CN106167835A - 黄瓜绿斑驳病毒rt‑lamp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种黄瓜绿斑驳病毒RT‑LAMP检测试剂盒及检测方法，所述检测方法包括以下步骤：S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris‑HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并作为RNA模板；S2使用设计的上游引物、下游引物及环引物，构建RT‑LAMP反应体系；S3将所述RT‑LAMP反应体系，置于59℃水域中，反应60分钟，得到反应液；S4对所述反应液进行检测。

Description

黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，具体黄瓜绿斑驳(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)RT-LAMP引物组的建立，CGMMV RT-LAMP检测试剂盒的应用。
背景技术
黄瓜绿斑驳病毒为正单链RNA病毒，病毒全长约6.5kb，主要侵染西瓜、黄瓜、甜瓜等葫芦科作物，在黄瓜上产生的典型症状为叶片上出现色斑、水泡及变形，植株矮化，产量损失达15％，受感染果实通常没有症状，但有些株系能够使果实严重变形及色斑，有些亚洲株系在叶片上并不出现症状但造成产量下降。在西瓜上部叶片产生轻花叶，但在果实中却造成严重的变色或使果实内部腐，是这些作物上的检疫病害之一。CGMMV主要通过接触、种子等方式传播，也可通过啤酒菟丝子、桃蚜、棉蚜及带病残留物传播。
环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根据目的基因的6个特异区域，设计4-6条特异性引物，利用Bst DNA聚合酶在60～65℃等温条件下特异地扩增目的基因。LAMP扩增反应可在60分钟之内完成，其扩增产物是和靶标反向重复的茎环结构以及多环的菜花样结构，反应过程中产生大量焦磷酸根离子，并形成焦磷酸镁白色沉淀。LAMP方法可以通过多种方法判断结果，如反应后体系内是否存在白色沉淀物、电泳结果是否具有梯状条带、加入SYBR Green Ⅰ是否变成绿色等，具有检测灵敏度高，检测方法简单快速、仪器要求不高等特点。然而就引物设计方面，目前报道的文献多是以在线方式(Primer Explore)设计引物，应用范围受到限制，根据LAMP原理自行设计多组引物组，通过实验结果选取最适引物组，构建LAMP检测方法，这样将会大大增加LAMP的适用范围，具有更为广泛的应用前景。
自LAMP技术建立以来，该技术已经广泛应用于对病菌、寄生虫等的检测，近年来在动物病毒的检测研究中逐渐推广起来，然而对于植物病毒如黄瓜绿斑驳病毒还没有相应的检测试剂盒的报 道，因此开发一种针对黄瓜绿斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒具有重要的应用价值。
发明内容
CGMMV检测主要有DTBIA、ELSA、RT-PCR、RT-nested PCR、real-time RT-PCR等方法。DTBIA灵敏度较低；而RT-PCR、RT-nested PCR和real-time RT-PCR核酸检测技术需要昂贵的专业仪器，且核酸扩增的时间较长。
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测方法。本发明人在坚持不懈的努力之下，发明了一种快速提取RNA待测样品的方法，并结合自己设计的引物，使用RT-LAMP检测方法，能够快速有效地检测出黄瓜绿斑驳病毒。
本发明提供
(1)一种黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物为：
(2)如(1)所述的试剂盒，还包括黄瓜绿斑驳病毒的RNA的快速提取液，所述快速提取液由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成。
(3)如(2)所述的试剂盒，其中，所述二甲基甲硫胺的体积浓度为6％。
本发明还提供如下检测黄瓜绿斑驳病毒的方法，
(4)一种黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤
S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并作为RNA模板；
S2使用如(1)所述试剂盒，构建RT-LAMP反应体系，所述反应体系为20μL，包括：2×反应缓冲液(RM)10μL，酶溶液(EM)0.8μL，40pmol/μL上游引物FIP 0.8μL，40pmol/μL上游引物BIP0.8μL，10pmol/μL下游引物F3 0.4μL，10pmol/μL下游引物B3 0.4μL，浓度均为20pmol/μL的环引物LB0.8μL，RNA模板1.6μL，及去离子水(DW)4.4μL；
S3将所述RT-LAMP反应体系，置于59℃水域中，反应60分钟，得到反应液；
S4对所述反应液进行检测。
(5)如(4)所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述二甲基甲硫胺的体积浓度为6％。
(6)如(4)所述的RT-LAMP检测方法，其中所述S4步骤中是在所述反应液中加入加入钙黄绿素荧光染料，通过反应管内所产生的颜色变化判断检测结果。
本发明根据CGMMV的基因序列设计RT-LAMP引物，通过实验最终建立了CGMMV的RT-LAMP检测方法，为CGMMV的检测提供了一种快速高效、特异灵敏的新方法，灵敏度高，比普通RT-PCR灵敏度高10倍；并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。该方法适用于现场CGMMV的快速检测。本研究的目的就是研制该病毒的快速高效、灵敏特异的检测技术，与以往研究的方法形成一个不同层次的检测体系，使检测人员根据不同条件和目的可以进行广泛有效的选择，为瓜类种苗检验检疫、种子认证及生产田的病害监测提供有效的技术支持。
附图说明
图1最佳反应温度扩增曲线。
图2特异性实验中扩增曲线结果。
图3特异性试验中颜色反应结果。
具体实施方式
为解决上述技术问题，设计1套用于检测CGMMV的引物组，包括正向外引物F3-3的序列为SEQ ID NO.1，反向外引物B3-3的序列为SEQ ID NO.2；正向内引物FIP-3的序列为SEQ ID NO.3，反向内引物BIP-3的序列为SEQ ID NO.4；以及环引物LB，具体序列见表1。
表1引物序列
Loopamp RNA扩增反应试剂盒、Loopamp反应管、Loopamp FD荧光检测试剂购自日本荣研化学株式会社，RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其他试剂均为常规分析纯试剂。采用日本荣研化学株式会社生产的LA-320C实时浊度仪。
试验例1核酸提取
分别称取感染CGMMV病毒或未感染的(对照用)的黄瓜叶片0.1g，或者用镊子获取相当于0.1g大小的黄瓜叶片作为实验用材料。
RNA提取方法1：使用RNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取样品总RNA，具体操作按试剂盒说明进行。本试验具体使用了QIAGEN Rneasy Mini kit提取RNA，也可以采取其它试剂盒进行提取，或者通常实验室提取方法提取RNA。
RNA提取方法2：采用本发明的试剂盒，更加快速简便地提取RNA粗提液。具体是用镊子取黄瓜新生叶片约0.1g，迅速置于研砵中，研砵中预先加入含有10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成的提取液5mL，并迅速研磨3min，然后静置2min，取1.6μL作为RNA模板。所述镊子、研砵、研磨棒及其它试验用具需要在DEPC水中浸泡12小时后，150度烘烤6小时，然后取出放置于4℃冷藏备用。含有10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺的1M Tris-HClpH7.5溶液为事先配好，高温高压消毒处理后，放置于4℃冷藏备用。移液抢的枪头以及各种反应管均使用RNase-free产品。
所述10％的乙酸乙酯的浓度是指100ml溶液中，含有10g乙酸乙酯，二甲基甲硫胺的浓度同样。
试验例2RT-LAMP体系的建立及优化
RT-LAMP反应体系按照Loopamp RNA扩增试剂盒说明，反应体系为20μL，包括：2×反应缓冲液(RM)10μL，酶溶液(EM)0.8μL，40pmol/μL引物FIP 0.8μL，40pmol/μL BIP0.8μL，10pmol/μL F3 0.4μL，10pmol/μL B3 0.4μL，LB(浓度均为20pmol/μL)0.8μL，RNA模板1.6μL， 及去离子水(DW)4.4μL。反应温度分别设为59、61、63和65℃，反应时间为60min。扩增反应在实时浊度仪上进行，根据60min内出现扩增曲线的最短时间确定最佳反应温度。
黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)、马铃薯X病毒(PVX)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)及阴性对照(NC)的总RNA和水(作为空白对照，用BC表示)为模板进行RT-LAMP反应，体系中同时加入1.0μL钙黄绿素荧光染料(即Loopamp FD荧光检测试剂)，验证该方法的特异性。
RT-LAMP扩增产物(1)实时扩增曲线检测：扩增进行时，如果有产物出现，反应液会产生一定的浊度；浊度仪会将浊度信号收集，以扩增曲线的形式反映，从而对结果进行判断。(2)染料颜色反应检测：在LAMP反应体系中加入1μL Loopamp FD试剂，反应结束后，肉眼观察反应液的荧光颜色反应。显绿色判断为阳性反应；若显橙色判断为阴性反应。
结果与分析
1.最佳提取液的确定
分别配制二甲基甲硫胺浓度为2％、4％、6％、8％、10％的并含有10％乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液，配制方法为在100mL的容量瓶中，加入10g乙酸乙酯，以及2、或4、或6、或8、或10g的二甲基甲硫胺，然后加入已经配好的1M Tris-HCl(pH7.5)并定容，得到二甲基甲硫胺浓度为2％(或4％、或6％、或8％、或10％)的并含有10％乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液。按照上述RNA提取方法2进行提取，并使用分光光度计测量A260和A280的值，计算A260/A280比值，Rneasy Mini kit提取RNA作为阳性对照，其结果见表2。
表2不同方法得到的RNA溶液的A260/A280比值
因此，本实施例中均使用二甲基甲硫胺浓度为6％并含有10％乙酸乙酯的1MTris-HCl(pH7.5)溶液提取样品RNA，但这并不限定于该浓度，本领域技术人员应该理解，其它浓度的溶液所提取到的RNA同样可以用于本发明的检测，并取得同样检测效果。
2.最佳反应温度的确定
以RNA提取方法2得到的总RNA为模板，进行RT-LAMP反应，实时浊度仪输出的扩增时间曲线结果如图2。由图中曲线可以看出，RT-LAMP在59、61、63和65℃的反应温度下，分别在约34、36、42和48min时产生了扩增曲线。根据现场检测时间尽可能短的要求，确定59℃为最佳反应温度。
3.RT-LAMP特异性实验
黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)、马铃薯X病毒(PVX)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)阳性材料及健康黄瓜叶片(阴性对照，用NC表示)为临沂大学生物试验中心保存的标本，从-30℃冰箱中取出这些标本，直接用镊子取出约0.1g叶片，按照本发明的RNA提取方法2得到总RNA。以总RNA为模板进行RT-LAMP反应，温度为61℃，时间为60min。体系中加入钙黄绿素荧光染料以使得反应结束后可以通过反应管内所产生的颜色变化判断是否扩增，结果如图3所示。由图3可以看出，只有CGMMV能够检测到扩增曲线，其他样品在反应时间内都未检测到扩增曲线。反应结束后，加入CGMMV总RNA的反应管显绿色，判断为阳性；而其他反应管均显橙色，判断为阴性。扩增曲线结果与颜色反应的结果一致，表明本研究所建立的RT-LAMP检测方法具有高度的特异性，检测结果十分准确。
本发明在建立CGMMV的RT-LAMP检测方法过程中，采用了日本Eiken Chemical公司研发配制的LoopampRNA扩增试剂盒，简化了实验反应前的准备工作，同时保证了实验的质量。在结果分析方面，研究使用了LA-320C实时浊度仪，可对实验结果定量分析。另外，通过在RT-LAMP反应体系中加入试剂盒配套的钙黄绿素荧光染料，使得不开盖也可观察到反应所产生的颜色变化，避免了二次污染，保证了结果的准确性。另外，使用本发明的RNA快速提取液，可以在现场快速检测，并现场得到结果，而不需要进入实验室使用Rneasy Mini kit提取RNA。本发明的RNA快速提取液为二甲基甲硫胺浓度为6％并含有10％乙酸乙酯的1MTris-HCl(pH7.5)溶液，虽然在本发明中能够快速提取CGMMV病毒RNA的机理还不明确，但是根据分析，由于其具有高极性，能够使CGMMV病毒RNA快速释放，并在RNA分解前加入到RT-LAMP反应体系，从而能够顺利作为模板，进行RT-LAMP扩增。该机理将在今后的试验中作进一步的阐明。
在建立针对某种病毒LAMP检测方法时，最重要的是特异引物的设计，而引物是否特异决定于 所选序列的比对结果是否特异。因此，一定要在引物设计的前期做好充足的准备工作，利用序列分析软件将目的序列筛选好，然后将序列进行手动处理后再上传至引物设计服务器设计引物，才能够得到较为理想的引物组。在进行结果检测方面，若有条件尽量使用实时浊度仪，可以对结果进行定量分析，保证结果的准确性；同时，在进行结果检测时，一定尽量避免开盖检测，防止产生二次污染导致假阳性结果出现。

Claims (6)

1.一种黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物为：
上游外引物FIP序列SEQ ID NO.3；上游内引物BIP序列SEQ ID NO.4；
下游外引物F3序列SEQ ID NO.1；下游外引物B3序列SEQ ID NO.2；
以及环引物LB序列SEQ ID NO.5。
2.如权利要求1所述的试剂盒，还包括黄瓜绿斑驳病毒的RNA的快速提取液，
所述快速提取液由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述二甲基甲硫胺的浓度为6％。
4.一种黄瓜绿斑驳病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤
S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并作为RNA模板；
S2使用如权利要求1所述试剂盒，构建RT-LAMP反应体系，所述反应体系为20μL，包括：2×反应缓冲液10μL，酶溶液0.8μL，40pmol/μL上游引物FIP 0.8μL，40pmol/μL上游引物BIP0.8μL，10pmol/μL下游引物F3 0.4μL，10pmol/μL下游引物B3 0.4μL，20pmol/μL环引物LB0.8μL，RNA模板1.6μL，及去离子水4.4μL；
S3将所述RT-LAMP反应体系，置于59℃水域中，反应60分钟，得到反应液；
S4对所述反应液进行检测。
5.如权利要求4所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述二甲基甲硫胺的浓度为6％。
6.如权利要求4所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述S4步骤中是在所述反应液中加入加入钙黄绿素荧光染料，通过反应管内所产生的颜色变化判断检测结果。
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