CN106434976B - 山药真伪鉴别的方法及专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了山药真伪鉴别的方法及专用引物。本发明提供了用于山药真伪鉴别的物质。本发明提供的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸。本发明通过对正品山药特异性鉴别引物进行PCR条件优化，通过优化退火温度、变性温度、变性时间和退火时间及减少循环数等影响PCR反应的因素，使山药的分子鉴别在30min以内即可完成，进而建立一种快速、简单、直观的山药分子鉴别方法。

Description

山药真伪鉴别的方法及专用引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山药真伪鉴别的方法及专用引物。

背景技术

山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎，具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精的功效。目前市场上发现的混伪品有：薯蓣科植物褐苞薯蓣Dioscoreapersimilis prain et Burkill、参薯Dioscorea alata Linn.、日本薯蓣Dioscoreajaponica Thunb.、山薯Dioscorea fordi i prain et Burkill的根茎及大戟科植物木薯Manihot esculehta Crantz和旋花科植物番薯Ipomoea batatas(L.)Lam块根。其中前四种分别作为湖南省、浙江省、福建省、广西省、广东省等地的中药材标准和地方习用品。随着山药需求的增加以及价格的上涨，市场上有越来越多的混伪品出现，常常为刮去外皮、切片、加工成与山药相似的形状，又因为大部分为同属同科植物，所以采用传统的鉴别方法——性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、含量测定等都不能很好地用来鉴别山药。

随着中药分子鉴定的快速发展，DNA分子鉴定方法作为传统鉴别技术的有益补充，要求其应具有快速、准确、操作简便、实验成本低廉的特点。然而目前有关山药DNA条形码的研究报道，梁欣健等研究结果表明，DNA条形码鉴别以psbA-trnH+rbcL+matK复合序列的鉴别效果最佳,但此方法操作复杂，用时较长。

因此，建立准确、快速、高通量、低成本鉴定方法一直是中药鉴定的追求，探索快速分子鉴别方法对于中药材分子鉴别的现场运用具有十分重要的实践意义和实用价值。

发明内容

本发明一个目的是提供用于山药真伪鉴别的物质。

本发明提供的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；

所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸。

上述物质中，所述能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下1)或2)：

1)为序列1所示的单链DNA分子；

2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)为序列2所示的单链DNA分子；

4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。

本发明另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助山药的PCR试剂。

上述PCR试剂，包括上述的物质、DNA聚合酶和dNTP。

上述的PCR试剂中，所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为6.4ng/μL。

本发明第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定山药的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的物质或上述的PCR试剂。

本发明第三个目的是提供一种DNA片段A。

本发明提供的DNA片段A，其核苷酸序列为序列3。

上述的物质或上述的PCR试剂或上述的试剂盒或上述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一种中的应用也是本发明保护的范围：

(A1)鉴定或辅助鉴定山药；

(A2)鉴别或辅助鉴别山药；

(A3)鉴别或辅助鉴别山药及其伪品；

(A4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为山药；

(A5)鉴定或辅助鉴定待测样品是山药还是其伪品。

本发明第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否为山药的方法。

本发明提供的方法，为方法A或方法B：

方法A包括如下步骤：

检测待测样品中是否含有上述的DNA片段A；如果含有，则待测样品为或候选为山药；如果不含有，则待测样品不为或候选不为山药；

方法B包括如下步骤：

检测待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，则待测样品为或候选为山药；如果不是，则待测样品不为或候选不为山药。

上述方法中，所述检测待测样品中是否含有DNA片段A或所述检测待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T的方法包括如下步骤：

1)用上述的物质待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)用如下a或b检测所述PCR扩增产物：

a、向所述PCR扩增产物中加入DNA荧光染料，紫外检测，若PCR扩增产物有荧光，则待测样品含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，若PCR扩增产物无荧光，则待测样品不含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T；

b、检测所述PCR扩增产物大小，若大小为270-280bp，则待测样品含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，若大小不为270-280bp，则待测样品不含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA；

所述PCR扩增条件为83℃预变性1min，83℃变性15s，65℃退火30s，30个循环，72℃延伸30s。

决定PCR特异性的一个重要因素是退火温度，退火温度越高，特异性越强。因此，在保证只有正品山药能够扩增出目的基因的前提下，尽量提高退火温度。决定PCR特异性的另外一个因素是变性温度，在保证模板DNA能够充分开链的基础上，尽量降低变性温度，而且变性温度与退火温度相差越小，PCR升降温时所用的时间越短。为缩短时间，提高效率，把常规的PCR三步法改为变性-退火延伸两步法，并且在保证正品山药能够扩增出目的基因的前提下，尽量缩短变性、退火时间，减少循环次数，从而实现快速PCR的过程。

本发明的实验证明，本发明通过对正品山药特异性鉴别引物进行PCR条件优化，通过优化退火温度、变性温度、变性时间和退火时间及减少循环数等影响PCR反应的因素，选择快速DAN聚合酶，使整个PCR过程在30min左右即可完成，大大缩短了PCR反应的时间，在PCR扩增产物中加入SYBR Green I荧光染料，省掉琼脂糖凝胶电泳的步骤，缩短时间，使山药的分子鉴别在30min以内即可完成，进而建立一种快速、简单、直观的山药分子鉴别方法。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图。

图2为引物Sy75-76不同条件下PCR扩增反应电泳图。

图3为引物Sy89-90不同条件下PCR扩增反应电泳图。

图4为引物Sy91-92不同条件下PCR扩增反应电泳图。

图5为不同DNA Taq聚合酶预混合液重复性考察结果。

图6为灵敏度检测结果图。

图7为样品验证电泳及荧光检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中山药正品及混伪品共3个科3个属7个物种共14份样品均为鲜品，来源情况统计如表1所示：

表1为实验材料

下述实施例中BIO-RAD通用电泳仪(北京市六一仪器厂)，DHS96G基因扩增仪(北京鼎昊源科技有限公司)，G：BOX凝胶成像系统(英国Syngene)，KDC-160HP高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，GR60DF全自动立式高压灭菌器(致微(厦门)仪器有限公司)，P7021TP-6微波炉(佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司)。

DNA marke(生工生物工程(上海)股份有限公司)，2×Taq Plus Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，Premix Taq^TM(Ex Taq^TM Version 2.0plus dye)(TaKaRa宝生物工程有限公司)，G-Red核酸染料(北京百泰克生物技术有限公司)，琼脂糖Agarose M(生工生物工程(上海)股份有限公司)，其他试剂均为分析纯。

实施例1、山药真伪鉴别引物的设计和方法的建立

一、基于Cytb序列的山药位点特异性鉴别引物设计

在NCBI数据库中下载物种的rbcL序列，使用BioEdit软件进行排序、比对、分析，山药正品及混伪品rbcL序列存在276位C/G变异和514位T/C变异。以这两个变异位点作为正品山药特异性鉴别位点，使用primer premier 5软件，设计山药正品特异性鉴别引，分别命名为Sy75-76、Sy89-90、Sy91-92，序列如表2所示。各引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2引物及PCR反应条件

二、山药真伪鉴别方法的建立

1、基因组DNA提取及检测

称取10mg研磨好的表1所示的药材粉末，使用碱裂解法提取总DNA，采用纯化试剂盒对总DNA进行纯化，并用超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度。

将浓度稀释为20ng·μL^-1，于-20℃保存备用。选择通用引物Sy12-13对山药及其混伪品样品进行扩增。引物序列及扩增程序见表2。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察并记录，并对PCR产物进行双向测序。

结果如图1所示，1、2为SH，3-7为SF，8、9为R，10为J，11-15为TH，16、17为H，18、19、20为ZS，21-25为HH，26-30为TS，31-35为RS，36-40为H'，41-45为F；表明提取的DNA可以满足PCR反应的要求。

2、PCR条件优化和引物的筛选

利用设计的引物进行PCR扩增反应，参照赵丹，蒋超等快速分子鉴定方法，采用2步法，方法见表2，分别考察退火温度、变性温度、循环次数、退火时间、变性时间并进行优化，获得不同引物的PCR反应程序，然后比较PCR反应条件，筛选出用时最短、效率最高、能够准确鉴别正品的PCR鉴别引物和PCR反应程序。

(1)引物Sy75-76 PCR扩增反应优化因素与变量详见表3；

表3为引物Sy75-76 PCR扩增反应优化因素与变量表

结果如图2所示，其中A-SH、B-R、C-H、D-HH、E-H'、F-SF；

I图为退火延伸温度考察(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别代表48、50.2、52.4、55、57.5、60.1、62.6、65.2、67.3、68.9、70℃)；

II图为变性温度考察(1、2、3、4、5、6分别代表80、83、86.5、89.9、93.1、95℃)

III图为循环次数考察(1、2、3分别代表30、28、25个循环)；

IV图为变性时间考察(1、2、3、4分别代表30、20、15、10s)；

V图为退火时间考察(1、2、3、4分别代表30、25、20、15s)；

I图中当退火温度在48和62.6℃之间时，除正品山药有目的条带外，其它混伪品也有目的条带存在；当退火温度为65.2℃时，只有正品山药有目的条带存在，而混伪品未检测出；而当退火温度上升为67.3、68.9、70℃时，每个样品均无亮条带存在。因此退火温度选择65℃；

II图中当变性温度在83和95℃之间时，正品山药均能检测出目的条带，86.5℃时条带最亮，且与退火温度相差较小，因此变性温度选择86.5℃；

III图中，只有30个循环时，正品山药有目的条带存在，因此循环次数选择30；

IV图中，变性时间为30和20s时，正品山药均能检测出目的条带，变性时间选择20s；

V图中，只有退火时间为30s时，正品山药才能检测出目的条带，退火时间选择30s。

(2)引物Sy89-90 PCR扩增反应优化因素与变量详见表4；

表4为引物Sy89-90 PCR扩增反应优化因素与变量表

结果如图3所示，其中，A-SH、B-R、C-H、D-HH、E-HH、F-山药(饮片)、G-S，

I图为退火延伸温度考察(1、2、3、4、5、6、7、分别代表58、60.8、62.4、65.7、68.9、70.3、72℃)；

II图为变性温度考察(1、2、3、4、5、6分别代表80、83、86.5、89.9、93.1、95℃)

III图为循环次数考察(1、2、3分别代表32、30、28个循环)；

IV图为变性时间考察(1、2、3、4分别代表30、20、15、10s)；

V图为退火时间考察(1、2、3、4分别代表30、25、20、15s)；

I图中当退火温度在58和62.4℃之间时，除正品山药有目的条带外，其它混伪品也有目的条带存在；当退火温度为65.7℃时，只有正品山药有目的条带存在，而混伪品未检测出；而当退火温度上升为68.9、70.3、72℃时，每个样品均无亮条带存在。因此退火温度选择65℃；

II图中当变性温度为83℃时，只有正品山药能检测出目的条带，当变性温度上升为86.5和95℃之间时，除正品山药有目的条带外，其它混伪品也有目的条带存在，因此变性温度选择83℃；

III图中，32和30个循环时，正品山药均有目的条带存在，因此循环次数选择30；

IV图中，变性时间为30、20和15s时，正品山药均能检测出目的条带，变性时间选择15s；

V图中，退火时间为30和25s时，正品山药都能检测出目的条带，但25s时，目的条带不太亮，因此退火时间选择30s。

(3)引物Sy91-92 PCR扩增反应优化因素与变量详见表5；

表5为引物Sy91-92 PCR扩增反应优化因素与变量表

结果如图4所示，其中，A-SH、B-R、C-H、D-HH、E-HH、FG-山药(饮片)、G-S；

I图为退火延伸温度考察(1、2、3、4、5、6、7、分别代表58、60.8、62.4、65.7、68.9、70.3、72℃)；

II图为变性温度考察(1、2、3、4、5、6分别代表80、83、86.5、89.9、93.1、95℃)；

III图为循环次数考察(1、2、3分别代表32、30、28个循环)；

IV图为变性时间考察(1、2、3、4分别代表30、20、15、10s)；

V图为退火时间考察(1、2、3、4分别代表30、25、20、15s)；

VI图为预变性时间考察(1、2、3分别代表3、2、1min)；

I图中当退火温度在58和62.4℃之间时，除正品山药有目的条带外，其它混伪品也有目的条带存在；当退火温度为65.7℃时，只有正品山药有目的条带存在，而混伪品未检测出；而当退火温度上升为68.9、70.3、72℃时，每个样品均无亮条带存在。因此退火温度选择65℃。

II图中，变性温度在80和95℃之间时，正品山药均能检测出目的条带，变性温度选择80℃。

III图中，只有32个循环时，正品山药有目的条带存在，因此循环次数选择32。

IV图中，变性时间为30和20s时，正品山药均能检测出目的条带，变性时间选择20s。

V图中，只有退火时间为30s时，正品山药才能检测出目的条带，退火时间选择30s。

VI图中，预变性时间为3min时，正品山药的目的条带较清晰、明亮，预变性时间选择3min。

上述不同引物PCR条件优化结果如表6所示，引物Sy75-76、Sy89-90、Sy91-92扩增产物的长度分别为231bp、272bp、97bp。

引物Sy91-92只有上游引物的3'端存在变异位点，而引物Sy75-76和Sy89-90上下游引物3'端均存在变异位点，引物Sy91-92扩增产物的长度较短为97bp，可以减少DNA聚合酶复制产物所需时间，但实验结果显示该产物特异性不够，不足以区别正伪品，因此不选择此引物；引物Sy89-90与Sy75-76相比，扩增产物的长度分别为273bp和231bp，相差不大，但是引物Sy89-90序列长度为25和20,引物Sy75-76序列长度为20和18，前者TM值较高，PCR扩增过程耗时相对较少，而且引物Sy89-90的3'末端倒数第3位引入一个人为的错配碱基，可减少假阳性出现，PCR扩增实验结果显示引物Sy89-90可明显区别山药正伪品，且实验效率高，耗时少，故选择该引物为正品山药的特异性鉴别引物。

通过比较发现引物Sy89-90所用时间最短，特异性最强，因此本实验选择引物Sy89-90作为山药的最佳特异性引物。

表6不同引物PCR条件优化结果

引物Sy89-90的PCR扩增产物的核苷酸序列为序列3，在序列3中第25位和第254位为变异位点，且在山药正品中分别为C和T，在仿品中分别为G和C；序列大小为272bp。

3、DNA Taq聚合酶预混合液的筛选

提取SH、R、H、HH、S基因组DNA作为模板，分别用引物Sy89-90进行PCR扩增，扩增程序见上述表6所示；

扩增体系50μL体系：DNA Taq聚合酶预混合液25μL，2μL引物Sy89、2μL引物Sy90(至反应体系终浓度为0.64ng/μL)，DNA模板量1.5μL，加灭菌水双蒸水至50μL。

上述DNA Taq聚合酶预混合液分别为2×Taq Plus Master Mix DNA Taq(南京诺唯赞生物科技有限公司P112-01)和Premix Taq^TM(Ex Taq^TM Version 2.0plus dye)(宝生物工程有限公司Code No.:RR003A)。

结果如图5所示，1代表2×Taq Plus Master Mix DNA Taq，2代表Premix Taq^TM(ExTaq^TM Version 2.0plus dye)，结果显示正品山药在2种DNA Taq聚合酶预混合液均能有效扩增出目的基因，DNA Taq聚合酶预混合液对扩增无显著影响。

说明本实验所建立的山药真实性PCR鉴别方法稳定，重复性强，可用于山药正品药材的快速鉴定。

4、灵敏度检测

提取SH基因组作为模板，用引物Sy89-90进行PCR扩增，扩增程序见上述表6所示；

扩增体系50μL体系：DNA Taq聚合酶预混合液25μL，2μL引物Sy89、2μL引物Sy90(至反应体系终浓度为0.64ng/μL)，DNA模板体积2μL，加灭菌水双蒸水至50μL。DNA模板浓度分别为15,7.5,3.75,1.875,0.9375μg/mL。

结果如图6所示，结果显示在模板浓度为7.5μg/mL，可清晰扩增出目的基因，模板终浓度大于0.9375μg/mL时均可扩增出目的基因条带,说明本实验所建立的山药真实性PCR鉴别方法适应于DNA浓度大于0.9375μg/mL的样品。

实施例2、山药真伪鉴别引物的应用

提取表1的各个药材的基因组DNA作为模板，用引物Sy89-90在实施例1中表2的反应体系和表6的最佳PCR反应参数进行扩增，得到PCR扩增产物。

表2的反应体系如下：50μL反应体系，包括Premix Taq^TM25μL，引物Sy891.5μL、引物Sy901.5μL(至反应体系终浓度为4.8ng/μL)，DNA模板1.5μL，加无菌双蒸水至50μL。

PCR扩增程序为：83℃预变性1min，83℃变性15s，65℃退火30s，30个循环，72℃延伸30s。

用如下两种方法检测：

1)向PCR扩增产物中加入2μL 100×SYBR Green Ⅰ，并于365nm紫外波长下进行检测，出现绿色荧光为阳性扩增产物；

2)电泳检测上述PCR扩增产物，

结果如图7所示，1-TH、2-HH、3-TS、4-RS、5-ZS、6-J、7-SH、8-SF(脚板状)、9-SF(圆柱状)、10-R、11-H、12-H'、13-S、14-F、15-MH；

上图为1)的检测结果，可以看出，山药正品均显示出明亮绿色荧光，而伪品不发出荧光；

下图为2)的检测结果，可以看出，山药正品均得到272bp目的产物(序列3)，而伪品不含有大小为272bp目的产物。

序列表

<110>中国中医科学院中药研究所

<120>山药真伪鉴别的方法及专用引物

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aaggacgatg ctaccacatc gacac 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atcccaatag gggacggcca 20

<210> 3

<211>273

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

aaggacgatg ctaccacatc gagaccgttg ttggggagga agaccaatat attgcttatg 60

tagcttatcc tttagacctt tttgaggaag gttctgttac caatatgttt acttccattg 120

taggtaatgt atttggtttc aaagccctac gagccctacg tctggaggat ctgcgaattc 180

ctacttctta ttccaaaact ttccaaggcc caccgcatgg catccaagtt gaaagagata 240

agttgaacaa gtatggccgt cccctattgg gat 273

Claims (9)

1.用于山药真伪鉴别的物质，为能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质；

所述DNA片段A为序列表中序列3所示的核苷酸；

所述能扩增出DNA片段A的引物对或检测所述DNA片段A第25位为C且第254位为T的物质由引物1和引物2组成；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子。

2.一种用于鉴定或辅助山药的PCR试剂，包括权利要求1所述的物质、DNA 聚合酶和dNTP。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：

所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为6.4ng/µL。

4.一种鉴定或辅助鉴定山药的试剂盒，包括权利要求1所述的物质或权利要求2或3所述的PCR试剂。

5.一种DNA片段A，其核苷酸序列为序列3。

6.权利要求1所述的物质或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的DNA片段A在如下（A1）-（A5）中任一种中的应用：

（A1）鉴定或辅助鉴定山药；

（A2）鉴别或辅助鉴别山药；

（A3）鉴别或辅助鉴别山药及其伪品；

（A4）鉴定或辅助鉴定待测样品是否为山药；

（A5）鉴定或辅助鉴定待测样品是山药还是其伪品。

7.一种检测或辅助检测待测样品是否为山药的方法，为方法A或方法B：

方法A包括如下步骤：

检测待测样品中是否含有权利要求6所述的DNA片段A；如果含有，则待测样品为或候选为山药；如果不含有，则待测样品不为或候选不为山药；

方法B包括如下步骤：

检测待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，则待测样品为或候选为山药；如果不是，则待测样品不为或候选不为山药。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述检测待测样品中是否含有DNA片段A或所述检测待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T的方法包括如下步骤：

1）用权利要求1或2所述的引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2）用如下a或b检测所述PCR扩增产物：

a、向所述PCR扩增产物中加入DNA荧光染料，紫外检测，若PCR扩增产物有荧光，则待测样品含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，若PCR扩增产物无荧光，则待测样品不含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T；

b、检测所述PCR扩增产物大小，若大小为270-280 bp，则待测样品含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T，若大小不为270-280bp，则待测样品不含有所述DNA片段A或待测样品基因组中的DNA片段A第25位的核苷酸为C且第254位核苷酸为T。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA；

所述PCR扩增条件为83℃预变性1min，83℃变性15s，65℃退火30s，30个循环，72℃延伸30s。

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