CN110317895B - 一种用于检测红薯源成分的lamp引物组及其应用 - Google Patents

一种用于检测红薯源成分的lamp引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组及其应用。本发明的LAMP引物组用于检测红薯源成分特异性好，检测方法简单，尤其适用于检测粉条类加工产品中红薯源成分的检测。

Description

一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组及其应用
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组及其应用。
背景技术
红薯(又名红苕、甘薯、地瓜、山芋等)是一种古老的薯类作物，种植过程中无农药污染，低化肥使用，是消费者最放心的绿色食品原料。红薯富含蛋白质、淀粉、维生素及多种矿物质，并有防癌、通便、养颜、益寿等功效，被誉为“天然绿色食品”和“长寿食品”，居绿色蔬菜之首。近些年来，红薯越来越多地被认作为保健食品，市场消费需求不断增加，随着人民生活水平的不断提高和饮食休闲文化欣然兴起，红薯已经上升为食品工业的主要优质原料，在国际上都享有盛誉，这也给中国的红薯粉条产业带来了巨大的市场契机。
但是由于红薯的价格相对于玉米、木薯、马铃薯等较高，市场上常有用其他原料代替红薯以次充好的情况发生。以粉条为例，粉条是我国人民喜食的传统食品之一，具有食用方便、快捷、营养合理和口味丰富等特点，受广大消费者的喜爱和欢迎。其中红薯粉条始终伴随人们的日常饮食，其营养价值和适宜口感深受喜爱。但是现在的粉条市场存在很多问题。由于玉米淀粉、木薯淀粉的价格都比红薯淀粉低很多，所以很多不法商人为获取假货带来的暴利往粉条里添加玉米淀粉、木薯淀粉，用玉米淀粉制作所谓的“纯红薯粉条”，为让色泽形似、口感筋道，甚至添加墨汁和工业用料石蜡等违规添加剂。目前为检测红薯粉条中含有的有害物质以及判断其真假，已经有很多种方法被建立，但尚未建立从基因的角度检测红薯粉条中是否存在红薯特异基因的方法，对于鉴别是否用其他淀粉制假红薯粉条而言，基因检测方法具有时间短，特异性强，灵敏度高等特点，极具研究价值和意义。
环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种扩增效率高、无需专门的仪器的核酸扩增方法，在60-65℃恒温的条件下即可实现核酸的扩增。目前尚未见有采用LAMP方法检测红薯性成分的文献公开。
CN 106701909 A公开了一种用于实时荧光PCR方法检测红薯源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针组合物，该引物对是根据红薯g3pdh基因设计的，并将所述引物对用于检测红薯淀粉，绝对灵敏度可达0.01ng/μL，但由于当采用红薯淀粉制作粉条、薯片、糕点等加工食品时，需要进行热处理，可能会造成DNA的损伤，当采用以红薯g3pdh基因为靶基因设计的LAMP引物组用于粉条中红薯源成分时会出现假阴性的结果。
发明内容
本发明的目的之一在于：提供一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组，可用于检测红薯淀粉加工产品中是否含有红薯源成分，具体的技术方案为：一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组，所述引物组的序列为：
Hong-F3：5’-CGGGCGACTAACGAACC-3’
Hong-B3：5’-TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3’
Hong-FIP：5’-ATCCGCAAAGACGGGGCACGTTTTGCGGAAGCGCCAAGGAA-3’
Hong-BIP：5’-GAGGCGTCGGCGTCTTACTTTTTTCGATGCGAGAGCCGAGAT-3’
Hong-LF：5’-GCTGGCCATCTCAGTACGATA-3’
本发明的第二目的在于：提供一种用于检测红薯源成分的试剂，具体的技术方案为：一种用于检测红薯源成分的试剂，包括dNTP、ThermoPol Buffer、Mg2+、Bst DNA聚合酶、荧光染料和如上所述的LAMP引物组。
本发明的第三目的在于：提供一种用于检测红薯源成分的试剂盒，具体的技术方案为：一种试剂盒，包括如上所述的LAMP引物组或如上所述的用于检测红薯源成分的试剂。
本发明的第四目的在于：提供一种检测红薯源成分的方法，具体的技术方案为：一种检测红薯源成分的方法，包括如下步骤：提取待检样品DNA；配制反应体系，所述反应体系的成分包括如上所述的LAMP引物组；将所配制的反应体系置于恒温条件下扩增。
优选的，所述反应体系中Hong-F3、Hong-B3、Hong-FIP、Hong-BIP和Hong-LF的摩尔比为8:8:1:1:4。
优选的，所述反应体系为10μL反应体系，包括：ThermoPol Buffer 1μL、50mM Mg2+0.8μL、10×Bst DNA Polymerase Buffer 0.05μL、50x SYBR Green I 0.05μL、10mM dNTP1.2μL、Hong-F3终浓度0.1μM、Hong-B3终浓度0.1μM、Hong-FIP终浓度0.8μM、Hong-BIP终浓度0.8μM、Hong-LF终浓度0.4μM、核酸模板1μL，ddH2O补足10μL。
优选的，所述恒温条件的温度为58℃。
本发明的目的还在于：提供了一种上述用于检测红薯源成分的LAMP引物组的具体应用。具体技术方案为：如上所述的LAMP引物组在检测红薯源成分中的应用。
如上所述的LAMP引物组在检测红薯淀粉中的应用。
如上所述的LAMP引物组在检测粉条中红薯源成分中的应用。
本发明的有益效果是：所述用于检测红薯源成分的LAMP引物组是以红薯转录间隔序列ITS为靶标设计的，编码rRNA的基因与间隔区是数以千计的串联重复序列，在基因组上存在大量拷贝数，用于红薯源成分的检测时特异性和灵敏度好；即使红薯经粉碎、加热加工成粉条等加工产品，采用本发明的LAMP引物组检测时仍有良好的特异性，可有效避免假阴性的结果。
本发明的检测红薯源成分的方法简单、快速，58℃恒温反应1h左右即可获取检测结果。
本发明的检测红薯源成分的试剂和试剂盒使用方便，可快速获取检测结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为引物组No1-No4在56℃和58℃(温度不同、引物相同的样品在同一张图上)时用于检测红薯DNA的特异性扩增曲线图；
图2为以引物组No1-No4在56℃和58℃(温度不同、引物相同的样品在同一张图上)时用于检测红薯DNA的熔解曲线图；其中，图1和图2中NC表示阴性对照，PC表示以红薯DNA作为核酸模板的样品。
图3为58℃时，分别以引物组No2(左图)和引物组No4(右图)为引物，以红薯DNA、玉米DNA、木薯DNA、马铃薯DNA和ddH2O为核酸模板的进行LAMP反应的扩增曲线图，图中Manihot esculenta表示木薯DNA、Zea mays表示玉米DNA、Solanum tuberosum表示马铃薯DNA、Ipomoea batatas表示红薯DNA；
图4为引物组No4用于检测红薯DNA的绝对灵敏度扩增曲线；
图5为引物组No4用于检测红薯淀粉DNA的相对灵敏度扩增曲线(左)和熔解曲线(右)；
图6为对比例1的扩增曲线，图6中红薯粉条中提取的DNA模板是指从商薯19加工的粉条(样品编号32)中提取得到的；
图7为对比例2的扩增曲线，其中FENTIAO表示从商薯19加工的粉条(样品编号32)中提取得到的DNA，MUSHU表示木薯DNA，YUMI表示玉米DNA，MALINGSHU表示马铃薯DNA。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.为了使实验结果更加清楚，下述实施例将包括本发明的LAMP引物组的等温扩增反应体系置于StepOnePlus实时荧光定量PCR系统(美国应用系统公司)进行扩增反应。本领域技术人员应当得知，本发明的LAMP引物组和其反应体系可在恒温的水浴锅中进行。
2.所用试剂的来源：dNTP(10mmol/L)：生工生物工程(上海)股份有限公司；MgSO4(50mmol·L-1)：实验室制备；Bst DNA聚合酶(100U/μL)：New England Biolab(北京)有限公司；ThermoPol Buffer(500mL)：New England Biolab(北京)有限公司；指示剂SYBR GreenI(50×)：北京索莱宝科技有限公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris，0.02mol/L Na2-EDTA)；CTAB沉淀液(50mL，5g/L CTAB，0.04mol/L NaCl)：实验室制备；LAMP引物，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
3.模板DNA提取方法：
试剂盒法(湖南赛诺生物科技有限公司的植物总DNA提取试剂盒)：试剂：BufferGP1、Buffer GP2、Buffer GD、Buffer PW、Buffer TE、氯仿
试管：吸附柱CB3、收集管(2ml)、离心管(2ml)
(1)打开水浴锅设置温度65℃，取700μLGP1加入离心管中，放入水浴锅预热；
(2)称取0.3g红薯淀粉加入GP1已预热好的离心管中，混匀水浴20分钟，期间颠倒数次，充分混匀；
(3)往加入700μL氯仿，充分混匀，离心5min；
(4)将离心所得上层清液转入一个新的离心管中，加700μL GP2，充分混匀；
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，离心30s(离心机12000rpm,30s可分次离心)，弃掉废液
(6)向吸附柱CB3中加入500μL GD，离心30s，弃掉废液
(7)向吸附柱CB3中加入600μL PW，离心30s，弃掉废液
(8)重复操作步骤8，离心2min 30s，弃掉废液
(9)将吸附柱开盖晾置数分钟，将吸附柱残余漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应
(10)将吸附柱放入一个干净的(新的)收集管中，向吸附柱膜中间悬空滴加100μLTE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min将离心所得液体再转入吸附柱，室温放置2min，离心2min，所得液体即所需DNA，震荡混匀。
CTAB法：称取0.1g样品粉末至一洁净2.0ml离心管中，加入1.5mL CTAB裂解液，65℃ 1h，上下颠倒混匀几次：8000rpm离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中，加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm离心10min，分别取650μL上清液至2.0mL离心管中，加入1.3mL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500rpm离心10min，弃上清液，加入350μL 1.2M NaCl，剧烈震荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm离心10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃静置1h，14500rpm离心20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，14500rpm离心20min，弃上清液，晾干，加入100μL ddH2O，4℃储存备用。
实施例1采用本发明的LAMP引物组检测粉条中的红薯源成分
(1)引物设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出红薯转录间隔区序列(ITS,GenBank ID:MH792118.1)，针对该序列设计出LAMP引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件(PrimerExplorer 5(http://primerexplorer.jp/e/)和Oligo 7(MolecμLar BiologyInsights,Inc.))完成。得到4组引物，详见下表1
表1软件设计得到的4组检测红薯源成分的LAMP引物组
Figure GDA0002183148960000051
Figure GDA0002183148960000061
(2)按摩尔比FIP:BIP:LB:LF:F3:B3＝8:8:4:4:1:1的比例分别配置No1、No2、No3引物组；按摩尔比FIP:BIP:LF:F3:B3＝8:8:4:1:1的比例配置No4引物组，配制反应体系，进行扩增实验。反应体系见下表2
表2 LAMP扩增反应体系10μL(配制时配制成100μL，实际使用时分装于10μL单管)
Figure GDA0002183148960000062
(3)设置StepOnePlus实时荧光定量PCR系统参数，进行扩增实验
参数设置：10μL体系，110循环，保温温度为56℃/58℃，保温时间5min，循环温度为56℃/58℃(保温温度和循环温度相同，分别进行56℃和58℃的实验)，循环时间30s，采用水作为阴性对照(NC)。
(4)实验结果(扩增曲线详见说明书附图图1，图1中NC表示阴性对照，PC代表添加有红薯DNA的样品，NC、PC分别做1个重复样品；熔解曲线详见说明书附图图2)：温度为56℃时，No 1、No 2、No 3引物扩增曲线一般，No 4引物扩增较好；温度为58℃时，No 1引物水微扩增、No 2引物扩增一般，No 3、No 4引物扩增效果较好，其中No 4引物扩增最好，首选No3、No 4引物组做特异性试验。
(5)采用No 3、No 4引物组继续进行特异性实验：采用从玉米、木薯和马铃薯中提取得到的DNA和水作为阴性对照。
56℃时，采用No 3、No 4引物组的反应体系中，红薯、玉米、木薯和马铃薯均出现不同程度的扩增，No 3引物水微扩增，可能是由于56℃为非最适温度。
(6)将No 3引物替换为No 2引物，设置温度为58℃，采用No 2、No 4引物分别进行扩增实验：
No 2引物的反应体系中，除水不扩增外，红薯、玉米、木薯、马铃薯DNA均出现扩增(详见说明书附图图3，左图)；No 4引物的扩增效果最好，只有红薯DNA出现扩增(详见说明书附图图3，右图)。
实施例2灵敏度试验
(1)绝对灵敏度实验：
将提取得到的红薯DNA做梯度稀释，依次配制成1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL的核酸模板溶液，按照表2的比例配制10μL反应体系(将核酸模板依次替换为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL的稀释样品)，采用No 4引物组进行扩增实验。其中，StepOnePlus参数设置为：10μL体系、110循环、保温温度为58℃，保温时间5min，循环温度为58℃，循环时间30s。
扩增结果详见说明书附图图4，当10μL体系中添加1pg、10pg、100pg、1ngDNA时LAMP扩增曲线均扩增良好，说明No 4引物绝对灵敏度高，反应快，当红薯DNA浓度大于等于1pg/μL时，均可检测出来。
(2)相对灵敏度实验：用试剂盒法提取红薯、玉米新鲜组织DNA，总质量为0.5g，红薯所占比例分别20％、10％、5％、1％。
20％：0.1g红薯+0.4g玉米；10％：0.05g红薯+0.45g玉米；
5％：0.025g红薯+0.475g玉米；1％：0.005g红薯+0.495g玉米
采用No 4引物组进行扩增实验。其中，StepOnePlus参数设置为：10μL体系(按照表2的比例配制)、110循环、保温温度为58℃，保温时间5min，循环温度为58℃，循环时间30s。
扩增结果详见说明书附图图5，LAMP扩增曲线除水外，均扩增良好，LAMP熔解曲线良好。当红薯淀粉和其他基因型淀粉掺杂在一起，浓度比例低至1％时，此方法也可快速高效检测出来，灵敏度高。
实施例3将本发明的引物组No 4用于粉条样品的检测
(1)为保证试验数据的准确，多次重复用试剂盒法提取水泡粉条的DNA和LAMP检测试验，1-30号粉条样品扩增结果如表3所示：(“-”代表未扩曾，“+”代表扩增)
表3试剂盒法提取粉条DNA时1-30号粉条LAMP扩增曲线扩增情况
Figure GDA0002183148960000081
其中2、4、6、8、9、10、12、15、16、18、19、22、25、26、27、28、29、30号粉条样品出现扩增，1、3、5、7、11、13、14、17、20、21、23、24号粉条样品未扩增。样品出现扩增说明粉条中含有红薯淀粉；样品未扩增可能是由于红薯是淀粉含量高DNA含量少的作物，加工成粉条后DNA含量更少，试剂盒提取法提取DNA含量不高造成的，为保证试验数据更加准确，尝试使用更精确的DNA提取方法“CTAB提取法”重新提取未扩增粉条样品DNA，重复检测未出现扩增的粉条样品。
(2)用CTAB法提取样品DNA，重新检测未出现扩增粉条样品1、3、5、7、11、13、17、20、21、23、24、31号(31号样品为新增粉条样品)，结果如表4所示：(“-”代表未扩增，“+”代表扩增)
表4 CTAB法提取粉条DNA时LAMP扩增曲线扩增情况
Figure GDA0002183148960000082
Figure GDA0002183148960000091
其中5、7、20、21、23、31出现扩增，说明这些粉条中含有红薯淀粉；1、3、11、13、17、24号样品依旧未扩增，可能这些粉条样品不是采用红薯淀粉制成的；此外，采用CTAB法从粉条中提取得到的DNA和本发明的LAMP引物组No 4有更好的适配性，有助于提高粉条中红薯源成分检测的灵敏度和特异性。
对比例1：红薯g3pdh基因为靶标设计LAMP引物组用于检测粉条中的红薯源成分
参照用于红薯源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒(CN 106701909A)，针对基因g3pdh(GenBank ID：EF119215.1)的六个位点设计出LAMP引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
F3：5`-CGAATATCGACATTTCCAAGG-3`
B3：5`-AGCGAGAGAGTAAGTTGAAG-3`
FIP：5`-GCCGTGCTTTTGTTTTCTTTTCTTTTTTTGTAGTAATCTTCTTTCTTTT TCACC-3`
BIP：5`-CACACCTAACCCCCAGCAACTTTTTGTAATAGAGAGTGAGACAGG-3`
LB：5`-ATACACCGAATCCTTTTTCCACTTC-3`
(2)反应体系(反应总体积为25μl)
表5
Figure GDA0002183148960000092
Figure GDA0002183148960000101
核酸模板(采用CTAB法提取得到)：阳性模板1为从商薯19红薯中提取的基因组DNA，阳性模板2为商薯19加工的粉条(样品编号32)中提取的基因组DNA，阴性对照为水(均做2组试验)。
(3)恒温扩增反应：在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中63℃左右扩增60分钟。
(4)检测结果：如表2所示，从红薯粉条中提取的DNA模板没有发生扩增，从红薯中提取的DNA模板有扩增，并且25min指数曲线进入平台期，如图6所示。
表6.扩增结果
Figure GDA0002183148960000102
结果分析：红薯g3pdh基因在基因组中为单拷贝，虽然也在红薯组织中表达，但在将红薯加工成粉条类物质的过程中需要对红薯淀粉进行热处理，可能造成该基因被损坏，进而使得当采用以红薯g3pdh基因为靶标设计的LAMP引物组检测粉条类物质中的红薯源成分时，容易产生假阴性的结果。
对比例2
采用本发明的LAMP引物组No4分别以从商薯19加工的粉条(样品编号32)中提取得到的基因组DNA、马铃薯DNA、木薯DNA、玉米DNA和ddH2O为核酸模板(核酸模板采用CTAB法提取得到，分别做2组试验)，分别按照上表2配制LAMP反应体系(10μL)，StepOnePlus实时荧光PCR系统参数设置为：10μL体系(按照表2的比例配制)、110循环、保温温度为58℃，保温时间5min，循环温度为58℃，循环时间30s，进行扩增。
检测结果：如果扩增结果图中出现指数曲线，则该样品含有红薯转录间隔区序列(ITS)，如果结果没有出现特异梯状谱带，则样品中不含有红薯转录间隔区序列(ITS)。检测结果如表7与图7所示，25分钟内指数扩增曲线进入平台期。
表7.扩增结果
Figure GDA0002183148960000103
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 许昌学院
<120> 一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组及其应用
<130> 192098
<141> 2019-06-19
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgaacctg cggaaggat 19
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagacgccga cgcct 15
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccggacga ggagattgaa tttttcattg tcgaaacctg cacag 45
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggaagcg ccaaggaatt ttgcgatccg caaagacgg 39
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accgttctct ggtcgttctg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatcgtactg agatggccag cc 22
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcccgtgccc caactc 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgggtaatc cccctgac 18
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacgctaggt acgaccacca cttttccggc ctaaatgcga gtcc 44
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtcgtctcg ggcgaacgat ttgggtcgcg ttcggaga 38
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgacgtccg tcgccaa 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacgagcccc cctcagt 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctgcggaag gatcattgtc 20
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagacgccga cgcct 15
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tagtcgcccg aggcatgcgt tttaacgacc agagaacggt ttg 43
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcggaagcg ccaaggaatt ttgcgatccg caaagacgg 39
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccggacgag gagattgaat aa 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tatcgtactg agatggccag cc 22
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgggcgacta acgaacc 17
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgcatttcg ctacgttctt 20
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atccgcaaag acggggcacg ttttgcggaa gcgccaagga a 41
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaggcgtcgg cgtcttactt ttttcgatgc gagagccgag at 42
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctggccatc tcagtacgat a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgaatatcga catttccaag g 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agcgagagag taagttgaag 20
<210> 26
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gccgtgcttt tgttttcttt tctttttttg tagtaatctt ctttcttttt cacc 54
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cacacctaac ccccagcaac tttttgtaat agagagtgag acagg 45
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atacaccgaa tcctttttcc acttc 25

Claims (7)

1.一种用于检测红薯源成分的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组的序列为：
Hong-F3：5’-CGGGCGACTAACGAACC-3’
Hong-B3：5’-TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3’
Hong-FIP：5’-ATCCGCAAAGACGGGGCACGTTTTGCGGAAGCGCCAAGGAA-3’
Hong-BIP：5’-GAGGCGTCGGCGTCTTACTTTTTTCGATGCGAGAGCCGAGAT-3’
Hong-LF：5’-GCTGGCCATCTCAGTACGATA-3’。
2.一种用于检测红薯源成分的试剂，其特征在于，包括dNTP、ThermoPol Buffer、Mg2+、Bst DNA聚合酶、荧光染料和如权利要求1所述的LAMP引物组。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP引物组或如权利要求2所述的用于检测红薯源成分的试剂。
4.一种检测红薯源成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待检样品DNA；配制反应体系，所述反应体系的成分包括如权利要求1所述的LAMP引物组；将所配制的反应体系置于恒温条件下扩增；
所述反应体系中Hong-F3、Hong-B3、Hong-FIP、Hong-BIP和Hong-LF的摩尔比为8:8:1:1:4；
所述反应体系为10μL反应体系，其中，ThermoPol Buffer 1μL、50mM Mg2+0.8μL、10×Bst DNA Polymerase Buffer 0.05μL、50x SYBR Green I0.05μL、10mM dNTP 1.2μL、Hong-F3终浓度0.1μM、Hong-B3终浓度0.1μM、Hong-FIP终浓度0.8μM、Hong-BIP终浓度0.8μM、Hong-LF终浓度0.4μM、核酸模板1μL，ddH2O补足10μL；
所述恒温条件的温度为58℃。
5.根据权利要求1所述的LAMP引物组在检测红薯源成分中的应用。
6.根据权利要求1所述的LAMP引物组在检测红薯淀粉中的应用。
7.根据权利要求1所述的LAMP引物组在检测粉条中红薯源成分中的应用。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006020601A (ja) * 2004-07-09 2006-01-26 Toyobo Co Ltd ストレス耐性を改良したイモ類、及びその作出方法
JP2006197926A (ja) * 2004-12-22 2006-08-03 National Food Research Institute 核酸検査用プライマーまたはプライマーセット及びこれらを用いた検査キット及び検査方法。
JP2006217828A (ja) * 2005-02-08 2006-08-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ジャガイモそうか病原因菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子若しくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法
JP2009000071A (ja) * 2007-06-22 2009-01-08 Kirin Holdings Co Ltd バレイショ品種識別用プライマーセット及びそれを用いるバレイショ品種の識別方法
WO2011047223A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Monsanto Technology Llc Methods of polynucleotide detection
CN104031997A (zh) * 2014-06-04 2014-09-10 华南农业大学 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的lamp引物组、试剂盒及其检测方法
CN105420359A (zh) * 2015-12-08 2016-03-23 许昌学院 Lectin检测的LAMP引物组及基因等温扩增方法
CN105725220A (zh) * 2016-03-16 2016-07-06 四川川北凉粉食品有限公司 一种自热川北红薯凉粉及其生产工艺
CN106701907A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 中国检验检疫科学研究院 用于木薯源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒
CN106987653A (zh) * 2017-06-09 2017-07-28 福建省农业科学院植物保护研究所 一种马铃薯晚疫病菌lamp检测引物及其可视化检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701909B (zh) * 2015-11-18 2022-04-01 中国检验检疫科学研究院 用于红薯源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006020601A (ja) * 2004-07-09 2006-01-26 Toyobo Co Ltd ストレス耐性を改良したイモ類、及びその作出方法
JP2006197926A (ja) * 2004-12-22 2006-08-03 National Food Research Institute 核酸検査用プライマーまたはプライマーセット及びこれらを用いた検査キット及び検査方法。
JP2006217828A (ja) * 2005-02-08 2006-08-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ジャガイモそうか病原因菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子若しくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法
JP2009000071A (ja) * 2007-06-22 2009-01-08 Kirin Holdings Co Ltd バレイショ品種識別用プライマーセット及びそれを用いるバレイショ品種の識別方法
WO2011047223A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Monsanto Technology Llc Methods of polynucleotide detection
CN104031997A (zh) * 2014-06-04 2014-09-10 华南农业大学 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的lamp引物组、试剂盒及其检测方法
CN106701907A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 中国检验检疫科学研究院 用于木薯源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒
CN105420359A (zh) * 2015-12-08 2016-03-23 许昌学院 Lectin检测的LAMP引物组及基因等温扩增方法
CN105725220A (zh) * 2016-03-16 2016-07-06 四川川北凉粉食品有限公司 一种自热川北红薯凉粉及其生产工艺
CN106987653A (zh) * 2017-06-09 2017-07-28 福建省农业科学院植物保护研究所 一种马铃薯晚疫病菌lamp检测引物及其可视化检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
复配粉中马铃薯成分实时荧光PCR检测方法的建立;姚晓静;张泓;张春江;胡宏海;于彩河;戴小枫;;核农学报(02);第297-303页 *
红薯全粉饼干的研制;肖付刚;《美食研究》;第35卷(第4期);第53-56页 *

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