CN104031997B - 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的lamp引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。本发明针对甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计得到一组引物组F3/B3和FIP/BIP，由该引物组或含有该引物组的试剂盒通过环介导等温扩增（LAMP）检测甘蔗黑穗病菌，具有成本低、易操作、简单、快速、检测结果直观、肉眼可判断、灵敏度高、特异性强等优点，本发明适用于基层部门甘蔗引种检疫、脱毒种苗质量检测及甘蔗黑穗病田间早期检测等，具有广泛和实际的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
由甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害，也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害，其主要传播途径是在种苗或种茎带有甘蔗黑穗病菌，甘蔗黑穗病菌在甘蔗存放和种植过程中扩散传染。甘蔗黑穗病最典型的症状是蔗茎生长点变异产生黑色鞭状物，是甘蔗病害中最容易诊断的病害，但其发病潜伏期较长，早期无症状的甘蔗小苗或甘蔗种茎一般方法难以准确诊断其是否感染或携带甘蔗黑穗病。因此，探索其快速检测技术对甘蔗引种检疫、病害早期诊断及抗病品种快速筛选等及其重要。
目前，对于甘蔗黑穗病已建立的检测方法有：分生组织染色技术（Nallathambi P, Padmanaban P, Mohanraj D. Histological staining: an effect method for sugarcane smut screening [J]. Sugar Cane, 1998(2):10-13）、ELISA快速检测技术（Nallathambi P, Padmanaban P, Mohanraj D. Standardization of an indirect ELISA technique for detection of u.scitamineasyd., causal agent of sugarcane smut disease [J]. Journal of Mycology and Plant pathology, 2001, 31(1):76-78）；PCR检测技术等。
随着分子生物技术的发展，PCR检测技术也得到的广泛的应用，专利号为201010230534.5的发明专利公开了一种甘蔗黑穗病菌快速检测方法，该方法使用真菌ITS通用引物，其检测特异性极差，灵敏度有限，在黑穗病菌感染量小时无法准确检测出；专利号为201110218585.0的发明专利公开了一种甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，这种PCR检测方法主要包括以下步骤：步骤1：采用CTAB法提取甘蔗黑穗病菌基因组总DNA；步骤2：以甘蔗黑穗病菌基因组总DNA为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5进行第一轮PCR扩增；步骤3：以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-L1和Smut-R2经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；步骤4：对第二轮PCR扩增产物进行凝胶电泳分析。这种方法虽然能检测出甘蔗是否感染黑穗病菌，但该方法要经过两轮PCR扩增，需要PCR仪、电泳仪及凝胶成像系统等昂贵的专业仪器及分子生物学专业实验人员操作，限制了该检测方法的推广应用。
环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等（2000）发明的一种新型体外等温扩增特异核酸判断的技术（Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al.,2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12): e63），随着LAMP技术的发展，已成功应用LAMP技术检测病毒、细菌、真菌以及寄生虫等病原的检测（刘永生，丁耀忠，张杰。环介导等温扩增（LAMP）技术的应用研究[J]，2010,26（8）：87-89）。
LAMP法具有特异性强，快速、高效，敏感性高，操作简便，检测方法简单等优点，肉眼即可判断结果，从而简化了检测过程，检测时间也大大缩短。目前尚未见应用LAMP技术用于检测甘蔗黑穗病菌的相关技术报道。
发明内容
本发明针对现有技术中甘蔗黑穗病菌检测方法存在成本高、特异性低、步骤繁琐、易污染等缺点，提供一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组。
本发明的第二个目的是提供一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP试剂盒。
本发明的第三个目的是提供一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP检测方法。
本发明所述引物组或试剂盒特异性的检测甘蔗黑穗病菌，所述检测方法具有成本低、易操作、简单、快速、特异性强，灵敏度高等特点，适合于基层农技部门对甘蔗黑穗病菌的田间快速检测。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种用于检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组，所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。
所述引物组针对甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列进行设计。
一种用于检测甘蔗黑穗病菌的LAMP试剂盒，所述试剂盒含有上述引物组。
优选地，所述试剂盒还含有基因组DNA提取液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品、稳定液和显色液；所述LAMP反应液除含有上述引物组还含有Bst DNA聚合酶和检测基础液。
优选地，所述基因组DNA提取液为CTAB提取液，CTAB提取液的成分参照本领域常规配方即可。优选地，所述CTAB提取液的配方为：2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0)，1.4 mol/L NaCl。
优选地，所述检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱。
更优选地，所述检测基础液为终浓度为1.3～1.5 mmol/L dNTPs、0.6～0.9 mmol/L甜菜碱和7～9 mmol/L MgSO4。
更优选地，检测基础液为终浓度为1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mmol/L甜菜碱和8 mmol/L MgSO4。
优选地，所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组DNA；所述阴性对照品为无菌水。
优选地，所述稳定液为石蜡油；优选地，所述显色液为SYBR Green I。
优选地，所述试剂盒的反应体系为：基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3/B3引物各0.5μL，1.6 μmol/L的 FIP/BIP引物各1μL；所述检测基础液为终浓度为1.3～1.5 mmol/L dNTPs、0.6～0.9 mmol/L 甜菜碱和7～9 mmol/L MgSO4。
优选地，所述试剂盒的反应程序为63～65℃ 1 h，80～82℃ 5 min，4℃保存；更优选地，所述试剂盒的反应程序为65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存。
本发明还提供了利用上述引物组或上述试剂盒检测甘蔗黑穗病菌的方法，包括以下步骤：
S1. 基因组DNA提取：处理甘蔗得到甘蔗黑穗病菌基因组总DNA；
S2. 配制反应体系，在反应体系中加入稳定液，在反应管内壁加入显色液；所述稳定液的加入量为45～50 μL，显色液的加入量为1.5～2 μL；
S3. 环介导等温扩增：以基因组总DNA为模板，利用引物组经扩增得到扩增产物；所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；所述扩增反应的程序为63～65℃ 1 h，80～82℃ 5 min，4℃保存；
S4. 扩增产物检测：利用显色法对扩增产物进行分析；观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有甘蔗黑穗病菌；反应产物变为橙色，则不含有甘蔗黑穗病菌。
优选地，S1所述甘蔗黑穗病菌基因组总DNA的提取通过CTAB法利用CTAB提取液提取得到。
CTAB提取液的配方为：2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0)，1.4 mol/L NaCl。
作为一种优选方式，利用上述引物组或试剂盒检测甘蔗黑穗病菌的方法，包括以下步骤：
S1. 基因组DNA提取：采用CTAB法处理甘蔗心片，得到甘蔗黑穗病菌基因组总DNA；
S2. 环介导等温扩增：以基因组总DNA为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计的内外两对特异引物F3、B3（外引物对）和FIP、BIP（内引物对）经过扩增得到扩增产物；
F3：5`- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3`；
B3：5`-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3`；
FIP：5`- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3`；
BIP：5`- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3`；
反应体系：总体系25μL，其中，基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3、B3引物各0.5 μL，1.6 μmol/L的 FIP、BIP引物各1 μL；另外在每PCR管反应体系上面加稳定液50μL，PCR管盖内壁加显色液2 μL；
所述扩增程序为：65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存；
S3. 扩增产物检测：采用显色法对得到的扩增产物进行分析。
优选地，所述检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱。
更优选地，所述检测基础液的所述检测基础液终浓度为1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mmol/L 甜菜碱和8 mmol/L MgSO4。
优选地，所述稳定液为石蜡油；所述显色液为SYBR Green I。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）成本低、易操作、简单：本发明最大的优点是不需要以往PCR检测所需要的PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等昂贵的专业仪器，仅需一台廉价的恒温仪器，如水浴锅；本发明省去了繁琐的操作步骤和规程，简单易行。
（2）快速：应用本发明检测方法，可在1～1.5h得到检测结果，而以往的PCR或巢式PCR检测需4～6h才可得到检测结果；本发明所述方法多大缩短了操作时间，方便快速。
（3）检测结果直观，肉眼可判断：本发明扩增产物可通过加显色剂进行染色，绿色为阳性，即待测样品中含甘蔗黑穗病菌，橙色为阴性，说明待测样品中不含黑穗病菌；肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像。
（4）减少假阳性：本发明所述显色液在等温扩增前已加在PCR管内壁，这样避免扩增后开盖加反应液，气溶胶污染，可大大减少假阳性产生。
（5）灵敏度极高：本发明最低检测限量不超过5 fg甘蔗黑穗病菌基因组DNA，可检测出无症状甘蔗苗是否携带甘蔗黑穗病菌。
（6）特异性强：本发明设计的引物组是该技术的关键，该引物组针对甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计得到。因此在检测过程中不会检测出甘蔗梢腐病菌、玉米黑粉菌、甘蔗宿根矮化病菌、甘蔗眼点病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗白条病菌，特异性强，准确率高。
本发明适用于基层部门甘蔗引种检疫、脱毒种苗质量检测及甘蔗黑穗病田间早期检测等，具有广泛和实际的应用价值。
附图说明
图1为基因组DNA扩增产物染色结果图；
图2为LAMP试剂盒的特异性检测；
图3为LAMP试剂盒的灵敏性检测。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
实施例1 引物设计
本发明根据甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列重新设计引物，共有一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP。引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。
上述2对引物序列如下：
F3：5`- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3`；
B3：5`-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3`；
FIP：5`- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3`；
BIP：5`- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3`。
实施例2 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法
使用实施例1所述引物对，建立甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法，具体步骤如下：
S1. 基因组DNA提取：2014年4月田间采集甘蔗品种新台糖22号蔗苗心叶9片（有甘蔗黑穗病早期症状，但黑穗未抽出），采用CTAB法用基因组DNA提取液对每片小苗心叶进行甘蔗黑穗病菌基因组总DNA提取，得到样品并依次编号为样品2～10；
S2. 配制反应体系：总体系25μL，其中，基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3、B3引物各0.5 μL，1.6 μmol/L的 FIP、BIP引物各1 μL。另外在每PCR管反应体系上面加稳定液石蜡油50μL，PCR管盖内壁加显色液SYBR Green I 2 μL/体系；
S3. 环介导等温扩增：分别以样品2～10及甘蔗黑穗病菌基因组DNA（阳性对照，标记为1号）及ddH2O（阴性对照，标记为11号）为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计的内外两对特异引物F3、B3（外引物对）和FIP、BIP（内引物对）经过扩增得到扩增产物；
所述扩增反应的程序为：65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存；
其中，所述基因组DNA提取液为CTAB提取液，其配方为：2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0)，1.4mol/L NaCl；
其中，检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱，其配方是终浓度分别为1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mmol/L甜菜碱和8 mmol/L MgSO4；
S4. 扩增产物检测：扩增反应结束后，将PCR管倒置并轻轻振荡，使PCR管盖内的显色液与扩增产物充分混合染色，图1为染色结果。
根据图1中染色结果判断检测结果，绿色为阳性，即待测样品中含有甘蔗黑穗病菌，橙色为阴性，即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。本实施例中2～10号样品结果显示表明：9个样品及阳性对照均为阳性（绿色），检测出甘蔗黑穗病菌，而阴性对照为阴性（橙色）。
对比例1 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法
使用实施例2所述方法检测甘蔗黑穗病菌，唯一不同的是所使用的引物组不同。本对比例中所使用的引物组为一对外引物对F3b/B3b和一对内引物对FIPb/BIPb，该引物组的序列为：
F3b：5`- GTCGCGTCCAGCTTCTTG -3`；
B3b：5`- ATTACGAAAGAGCTGGCGG -3`；
FIPb：5`- TCGACTTTTGGCCCATCTTCCCATCCTCACCACCAAAGTCCT -3`；
BIPb：5`- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC -3`。
使用上述引物组进行甘蔗黑穗病菌的LAMP快速检测，结果显示：9个样品及阳性对照均为阴性（橙色），检测不出甘蔗黑穗病菌。
说明使用该对比例中的引物组无法检测出甘蔗黑穗病菌。
对比例2 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法
使用实施例2所述方法检测甘蔗黑穗病菌，唯一不同的是所使用的引物组不同。本对比例中所使用的引物组为一对外引物对F3c/B3c和一对内引物对FIPc/BIPc，该引物组的序列为：
F3c：5`- GGCCCTCAAATAGGCATG -3`；
B3c：5`- ACATTTTACGACTGGTAATGC -3`；
FIPc：
5`- TGAATTGCAGAAGTGAATCATCGAACCAGATTAGATCTGCAAGGA -3`；
BIPc：
5`- CGCAATTCGCTGCGTTCTTCGGTCGTCTAAAATCTAAAAAACAAC -3`。
使用上述引物组进行甘蔗黑穗病菌的LAMP快速检测，结果显示：9个样品及阳性对照均为阴性（橙色），检测不出甘蔗黑穗病菌。
说明使用该对比例中的引物组无法检测出甘蔗黑穗病菌。
实施例3 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测试剂盒的建立
按下列组成配制甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测试剂盒：
含有基因组DNA提取液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品、稳定液、显色液。
其中，LAMP反应液含有两对特异引物F3/B3（外引物对）和FIP/BIP（内引物对）、Bst DNA 聚合酶、检测基础液。
其中，检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱，其配方是终浓度为1.3~1.5 mmol/L dNTPs、0.6~0.9 mmol/L 甜菜碱和7~9 mmol/L MgSO4。
其中，试剂盒中所述基因组DNA提取液为CTAB提取液，其配方为：2 % CTAB，20mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0)，1.4mol/L NaCl。
其中，试剂盒中所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组DNA；所述阴性对照品为无菌水。
其中，试剂盒中所述稳定液为石蜡油；所述显色液为SYBR Green I。
本发明对上述条件进行了优化，最终确定该试剂盒的反应体系为：基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3/B3引物各0.5μL，1.6 μmol/L的 FIP/BIP引物各1μL。另：每PCR管反应体系上面加稳定液石蜡油50μL，PCR管盖内壁加显色液SYBR Green I 2 μL/体系。
上述基因组DNA通过常见的CTAB法提取得到。
上述LAMP试剂盒的反应条件为：65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存。
上述LAMP扩增产物的检测：所述扩增反应结束后，将PCR管倒置并轻轻振荡，使PCR管盖内的显色液与扩增产物充分混合染色，根据染色结果判断检测结果，绿色为阳性，即待测样品中含有甘蔗黑穗病菌，橙色为阴性，即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。
所述试剂盒还包括一份使用说明书，所述试剂盒分装为20次反应/盒。
实施例4 所述LAMP试剂盒的特异性检测
对实施例3所述LAMP试剂盒进行特异性检测，步骤如下：
S1. 基因组DNA提取：2014年3月通过CTAB法利用基因组DNA提取液分别提取5株不同地理来源的甘蔗黑穗病菌、1株甘蔗赤腐病菌、1株甘蔗眼点病菌、1株甘蔗梢腐病菌、1株甘蔗宿根矮化病菌、1株甘蔗白条病菌、及1株玉米黑粉菌基因组DNA，得到样品并依次编号为1～11；
S2. 配制反应体系：总体系25μL，其中，基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3、B3引物各0.5 μL，1.6 μmol/L的 FIP、BIP引物各1 μL。另外在每PCR管反应体系上面加稳定液石蜡油50μL，PCR管盖内壁加显色液SYBR Green I 2 μL/体系；
S3. 环介导等温扩增：分别以样品1～11及ddH2O（阴性对照，标记为12号）为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计的内外两对特异引物F3、B3（外引物对）和FIP、BIP（内引物对）经过扩增得到扩增产物；
F3：5`- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3`；
B3：5`-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3`；
FIP：5`- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3`；
BIP：5`- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3`。
所述扩增反应的程序为：65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存。
其中，检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱，其配方是终浓度为1.4mmol/L dNTPs、0.8mmol/L甜菜碱和8mmol/L MgSO4。
其中，试剂盒中所述基因组DNA提取液为CTAB提取液，其配方为：2% CTAB，20mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0)，1.4mol/L NaCl。
其中，试剂盒中所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组DNA。
S4. 扩增产物检测：扩增反应结束后，将PCR管倒置并轻轻振荡，使PCR管盖内的显色液与扩增产物充分混合染色，图2为染色结果。
根据图2中染色结果判断检测结果，绿色为阳性，即待测样品中含有甘蔗黑穗病菌，橙色为阴性，即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。本实施例中1～12号样品结果显示表明：1～5样品（不同地理来源的甘蔗黑穗病菌）阳性（绿色），检测出甘蔗黑穗病菌，而6～11样品及阴性对照为阴性（橙色）。检测结果表明该引物组及试剂盒对甘蔗黑穗病菌具有很好的特异性。
实施例5 所述LAMP试剂盒的灵敏性检测
对实施例3所述LAMP试剂盒进行灵敏性检测，步骤如下：
S1. 模板基因组DNA质量梯度：2014年3月采用10倍稀释法，获得20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL系列质量梯度甘蔗黑穗病菌基因组DNA，得到样品并依次编号为1～8；
S2. 配制反应体系：总体系25μL，其中，基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3、B3引物各0.5 μL，1.6 μmol/L的 FIP、BIP引物各1 μL。另外在每PCR管反应体系上面加稳定液石蜡油50μL，PCR管盖内壁加显色液SYBR Green I 2 μL/体系；
S3. 环介导等温扩增：分别以样品1～8及ddH2O（阴性对照，标记为9号）为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计的内外两对特异引物F3、B3（外引物对）和FIP、BIP（内引物对）经过扩增得到扩增产物；
F3：5`- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3`；
B3：5`-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3`；
FIP：5`- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3`；
BIP：5`- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3`。
所述扩增反应的程序为：65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存。
其中，检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱，其配方是终浓度为1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mmol/L甜菜碱和8 mmol/L MgSO4。
其中，试剂盒中所述基因组DNA提取液为CTAB提取液，其配方为：2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0），1.4 mol/L NaCl。
其中，试剂盒中所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组DNA。
S4. 扩增产物检测：扩增反应结束后，将PCR管倒置并轻轻振荡，使PCR管盖内的显色液与扩增产物充分混合染色，图3为染色结果。
根据图3中染色结果判断检测结果，绿色为阳性，即待测样品中含有甘蔗黑穗病菌，橙色为阴性，即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。本实施例中1～9号样品结果显示表明：1～8样品（不同质量浓度的甘蔗黑穗病菌基因组DNA）阳性（绿色），检测出甘蔗黑穗病菌，而阴性对照为阴性（橙色）。检测结果表明该引物组对甘蔗黑穗病菌基因组DNA的最低检测限量不超过5fg/25μL反应体系。
实施例6 所述LAMP试剂盒检测甘蔗黑穗病菌
应用参照实施例3制备得到的甘蔗黑穗病菌LAMP可视化快速检测试剂盒进行检测，具体步骤如下：
S1. 基因组DNA提取：2014年4月田间采集甘蔗品种新台糖22号蔗苗心叶9片（有甘蔗黑穗病早期症状，但黑穗未抽出），通过CTAB法利用基因组DNA提取液对每片小苗心叶进行甘蔗黑穗病菌基因组总DNA提取，得到样品并依次编号为样品2～10；
S2. 配制反应体系：总体系25μL，其中，基因组DNA 2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（8U/μL），检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3、B3引物各0.5 μL，1.6 μmol/L的 FIP、BIP引物各1 μL。另外在每PCR管反应体系上面加稳定液石蜡油50μL，PCR管盖内壁加显色液SYBR Green I 2 μL/体系；
S3. 环介导等温扩增：分别以样品2～10及甘蔗黑穗病菌基因组DNA（阳性对照，标记为1号）及ddH2O（阴性对照，标记为11号）为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS序列设计的内外两对特异引物F3、B3（外引物对）和FIP、BIP（内引物对）经过扩增得到扩增产物；
F3：5`- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3`；
B3：5`-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3`；
FIP：5`- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3`；
BIP：5`- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3`。
所述扩增反应的程序为：65 ℃ 1 h，80 ℃ 5 min，4℃保存。
其中，检测基础液为dNTPs、MgSO4及甜菜碱，其配方是终浓度为1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mmol/L甜菜碱和8 mmol/L MgSO4。
其中，试剂盒中所述基因组DNA提取液为CTAB提取液，其配方为：2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl (pH为8.0)，1.4 mol/L NaCl。
S4. 扩增产物检测：扩增反应结束后，将PCR管倒置并轻轻振荡，使PCR管盖内的显色液与扩增产物充分混合染色，图1为染色结果。
根据图1中染色结果判断检测结果，绿色为阳性，即待测样品中含有甘蔗黑穗病菌，橙色为阴性，即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。本实施例中2～10号样品结果显示表明：9个样品及阳性对照均为阳性（绿色），检测出甘蔗黑穗病菌，而阴性对照为阴性（橙色）。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> F3
<400> 1
ggtgttcaga agcactccaa 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> B3
<400> 2
attacgaaag agctggcgg 19
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> FIP
<400> 3
cttttggccc atcttccctg ccgtcgcgtc cagcttcttg 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> BIP
<400> 4
cttcgtccgt ctttgcctgt catcggtagt gagggttttg c 41
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> F3b
<400> 5
gtcgcgtcca gcttcttg 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> B3b
<400> 6
attacgaaag agctggcgg 19
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> FIPb
<400> 7
tcgacttttg gcccatcttc ccatcctcac caccaaagtc ct 42
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> BIPb
<400> 8
cttcgtccgt ctttgcctgt catcggtagt gagggttttg c 41
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> F3c
<400> 9
ggccctcaaa taggcatg 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> B3c
<400> 10
acattttacg actggtaatg c 21
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> FIPc
<400> 11
tgaattgcag aagtgaatca tcgaaccaga ttagatctgc aagga 45
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> BIPc
<400> 12
cgcaattcgc tgcgttcttc ggtcgtctaa aatctaaaaa acaac 45
Claims (10)
1. 一种用于检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。
2. 一种用于检测甘蔗黑穗病菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述引物组。
3. 根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有基因组DNA提取液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品、稳定液和显色液；所述LAMP反应液除含有权利要求1所述引物组还含有Bst DNA聚合酶和检测基础液。
4. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA提取液为CTAB提取液。
5. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述检测基础液为终浓度为1.3～1.5 mmol/L dNTPs、0.6～0.9 mmol/L甜菜碱和7～9 mmol/L MgSO4。
6. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组DNA；所述阴性对照品为无菌水。
7. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述稳定液为石蜡油；所述显色液为SYBR Green I。
8. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：基因组DNA 2.5μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶0.5μL，检测基础液19μL，0.2 μmol/L 的F3/B3引物各0.5μL，1.6 μmol/L的 FIP/BIP引物各1μL；所述检测基础液为终浓度为1.3～1.5 mmol/L dNTPs、0.6～0.9 mmol/L甜菜碱和7～9 mmol/L MgSO4。
9. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为63～65℃ 1 h，80～82℃ 5 min，4℃保存。
10. 利用权利要求1所述引物组或权利要求2至9任一项所述试剂盒检测甘蔗黑穗病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 基因组DNA提取：处理甘蔗得到甘蔗黑穗病菌基因组总DNA；
S2. 配制反应体系，在反应体系中加入稳定液，在反应管内壁加入显色液；所述稳定液的加入量为45～50 μL，显色液的加入量为1.5～2 μL；
S3. 环介导等温扩增：以基因组总DNA为模板，利用引物组经扩增得到扩增产物；所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；所述扩增反应的程序为63～65℃ 1 h，80～82℃ 5 min，4℃保存；
S4. 扩增产物检测：利用显色法对扩增产物进行分析，观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有甘蔗黑穗病菌；反应产物变为橙色，则不含有甘蔗黑穗病菌。
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| 环介导等温扩增(LAMP)技术的应用研究;刘永生等;《中国农学通报》;20101231;第26卷(第8期);摘要、第1节 * |
| 甘蔗主要病害抗病遗传育种研究进展;付瑜华等;《生物技术通报》;20140228(第2期);全文 * |
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