CN109182598B - 一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法 - Google Patents

一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，带有部分CGMMV序列的T1和带有Mg2+‑依赖的DNAzyme的部分酶序列的P1杂交，AcⅡ识别其底物序列5′‑AACGTT‑3′，后者被剪切成两部分，随后解链为4个ssDNA片段，加入脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)及dCTP，进行加尾反应，生成Mg2+‑依赖的DNAzyme的完整酶序列。然后再加入HP，HP的环部位与Mg2+‑依赖的DNAzyme的酶序列进行杂交，在Mg2+存在下，Mg2+‑依赖的DNAzyme酶序列剪切其识别位点，将HP的茎环结构剪切为两部分，位于茎部位的G‑四连体结构被释放，在K+存在下，结合Hemin形成Hemin/G‑四连体结构，在H2O2存在下，催化ABTS2‑氧化，使溶液变绿。溶液吸光度与CGMMV浓度呈正相关。

Description

一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测 方法
技术领域
本发明属于光学生物传感技术领域，具体涉及一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法。
背景技术
黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)是一种侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒，受侵染的瓜类作物在生长点周围表现出绿色斑驳等症状，CGMMV可以通过机械或通过种子传播，导致黄瓜，甜瓜和西瓜等经济作物的严重减产。由于葫芦科种子在国际贸易流通较大，因此CGMMV的传播风险很高。此外，西瓜碎片中的CGMMV在土壤中能存活10个月，表明被该病毒污染的土壤很难补救。严格的入境检测是防止这种检疫病原体进口的有效手段。因此，迫切需要快速、廉价、灵敏、特异的检测方法来检测CGMMV。
传统的病毒检测方法有血清学检测、电镜、聚合酶链反应(PCR)和电化学检测等。然而，这些方法有一些固有的缺点，血清学检测由于其操作简单且能同时处理大量样品而被广泛采用，但需要购买价格昂贵的血清学检测试剂盒，并且检测结果的准确性取决于抗体的质量。电镜检测则需的大型和笨重的仪器，费力，不敏感，而且耗时。
可视化检测因其简单、灵敏度高、直观等优点而受到人们的广泛关注。与病毒相关的比色检测已被报道，包括禽流感、H5N1流感病毒、乙型肝炎病毒、寨卡病毒和裂谷热病毒，但是对于植物病毒的可视化检测报道较少。
发明内容
针对以上存在的技术问题，本发明提供一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法。
本发明的技术方案为：一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，包括以下步骤：
(1)将T1和P1混合在NEB CutSmart缓冲溶液中，在37℃下杂交；
(1)(2)加入内切酶AcⅡ，利用AcⅡ识别5′-AACGTT-3′位点，在37℃下持续反应一定时间，获得酶切产物，37℃下解链为4个ssDNA片段；
(3)取一定量的所述酶切产物，加入TdT、dCTP于磷酸盐缓冲溶液中混合，在37℃反应温度条件下进行加尾反应，升温至85℃灭活3min，获得Mg2+-依赖的DNAzyme的完整酶序列；
(4)加入HP和含Mg2+缓冲液，在37℃下孵育100min，Mg2+-依赖的DNAzyme的完整酶序列与HP进行杂交，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP剪切为两部分；
(5)加入一定浓度的Hemin和含K+缓冲液，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G-四连体结构溶液；
(6)最后依次在Hemin/G-四连体结构溶液中加入一定浓度的ABTS2-和H2O2溶液，室温下反应一段时间，得到绿色溶液。
最后依次在Hemin/G-四连体结构溶液中加入一定浓度的ABTS2-和H2O2溶液，室温下反应一段时间，得到绿色溶液。进一步地，所述T1的基因序列如SEQ ID No.1所示，P1的基因序列如SEQ ID No.2所示，HP的基因序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.1：AACCCGAACGTTTG，SEQ ID No.2：ACACACAGCGATCACCCATGTTAAACGTTCGGGTT，SEQ ID No.3：TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC。
更进一步地，P1包括三个区域，具体为：
1)第1-25位，部分Mg2+-依赖DNAzyme部分酶序列；
2)第24-29位，AcⅡ酶识别序列；
3)第23-35位，与CGMMV cDNA的互补序列。
更进一步地，HP包括三个区域，具体为：
1)第1-26位，G-四连体结构序列；
2)第19-34位，环序列，Mg2+-依赖DNAzyme底物序列；
3)第10-18位和第35-43位，茎序列。
进一步地，步骤(1)中所述P1浓度为1.0μM。
进一步地，步骤(4)中所述HP浓度为1.0μM。
进一步地，步骤(2)中所述AcⅡ的酶切反应时间为50min。
进一步地，步骤(3)中所述加尾反应时间为30min。
进一步地，步骤(4)中所述Mg2+-依赖的DNAzyme和HP的杂交时间为100min。
本发明的工作原理为：T1和P1杂交后形成一条dsDNA，通过内切酶AcⅡ识别dsDNA上的5′-AACGTT-3′位点，在37℃下将dsDNA剪切为两部分，并解链为4个ssDNA片段。在TdT和dCTP存在下，进行加尾反应，构建成Mg2+-依赖的DNAzyme。然后再加入HP和Mg2+，HP第10-18位和第35-43位的茎环段与Mg2+-依赖的DNAzyme进行杂交，得到环杂交产物，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP的茎环结构剪切为两部分，形成G-四连体结构，在K+结合Hemin形成Hemin/G-四连体结构，在H2O2存在的情况下，催化ABTS2-氧化，使溶液变绿。当不存在T1时，AcⅡ不能对单链P1进行酶切，也就不能够合成Mg2+-依赖的DNAzyme，因此不能对HP进行剪切，也就不能够形成G-四连体结构，因此溶液中的颜色变化不明显，由此实现特异性检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)催化dCTP加尾到ssDNA片段的3′端，不需要DNA作为模板，即可获得合成DNA，因此得到的产物也不会与模板进行杂交结合，影响进一步反应。经试验证明，本发明的检测体系线性范围为0.1pM-2nM，最低检测限为0.1pM。总之，本发明具有简单、直接、成本低、特异性好、灵敏度高、反应速度快、干扰性小等优点。
附图说明
图1是本发明的反应原理流程图；
图2是本发明实施例3的可行性分析PAGE电泳图，其中，泳道1是T1，泳道2是P1，泳道3是T1和P1混合物，泳道4是P1中加入5U AcⅡ，泳道5是在T1和P1混合物中加入5U AcⅡ，泳道6是在T1和P1混合物中加入5U AcⅡ，10U TdT和10mM dCTP；
图3是本发明实施例3的在Hemin(0.6μM，10％DMSO)，H2O2(2mM)，ABTS2-(2mM)，和KCl(10mM)条件下检测溶液吸光度的光谱图，其中，a是空白，b是不存在T1，c是在T1(0.2nM)；
图4是本发明实施例2的吸光度与T1浓度关系图，其中，T1浓度从a到h的箭头表示0、0.1pM、0.25pM、1pM、2.5pM、25pM、0.2nM、2nM；
图5是本发明实施例2的吸光度与T1浓度对数之间的线性相关图，误差线表示3次试验标准差；
图6是本发明实施例4的选择性结果图，其中(1)T1，(2)单碱基错配组，(3)二碱基错配组，(4)健康西瓜苗基因组和(5)空白对照组；
图7是本发明实施例5对不同病毒的选择性结果图，其中，(1)T1、(2)CGMMV，(3)6种病毒混合物，包括CGMMV，WMV，CMV，SMV，ZYMV和SqMV，(4)WMV，(5)CMV，(6)SMV，(7)ZYMV，(8)SqMV，(9)健康西瓜幼苗；
图8是本发明实施例6中不同P1浓度与吸光度关系图；
图9是本发明实施例7中不同HP浓度与吸光度关系图；
图10是本发明实施例8中AcⅡ的酶切反应时间与吸光度关系图；
图11是本发明实施例9中加尾反应时间与吸光度关系图；
图12是本发明实施例10中Mg2+-依赖的DNAzyme和HP的杂交时间与吸光度关系图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，其原理步骤如图1所示，包括以下步骤：
(1)将2μL T1(0、0.1pM、0.25pM、1pM、2.5pM、25pM、0.2nM、2nM)和2μLP1(1.0μM)混合在1×NEB内切酶缓冲溶液中，在37℃下杂交120min；所述T1的基因序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1：AACCCGAACGTTTG，P1的基因序列如SEQ ID No.2所示，SEQ ID No.2：ACACACAGCGATCACCCATGTTAAACGTTCGGGTT，P1包括三个区域，具体为：1)第1-25位，Mg2+-依赖DNAzyme部分酶序列；2)第24-29位，AcⅡ酶识别序列；3)第23-35位，与CGMMV cDNA的互补序列。
(2)加入5.0U的内切酶AcⅡ，利用AcⅡ识别5′-AAGCTT-3′位点，在37℃下持续反应50min，获得酶切产物，37℃下解链为4个ssDNA；
(3)取20μL的所述酶切产物，加入10U TdT、10mMdCTP、0.25mM CoCl2于1×缓冲溶液(50μL)中混合，在37℃反应温度条件下加尾反应30min，然后升温至85℃灭活3min，获得Mg2+-依赖的DNAzyme完整酶序列的混合液；
(4)在所述Mg2+-依赖的DNAzyme的反应混合液中加入HP和含Mg2+缓冲液，在37℃下孵育40min，Mg2+-依赖的DNAzyme与HP进行杂交100min，得到杂交产物，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP剪切为两部分；HP的基因序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3：TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC。HP包括三个区域，具体为：1)第1-26位，G-四连体结构序列；2)第19-34位，Mg2+-依赖DNAzyme底物序列；3)第10-18位和第35-43位，茎环结构中茎序列。
(5)加入Hemin(0.6μM，10％DMSO)和KCl(10mM)，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G-四连体结构溶液；
(6)最后依次在Hemin/G-四连体结构溶液中加入一定浓度的ABTS2-(2mM)和H2O2(2mM)溶液，室温下反应一段时间，得到不同程度的绿色溶液。
实施例2
不同T1浓度(0、0.1pM、0.25pM、1pM、2.5pM、25pM、0.2nM、2nM)条件下的溶液吸光度检测：
利用NanoDrop 2000(美国，Thermo)仪器对实施例1中步骤(6)最后得到的溶液进行吸光度测量，测定该溶液在390～490nM波长范围内的吸收光谱。由图4可知，荧光强度随T1浓度的增加而增大，并且由图5可看出荧光强度和T1浓度在0.1pM-2nM范围内呈良好的线性关系，线性方程为：A＝1.013+0.07356lg C，最低检测限为0.1pM。
实施例3
在Mini-Sub Cell GT电泳槽的1-6号泳道中依次加入T1、P1、T1和P1混合物、P1中加入5U Ac II、T1和P1混合物中加入5U Ac II、T1和P1混合物中加入5U Ac II，10U TdT和10mM dCTP，进行PAGE电泳分析。结果如图2所示，1号泳道和2号泳道的两条不同的带分别对应于T1和P1，当T1和P1都存在的时候，在3号泳道观察到一条新的带，为T1/P1的杂交条带。在T1不存在的情况下，4号泳道只有一条带，显示P1不能被AcⅡ剪切。然而，在第5号泳道观察到了一条新的带，表明AcⅡ能够剪切T1/P1杂交后的dsDNA，当TdT和dCTP加入AcⅡ的酶切产物时，在第6号泳道观测到瀑布状带，表明加尾反应成功。
以实施例1为参照，其中，T1的浓度为0.2nM，设置两个对照组，编号为a是空白，b是不存在T1，c是在T1(0.2nM)，其余条件均相同，分别在Hemin(0.6μM，10％DMSO)，H2O2(2mM)，ABTS2-(2mM)，和KCl(10mM)条件下检测溶液吸光度，结果如图3所示，在样品a和b中没有观察到明显的比色信号，表明在不存在T1的情况下，不能够获得阳性信号。然而在T1存在下，色度信号急剧增加，表明只有在T1存在下，才能观察到浅绿色。
实施例4
为了评估本发明所提供的检测方法对CGMMV cDNA检测的特异性，开展了对照实验：采用完全互补的T1、单碱基错配的T1、双碱基错配的T1，完全不互补的西瓜幼苗DNA以及空白对照组，单碱基错配的T1、双碱基错配的T1基因序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，SEQ ID No.4：AACCCGAACGTTAG，SEQ ID No.5：AACCCGAACGTAAG，下划线表示错配碱基。结果如图4所示，双碱基错配的T1、完全不互补的西瓜幼苗DNA的荧光强度与空白对照组的相近，单碱基错配的T1存在时，检测溶液的荧光强度比空白对照组有增强，但是当完全互补的T1存在时，检测溶液的荧光强度与空白对照组的荧光强度相比有显著的增强。由此可见，本发明可区别完全互补和非互补的目标DNA，即使只有一个碱基的差异也能够识别，具有良好的特异性。
实施例5
为了评估本发明所提供的检测方法对CGMMV cDNA的选择性，利用不同病毒cDNA进行检测。反转录反应：取10μl 2×SuperMix，2μL OligodT，8μL病毒RNA，病毒RNA包括黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、大豆花叶病毒(SMV)、西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)，在42℃下反应1h，然后在85℃下加热3min，使逆转录酶失活。用西瓜幼苗基因组DNA提取试剂盒提取健康西瓜基因组，6个病毒基因组和西瓜基因组浓度均稀释至20ng/μL，并在-80℃下保存。
开展实验：以(1)T1、(2)CGMMV、(3)6种病毒cDNA混合液(CGMMV+WMV+CMV+SMV+SMV+ZYMV+SqMV)、(4)WMV、(5)CMV、(6)SMV、有7)ZYMV、(8)SqMV、(9)健康西瓜幼苗的顺序制作成9组待测样本，分别进行分光光度法检测，结果如图5所示，含有CGMMV基因组的(1)-(3)组的吸光度相差不大，均有明显地增强，而不含CGMMV基因组的(4)-(9)组的吸光度微弱。由此可知，本发明的检测方法对CGMMV cDNA有良好的选择性。
实施例6
研究不同P1浓度对吸光度的影响，其中，T1的浓度为0.2nM：
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用NanoDrop 2000(美国，Thermo)仪器测量光谱的变化，实施例1与6个对照组的P1浓度与吸光度如表1所示：
表1：各组的P1浓度值与吸光度
组别 P1浓度 吸光度
实施例1 1.0μM 0.275Abs
对比例1 0.2μM 0.03Abs
对比例2 0.4μM 0.095Abs
对比例3 0.6μM 0.18Abs
对比例4 0.8μM 0.225Abs
对比例5 1.2μM 0.285Abs
对比例6 1.4μM 0.29Abs
以P1浓度值为横坐标，以吸光度为纵坐标，做折线图，如图8所示。从图8中可以看出，检测到的吸光度随着P1浓度值在0.2-1.0μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，吸光度趋于稳定。由此可知，P1浓度值最佳为1.0μM。
实施例7
研究不同HP浓度对吸光度的影响，其中，T1的浓度为0.2nM：
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用NanoDrop 2000(美国，Thermo)仪器测量光谱的变化，实施例1与6个对照组的HP浓度与吸光度如表2所示：
表2：各组的HP浓度值与吸光度
Figure GDA0001858258350000081
Figure GDA0001858258350000091
以P1浓度值为横坐标，以吸光度为纵坐标，做折线图，如图9所示。从图9中可以看出，检测到的吸光度随着HP浓度值在0.2-1.0μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，吸光度趋于稳定。由此可知，HP浓度值最佳为1.0μM。
实施例8
研究AcⅡ的酶切反应时间对吸光度的影响，其中，T1的浓度为0.2nM：
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用NanoDrop 2000(美国，Thermo)仪器测量光谱的变化，实施例1与6个对照组的AcⅡ的酶切反应时间与吸光度如表3所示：
表3：各组的AcⅡ的酶切反应时间与吸光度
组别 AcⅡ的酶切反应时间 吸光度
实施例1 50min 0.28Abs
对比例1 10min 0.025Abs
对比例2 20min 0.095Abs
对比例3 30min 0.18Abs
对比例4 40min 0.25Abs
对比例5 60min 0.285Abs
对比例6 70min 0.29Abs
以AcⅡ的酶切反应时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，做折线图，如图10所示。从图10中可以看出，检测到的吸光度随着AcⅡ的酶切反应时间在10-50min区间内增大而增大，当AcⅡ的酶切反应时间超过50min后，吸光度趋于稳定。由此可知，AcⅡ的酶切反应时间最佳为50min。
实施例9
研究加尾反应时间对吸光度的影响，其中，T1的浓度为0.2nM：
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用NanoDrop 2000(美国，Thermo)仪器测量光谱的变化，实施例1与6个对照组的加尾反应时间与吸光度如表4所示：
表4：各组的加尾反应时间与吸光度
组别 加尾反应时间 吸光度
实施例1 30min 0.27Abs
对比例1 10min 0.03Abs
对比例2 15min 0.095Abs
对比例3 20min 0.18Abs
对比例4 25min 0.235Abs
对比例5 35min 0.275Abs
对比例6 40min 0.28Abs
以加尾反应时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，做折线图，如图10所示。从图10中可以看出，检测到的吸光度随着加尾反应时间在10-30min区间内增大而增大，当加尾反应时间超过30min后，吸光度趋于稳定。由此可知，加尾反应时间最佳为30min。
实施例10
研究Mg2+-依赖的DNAzyme完整酶序列和HP的杂交时间对吸光度的影响，其中，T1的浓度为0.2nM：
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用NanoDrop 2000(美国，Thermo)仪器测量光谱的变化，实施例1与6个对照组的Mg2+-依赖的DNAzyme完整酶序列和HP的杂交时间与吸光度如表5所示：
表5：各组的加尾反应时间与吸光度
Figure GDA0001858258350000101
Figure GDA0001858258350000111
以Mg2+-依赖的DNAzyme和HP的杂交时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，做折线图，如图11所示。从图11中可以看出，检测到的吸光度随着Mg2+-依赖的DNAzyme完整酶序列和HP的杂交时间在20-100min区间内增大而增大，当Mg2+-依赖的DNAzyme完整酶序列和HP的杂交时间超过100min后，吸光度趋于稳定。由此可知，Mg2+-依赖的DNAzyme完整酶序列和HP的杂交时间最佳为100min。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法
<130> 无
<141> 2018-09-05
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> T1的基因序列
<400> 1
aacccgaacg tttg 14
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> P1的基因序列
<400> 2
acacacagcg atcacccatg ttaaacgttc gggtt 35
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(44)
<223> HP的基因序列
<400> 3
ttttgggttg ggcgggatgg gtttatragg tgtgtatccc gccc 44
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> 单碱基错配T1的基因序列
<400> 4
aacccgaacg ttag 14
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> 双碱基错配T1的基因序列
<400> 5
aacccgaacg taag 14

Claims (1)

1.一种基于脱氧核苷酸末端转移酶TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将T1和P1混合在NEB CutSmart缓冲溶液中，在37℃下杂交；
(2)加入内切酶AcⅡ，利用AcⅡ识别5′-AACGTT-3′位点，在37℃下持续反应一定时间，获得酶切产物，37℃下解链为4个ssDNA片段；
(3)取一定量的所述酶切产物，加入TdT和dCTP于磷酸盐缓冲溶液中混合，在37℃下进行加尾反应，升温至85℃灭活3min，获得Mg2+-依赖的DNAzyme的完整酶序列；
(4)加入HP和含Mg2+缓冲液，在37℃下孵育100min，Mg2+-依赖的DNAzyme的完整酶序列与HP进行杂交，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP剪切为两部分；
(5)加入一定浓度的Hemin和含K+缓冲液，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G-四连体结构溶液；
(6)最后依次在Hemin/G-四连体结构溶液中加入一定浓度的ABTS2-和H2O2溶液，室温下反应一段时间，得到绿色溶液；
所述T1的基因序列如SEQ ID No.1所示，P1的基因序列如SEQ ID No.2所示，HP的基因序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.1：AACCCGAACGTTTG，SEQ ID No.2：ACACACAGCGATCACCCATGTTAAACGTTCGGGTT，SEQ ID No.3：TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC；
步骤(1)中所述P1浓度为1.0μM；
步骤(4)中所述HP浓度为1.0μM；
步骤(2)中所述AcⅡ的酶切反应时间为50min；
步骤(3)中所述加尾反应时间为30min；
步骤(4)中所述Mg2+-依赖的DNAzyme和HP的杂交时间为100min。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106167835A (zh) * 2016-06-29 2016-11-30 临沂大学 黄瓜绿斑驳病毒rt‑lamp检测试剂盒及检测方法
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106167835A (zh) * 2016-06-29 2016-11-30 临沂大学 黄瓜绿斑驳病毒rt‑lamp检测试剂盒及检测方法
CN107604042A (zh) * 2017-09-22 2018-01-19 山东师范大学 基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法
CN110468181A (zh) * 2019-08-16 2019-11-19 中国人民解放军国防科技大学 一种双重扩增法检测dna或蛋白质的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sensitive electrochemical assay of alkaline phosphatase activity based on TdT-mediated hemin/G-quadruplex DNAzyme nanowires for signal amplification;Yunqing Liu et,al.;<Biosensors and Bioelectronics>;20171231;第87卷;第970-975页 *
碱性磷酸酶和朊蛋白新型电化学生物传感器研究;刘云清;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20180715;B014-711 *

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