交，并被限制性内切酶Nb.BbvCI切断，形成更多的含有3’羟基端5’-TTTTTAGACTGC-OH-3’。此时，一个目标凝血酶的加入，由于切刻内切Nb.BbvCI对于多个探针核酸的切断产生多个短片段，实现了第一重信号放大。而含有3’OH的5’-TGAGGC-PO₄ ^3-3’片段可以作为下一步放大TdT的延伸引物，TdT可以聚合产生多个DNAzyme实现第二次信号放大。经过两次信号放大，可以实现对超微量蛋白的检测。对于其他待检测的目标蛋白，只需要对应的调整核酸适配体序列，再相应做出调整即可得到对应的识别探针，利用同样的原理实现检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、相对于单纯的核酸内切酶切刻放大检测信号的方法，本方法不需要对探针进行荧光标记或者其他纳米颗粒的修饰。利用TdT产生的DNAzyme为输出信号，相较于传统的DNAzyme为输出信号，单条核酸的信号增大，而且在探针设计中不需要提前加入DNAzyme的序列，减少序列设计的难度。

2、本方法还实现了“零”背景，避免了原有探针带有的DNAzyme序列产生的背景信号。而且TdT的聚合作用，使得信号可以再次放大，实现信号的二次放大。对于超微量目标的检测，提出了新的方法。

3、本发明构建的这种双重扩增体系，首次提出了非标记dNTP在TdT作用下形成鸟嘌呤四链体作为输出信号的新原理，结合内切酶的信号放大作用，较好地实现了对目标DNA与凝血酶的高灵敏、特异性检测。与传统方法相比，该方法具有零污染、低成本、较高灵敏度等优点，同时该方法设计操作处理简单，为各种核酸或蛋白质等的研究提供了有力手段。

附图说明

图1是本发明的图1为本发明的原理示意图；

图2为基于双重扩增法检测目标DNA检测结果图；

图3为基于双重扩增法检测目标DNA检测结果图(pM级别检测)；

图4为基于双重扩增法检测凝血酶检测结果图；

图5为对比例1检测目标DNA检测结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1检测目标DNA

1.目标物的识别

识别探针5’-AAA GGA TCG AAT AAG AGG TCC TTC-PO₄ ^3-3’(SEQ ID NO.1)；

目标核酸5’-GAA GGA CCT CTT ATT CGATCC TTT-3’(SEQ ID NO.2)；

在600μL离心管中，加入1μL浓度为15μM识别探针，1μL浓度为100nM目标核酸，2μL of 5×NBE buffer 4(100mM Tris-Ac,50mM Mg(Ac)₂，250mM KAc,pH 7.9)缓冲液，以及6μL超纯水，用10μL的移液枪混匀，在58℃水浴孵育5分钟。

2.内切酶放大检测

5分钟后，在离心管中加入8个单位的Nt.AlwI，并在此温度孵育2小时。将核酸内切酶加入，再37℃孵育2小时；孵育时，核酸内切酶对探针进行切割，释放出含有3’OH的DNA片段5’-AAA GGA TCG AAT-OH-3’(SEQ ID NO.3)。2小时后，将离心管在80℃中水浴中孵育20分钟来终止切刻反应。

3.酶法生成随机G四链体

将按步骤2处理的样品加入5μL的TdT反应液，其中含有4个单位的TdT；1μL 10mM的底物dNTP(底物dNTP的质量含量组成为60％dGTP，40％dATP)，1μL 5×TdT反应缓冲液在37℃中反应2小时(保持湿润环境)，得到富含G四链体的长链DNA。2小时后，将样品置于70℃中10分钟，终止切刻反应。

4.检测过程

将经步骤(3)反应后的溶液加入50μL的2.5×MES buffer(浓度为250mM MES-Tris,100mM KCl,and 0.125％Triton X-100,pH 5.5)缓冲，1μL浓度为10μM的hemin(溶于DMSO)以及15μL的水孵育30分钟。检测时，再加入10μL浓度为20mM ABTS及10μL浓度为20mM H₂O₂用紫外分光光度计检测415nm处采集4分钟内吸光度的变化。试验结果如图2和图3所示。

实施例2检测凝血酶

1.目标物的识别

识别探针为：

5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTGCTGATTTTTGAGCCTCAGCAGTCACCC-PO₄ ^3-3’(SEQID NO.4)；

放大探针为：5’-TTTTTAGACTGCTGAGGC-PO₄ ³-3’(SEQ ID NO.5)；

识别探针以及放大探针由申请人根据凝血酶本身的特点设计具体序列。其中识别探针包含三个部分，AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT(5’-3’)为凝血酶核酸适配体序列，能识别并结合凝血酶。第二部分是CCTCAGC(5’-3’)的限制性内切酶切刻位点，作为信号引发部分。第三部分是识别探针经过退火处理后，形成的发夹结构，含有一段13个碱基互补的茎部，起着封闭发夹的作用。放大探针的序列长度不超过20bp，放大探针被限制性内切酶切割成两段不超过10bp长的短片段，放大探针包含与蛋白质识别探针一致的限制性内切酶切刻位点。再将设计的具体序列也就是具体碱基组成发给生工生物工程(上海)有限公司(www.sangon.com)公司合成相应的探针。

在600μL离心管中，加入1μL浓度为0.1μM识别探针，1μL浓度为3μM放大探针，1μL浓度为0.3μM凝血酶，1μL的5×Tris-Ac buffer(100mM Tris-Ac,500mM NaAc,100mM KAc,10mM Mg(Ac)2,pH 8.0)缓冲液，以及1μL超纯水，用10μL的移液枪混匀，在37℃水浴孵育1小时。

2.内切酶放大检测

1小时后，在离心管中加入4个单位的Nb.BbvCI(并在此温度孵育2小时。将核酸内切酶加入，再37℃孵育45分钟；孵育时，核酸内切酶对探针进行切割，释放出含有3’OH的DNA片段，5’-TTTTTAGACTG-OH-3’(SEQ ID NO.6)。45分钟后，将离心管在80℃中水浴中孵育20min来终止切刻反应。

3.酶法生成随机G四链体

4.检测过程

将经步骤(3)反应后的溶液加入50μL的2.5×MES buffer(浓度为250mM MES-Tris,100mM KCl,and 0.125％Triton X-100,pH 5.5)缓冲，1μL浓度为10μM的hemin(溶于DMSO)以及15μL的水孵育30min。检测时，再加入10μL浓度为20mM ABTS及10μL浓度为20mM H₂O₂用紫外分光光度计检测415nm处采集4分钟内吸光度的变化。试验结果如图4所示。

对比例1检测目标DNA

1.目标物的识别

识别探针：

5’-CCCTACCCGAGTCTTCCAGTGTGATGAGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’(SEQ IDNO.7)；

目标核酸5’-TCATCACACTGGAAGACTC-3’(SEQ ID NO.8)；

在200μL离心管中，加入10μL浓度为1μM识别探针，1μL浓度为100nM目标核酸，5μL 10×NEBuffer 3,(1M NaCl,500mM Tris-HCl,100mM MgCl₂,10mM DTT,pH 7.9)缓冲液，用10μL的移液枪混匀，在58℃水浴孵育5分钟。

2.内切酶放大检测

5分钟后，在离心管中加入10个单位的N.BstNB I，在55℃孵育1小时；孵育时，核酸内切酶对探针进行切割，释放出含有G四链体序列。1小时后，将离心管在90℃中水浴中孵育10分钟来终止切刻反应，得到溶液A。

3.DNAzyme形成

加入5μL浓度为1μM Hemin到溶液A，再加缓冲溶液B100μL(50mM HEPES,40mM KCl,400mM NaCl,0.1％Triton X-100and 2％DMSO；pH 8.0)以及超纯水到总体积为200μL，将此溶液孵育一个小时。

4.检测过程

一小时后，加入终浓度为2mM的ABTS以及H₂O₂至步骤(3)反应后的记录在波长419nm处吸光度变化。试验结果如图5所示。

如图2、3、4、5结果所示。从实验结果分析，对比例1见图5，本发明见图2以及图3。首先，从背景信号来看，对比例1由于利用G四链体直接作为信号分子，在原始检测溶液中就存在，所以导致背景信号比较高，吸光度在0.2以上。而我们的方法，是利用TdT合成的四链体，背景信号只有0.03左右。这对于比色法检测尤为重要，更适合传感器的开发。其次，从检测限分析，我们本发明的检测限为0.386pM，而对比例2为1pM，因此本发明的灵敏度更高，更精准。最后，从检测范围分析，我们的方法可以实现0.001-2nM的目标DNA的线性检测，而对比例2的检测范围为1-100pM，检测的范围小。因此本发明的适用性更广。

究其原因，对比例1利用G四链体作为信号分子，对目标DNA进行检测。相比与我们的方法，对比例1直接将G四链体序列结合在识别探针上，这样的设计可能会带来几个问题。第一，识别探针封闭G四链体效果不佳引起的高背景信号。利用识别探针的发夹部分对G四链体部分杂交从而封闭G四链体，而没有信号。但是如果发夹结构形成不好，或者其他核酸酶将发夹切断，都会是的G四链体部分释放带来背景信号。第二，一个识别探针只对应一个G四链体，只有切刻酶引起的单重信号放大，检测浓度有限。相比于对比例1，我们的方法利用TdT聚合生成的G四链体为信号分子，识别探针不含G四链体序列，不会带来背景信号，并且减少设计过程的复杂性。由于TdT生成的长链DNA含有多个连续的G四链体结构，可以实现检测过程的二次放大，大大降低检测限。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军国防科技大学

<120> 一种双重扩增法检测DNA或蛋白质的方法

<130> 11

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aaaggatcga ataagaggtc cttc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaaggacctc ttattcgatc cttt 24

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaaggatcga at 12

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agtccgtggt agggcaggtt ggggtgactg ctgatttttg agcctcagca gtcaccc 57

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tttttagact gctgaggc 18

<210> 6

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tttttagact g 11

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccctacccga gtcttccagt gtgatgaggg tagggcgggt tggg 44

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tcatcacact ggaagactc 19

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gcagctaagc aggcggctca caaaaccatt cgcatgcggc 40

<210> 10

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gggagacaag aataaacgct caagcagttg atcctttgga taccctggtt cgacaggagg 60

ctcacaacag gc 72

<210> 11

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ggcaggaaga caaacaccca accgaggatg caacgcttgt tgtcatactg tgatgttggt 60

ctgtggtgct gt 72

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29

Claims

1.一种双重扩增法检测DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、将待测样品与识别探针一起孵育，得到A溶液；

S2、在A溶液中加入核酸内切酶溶液孵育，得到B溶液；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中识别探针的序列的3’端封闭基团选自磷酸、氨基、双脱氧碱基中的任意一种，所述DNA的识别探针的序列是与待测DNA的序列互补，所述DNA的识别探针的序列中含有限制性内切酶酶切位点。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测DNA样品为含有限制性内切酶酶切位点的目标DNA。

4.一种双重扩增法检测蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S2、在A溶液中加入核酸内切酶溶液孵育，得到B溶液；

S4、在C溶液中加入MES缓冲液、血红素孵育后加入ABTS及H₂O₂进行检测；

所述蛋白质为具有对应核酸适配体的蛋白质。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的识别探针包含三个部分，第一部分为蛋白质对应核酸适配体序列；第二部分为限制性内切酶切刻位点；第三部分为封闭发夹序列；所述蛋白质的识别探针的连接顺序为核酸适配体序列-限制性内切酶切刻位点-封闭发夹序列。

6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的放大探针的序列长度不超过20bp，所述蛋白质的放大探针被限制性内切酶切割成两段不超过1 0bp长的短片段，所述蛋白质的放大探针包含与蛋白质识别探针一致的限制性内切酶切刻位点。

7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白质为溶菌酶、凝血酶、anti-mucin-1 (MUC-1) 蛋白、重组人肌钙蛋白I中的任意一种。

8. 如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述S2中B溶液中含有2-20个单位的限制性内切酶，所述S2中孵育条件为20-40℃，1-3h。

9.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述C溶液中底物dNTP的浓度为1-10mM，TdT反应体系中含有2-10个单位的TdT。

10. 如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，按重量百分比计，S3中所述dNTP含有dGTP 55-65%，dATP 35-45%，dTTP 0-10%，所述S4中加入ABTS为54.8-164.6 μg，加入H₂O₂为3.4-10.2 μg。