CN109136386B - 一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量pcr方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对卡耶塔环孢子虫进行快速分型和溯源的定量PCR方法，采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝间的多态性连接区域作为遗传标记，设计了特异性的定量PCR引物，包含上游引物Cyc‑Mito‑F1和下游引物Cyc‑Mito‑R1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。本发明方法克服了现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法对该病原进行精细分型的缺点，而且扩增效率比现有的单位点分子诊断工具高；本发明采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组上的单个位点定量PCR和熔解曲线分析就可进行快速的基因型区分和溯源，克服了现有的卡耶塔环孢子虫多位点序列分型工具中因需要对多个位点扩增和测序所导致的分型耗时长、成本高的缺点，具有较大的应用前景。

Description

一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及 试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒。

背景技术

卡耶塔环孢子虫是一种重要的食源性传播病原，该病原进入人体后主要引起以腹泻为主的环孢子虫病，尤其在儿童和免疫缺陷病病人中常会造成持续性腹泻。环孢子虫病最早发现于秘鲁、危地马拉和尼泊尔等发展中国家，并且在这些国家呈地方性流行。但近年来，随着旅游业和食品供应的不断全球化，环孢子虫病传播到非环孢子虫病流行地的机会急剧增加。在过去的20年中，北美地区几乎每年都会出现大规模的环孢子虫病暴发，而且这些暴发主要与从环孢子虫病流行地进口的新鲜果蔬有关，因此卡耶塔环孢子虫已对公共卫生安全和食品安全造成了巨大威胁。我国对环孢子虫病的研究起步相对较晚，虽然目前还没有环孢子虫病暴发报道，但我国作为进口水果的高消费国家，每年从包括危地马拉、秘鲁等环孢子虫病流行地进口大量的新鲜果蔬(在2014～2016年间，我国平均每年进口水果总量高达350余万吨)，因此也存在环孢子虫病大规模暴发的风险。所以，亟需可精细区分卡耶塔环孢子虫的分型工具，以确定暴发的发生以及污染来源。

现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法用于该病原的基因型区分。在卡耶塔环孢子虫全基因组测序完成之前，针对该病原的分子诊断工具几乎都是基于该病原核基因组的核糖体小亚基RNA(Small Subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因、70kDa热休克蛋白(70kDa Heat Shock Protein，HSP70)和内转录间隔区(Internal TranscribedSpacer，ITS)建立的，其中前两者在该病原中高度保守，而ITS区域在同一虫株的不同拷贝之间就存在明显的序列差异。因此，基于这些位点建立的单位点分子诊断工具均无法用于该病原的基因型区分。而卡耶塔环孢子虫全基因组测序的完成使该病原高分辨率分型工具的建立成为可能。最近，中国源和美国源的卡耶塔环孢子虫虫株的全基因组测序相继完成，基于获得的全基因组序列，已建立了一种具有高分辨率的多位点序列分型工具(Multilocus Sequence Typing，MLST)，但该工具需通过对多个位点进行扩增和测序来实现分型，所以检测成本较高，且耗时耗力。

定量PCR(quantitative PCR，qPCR)是目前应用最广泛的分子诊断工具之一，该方法通常采用荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，不仅检测方法简单，且成本低。在PCR反应中，荧光染料特异性地结合在双链DNA上，随着PCR反应的进行，双链DNA反应产物不断增加，荧光信号强度也等比例增加，通过对PCR反应中每一个扩增循环产物的荧光信号进行实时检测，可实现对起始模板定性及定量分析。此外，扩增结束后逐渐增加温度使双链DNA逐步解链，荧光染料会从解链的DNA分子上释放，荧光强度降低，在解链过程中熔解温度将会出现一个特征峰值Tm(DNA双链解链50％的温度)，并且若起始模板的DNA序列、长度、GC含量之间存在差异，其对应产生的Tm值也会有所不同。因此，根据熔解曲线的峰形和Tm值即可以快速、准确地对待测样品进行序列多态性分析和基因型鉴定。作为一种快速、灵敏且经济的诊断技术，qPCR结合熔解曲线分析已被广泛应用于突变分析和基因分型。

目前，还未见有采用qPCR对卡耶塔环孢子虫进行快速分型和溯源的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有卡耶塔环孢子虫分子诊断工具无法对该病原进行快速精细分型的缺点，建立一种可用于该病原快速分型和溯源的qPCR方法，解决目前无法对环孢子虫病暴发进行快速鉴定和污染源追踪的问题。

本发明的第一个目的是提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速检测和分型的qPCR引物。

本发明的第二个目的是提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的qPCR方法。

本发明的第三个目的是提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于卡耶塔环孢子虫快速检测和分型的PCR引物，所述引物扩增的片段包含卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域。

本发明通过全基因组测序，发现卡耶塔环孢子虫与其它真核寄生虫类似，具有完整的线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组进化速度更快，因此基于该基因组建立的分型工具一般具有较高的分辨率。而且，作为母系遗传的基因组，线粒体基因组上不存在遗传重组，因此该基因组上的序列通常会被用作病原地理来源追踪的遗传标记。此外，通过全基因组测序发现，每个卡耶塔环孢子虫细胞中有大约500个线粒体基因组拷贝，因此基于线粒体基因组建立的分子诊断工具应比基于核基因组建立的分子诊断工具具有更高的扩增效率和检测灵敏度。更重要的是，通过比对中国源和美国源的卡耶塔环孢子虫线粒体基因组，发现线粒体基因组不同拷贝之间的连接区域中至少包含一个单核苷酸突变位点和一个7-bp的多核苷酸突变序列。因此，卡耶塔环孢子虫的线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域非常适用于建立该病原的基因型区分和溯源工具。本发明以卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝连接处的序列多态性片段作为该病原基因型区分的遗传标记，进而根据该多态性区域前后的保守序列区设计qPCR引物，使引物扩增的片段中包含卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的多态性连接区域。

优选地，所述qPCR引物退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～500bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。

优选地，所述qPCR引物包含上游引物Cyc-Mito-F1和下游引物Cyc-Mito-R1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示；

Cyc-Mito-F1：5′-GAGCGGTGTGTTTAAGGCAA-3′(SEQ ID NO：1)；

Cyc-Mito-R1：5′-CTGCTGGGACTTTGTCTCTTGT-3′(SEQ ID NO：2)。

上述引物Cyc-Mito-F1和Cyc-Mito-R1分别位于卡耶塔环孢子虫线粒体基因组SSUrRNA基因的SSU/11区域和SSU/4区域，其扩增片段位于卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝之间的连接区域，长度为357bp左右。

本发明还请求保护上述qPCR引物在卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源检测和/或在制备用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的检测试剂盒中的应用。

一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的qPCR方法，包括如下步骤：

S1.从待测粪便样品中提取DNA；

S2.以S1所述DNA为模板，用上述qPCR引物进行qPCR扩增；

S3.对S2的qPCR扩增产物进行扩增曲线和熔解曲线分析，根据熔解曲线对应的Tm值鉴定待测样品是否属于同一基因型，进一步根据其基因型进行溯源。

优选地，所述qPCR扩增的反应体系为包含以下终浓度的试剂：dNTPs 200μM，MgCl₂3mM，上下游引物各500nM，1×GeneAmp PCR buffer，1×EvaGreen荧光染料，DNA聚合酶2.5U，DNA模板1μL，BSA400ng/μL。

优选地，所述qPCR反应程序为：95℃3min；95℃5s，58℃15s，72℃15s，共50个循环；95℃10s，48℃30s，然后按0.1℃/s的速率从48℃升温至95℃，每升温0.1℃采集一次荧光信号。

另外，本发明还提供一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的检测试剂盒，所述试剂盒包含上述qPCR引物；

Cyc-Mito-F1：5′-GAGCGGTGTGTTTAAGGCAA-3′(SEQ ID NO：1)；

Cyc-Mito-R1：5′-CTGCTGGGACTTTGTCTCTTGT-3′(SEQ ID NO：2)。

优选地，所述试剂盒还包含qPCR所需试剂。

优选地，所述试剂盒还包含阳性和阴性对照。

优选地，所述试剂盒还包含从待测粪便样品中提取DNA所需的试剂。

作为一种可优选的实施方式，利用上述检测试剂盒进行卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的方法包括如下步骤：

S1.从待测粪便样品中提取DNA；

S2.以S1所述DNA为模板，用上述qPCR引物进行qPCR扩增；

S3.对S2的qPCR扩增产物进行扩增曲线和熔解曲线分析，鉴定待测样品的基因型，进而根据其基因型进行溯源。

所述qPCR扩增的反应体系为包含以下终浓度的试剂：dNTPs 200μM，MgCl₂3mM，上下游引物各500nM，1×GeneAmp PCR buffer，1×EvaGreen荧光染料，DNA聚合酶2.5U，DNA模板1μL，BSA400ng/μL。

所述qPCR反应程序为：95℃3min；95℃5s，58℃15s，72℃15s，共50个循环；95℃10s，48℃30s，然后按0.1℃/s的速率从48℃升温至80℃，每升温0.1℃采集一次荧光信号。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组上的单个位点进行qPCR，根据qPCR产物的熔解曲线就能进行基因型区分，克服了现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法对该病原进行精细分型的缺点；并且，本发明中采用的单个扩增位点在卡耶塔环孢子虫中有超过500个拷贝，因此扩增效率和检测灵敏度也比现有的单位点分子诊断工具高。

(2)本发明中采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组上的单个位点qPCR和熔解曲线分析就可进行快速的基因型区分和溯源，克服了现有的卡耶塔环孢子虫MLST工具中因需要对多个位点扩增和测序所导致的分型耗时长、成本高的缺点。

附图说明

图1为本发明中线粒体SSU rRNA qPCR扩增曲线。

图2为在本发明之前已有的核基因组SSU rRNAqPCR扩增曲线。

图3为采用本发明的线粒体SSU rRNA qPCR获得的不同国家样品的熔解曲线。

图4为采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR获得的中国和秘鲁样品的熔解曲线。

图5为采用在本发明之前已有的核基因组SSU rRNA qPCR获得的不同国家样品的熔解曲线。

图6为采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR获得的不同国家样品的qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图7为采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR获得的来自中国和秘鲁样品的qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图8为采用在本发明之前已有的核基因组SSU rRNA qPCR获得的不同国家样品的qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图9为采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR对不同国家样品的进行扩增和测序后获得的9个基因型及其序列特征。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

主要仪器：小型台式高速离心机(Eppendorf Centifuge 5424R)；FastPrep^TMFP120(BIO 101)配套设备；紫外消毒柜(SpectrolinkerTM XL-1500UV Crosslinker)；CleanSpotPCR/UV工作台(Laborartory Products)；Real time PCR仪(Light

480system)及其配套分析软件。

主要试剂：DNA提取试剂盒

SPIN for Soil Kit(MP Biomedicals)；Fermentas超纯水(

Applied Biosystems)；

PCR buffer(

Applied Biosystems)；4种三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)；DNA聚合酶(Promega,Madison,WI)；MgCl₂溶液；10×EvaGreen染料(Biotium)；牛血清白蛋白(Sigma)

实施例1

1、引物设计

通过比对中国源和美国源的卡耶塔环孢子虫线粒体基因组，发现在该病原线粒体基因组不同拷贝之间的连接区域至少包含一个单核苷酸突变位点和一个7-bp的多核苷酸突变序列，以该病原线粒体基因组不同拷贝连接处具有序列多态性的片段作为该病原基因型区分的遗传标记，进而根据该多态性区域前后的保守序列区设计下列qPCR引物：

Cyc-Mito-F1：5′-GAGCGGTGTGTTTAAGGCAA-3′(SEQ ID NO：1)；

Cyc-Mito-R1：5′-CTGCTGGGACTTTGTCTCTTGT-3′(SEQ ID NO：2)；

上述引物分别位于线粒体基因组SSU rRNA基因的SSU/11区域和SSU/4区域，其扩增片段的长度为357bp左右。

2、从粪便样品中提取DNA

利用市售商业化

SPIN for Soil DNA试剂盒进行DNA提取，具体实验方法较之试剂盒标准操作步骤略有改进，步骤如下：

(1)将保存于4℃冰箱、2.5％重铬酸钾溶液中的人粪便样品取出，混合均匀后用移液器吸取500μL粪便悬液移至1.5mL的离心管内，之后加入1mL的去离子水混合均匀，14000g离心10min，弃上清。(若为未加保护剂的新鲜粪便样品，则直接取200uL粪便样品，进行步骤3)

(2)向沉淀中加入1mL的去离子水混合均匀，14000g离心10min，弃上清。

(3)将沉淀转移至Lysing Matrix E管中，加入978μL Sodium Phosphate Buffer和122μL MT Buffer。

(4)将Lysing Matrix E管放入FastPrep TMFP120快速核酸提取仪中进行震荡混合，震荡强度5.5m·s^-1，震荡时间30s。

(5)将震荡混匀后的Lysing Matrix E管移至离心机内，14000g离心5min。

(6)将上清转入新的1.5mL离心管中，加入250μLPPS试剂，上下颠倒10次后，14000g离心5min，取上清，转至15mL离心管中。

(7)取1mL DNA Binding Matrix溶液(充分混匀)加入步骤(6)中的15ml离心管中，上下颠倒2min使得DNA与试剂颗粒充分混合，然后静置3min。

(8)轻柔地取上清液约1mL，丢弃，重新混匀剩余的液体与沉淀物，将其转移到SPINTM Filter中，14000g离心1min，弃掉滤液，重复此操作步骤直至全部沉淀都过滤在SPINTM Filter中。

(9)向SPINTM Filter中加入500μL SEWS-M溶液(SEWS-M原液需加入100mL无水乙醇进行混合处理)，用移液枪轻柔吹打数次，以重悬在滤膜上的沉淀，然后14000g离心1min。

(10)弃滤液，将SPINTM Filter放入离心机中，14000g离心2min。将SPINTM Filter转移到洁净的Catch Tube中，室温充分暴露沉淀，自然风干5min。

(11)向SPINTM Filter内已干燥的Binding Matrix中加入100μL的DES溶液，用洁净的移液枪头轻轻搅拌，使DNA与试剂充分混合。

(12)将SPINTM Filter Tube放入离心机中，14000g，离心1min。

(13)丢弃SPINTM Filter，Catch Tub中收集的液体即为提取的DNA的溶液，可在4℃条件下临时保存，或放于-20℃条件下保存。

3、定量PCR反应

以从粪便中提取的DNA作为模板，进行卡耶塔环孢子虫特异性的qPCR扩增。每个qPCR反应体系的总量为50μL，所包含的试剂终浓度如表1所示，最后加入适当体积的无菌去离子水，补足50μL。

qPCR反应程序设置包括变性、扩增和延伸，具体设置为：预变性95℃3min；变性95℃5s、退火58℃15s、延伸72℃15s，扩增50个循环；扩增反应结束后的熔解程序设置为：95℃10s，48℃30s，然后按0.1℃/s的速率从48℃升温至80℃(每升温0.1℃采集一次荧光信号)。扩增和熔解程序结束后，采用qPCR仪自带的分析软件生成每个样品的扩增曲线、Ct值、熔解曲线及Tm值。根据生成的扩增曲线以及Ct值判断待测样品是否为卡耶塔环孢子虫阳性，根据生成的熔解曲线的形状及Tm值，判断阳性样品的基因型。

表1本发明中线粒体SSU rRNA qPCR反应体系的试剂配比

实施例2

从包括我国在内的7个国家收集了36个卡耶塔环孢子虫阳性粪便样品，具体包括中国(n＝21)、秘鲁(n＝7)、尼泊尔(n＝3)、美国(n＝2)、危地马拉(n＝1)、西班牙(n＝1)和印度尼西亚(n＝1)(表2)。这些样品在分析前均保存在2.5％的重铬酸钾溶液中，之后按照实施例1中的方法提取DNA、进行qPCR和熔解曲线分析。在进行qPCR时，阴性对照是以无菌去离子水作为模板DNA溶液加入qPCR反应体系中，以阴性对照的Ct值作为标准判断样品是否为卡耶塔环孢子虫阳性(Ct值小于阴性对照Ct值的均认定为卡耶塔环孢子虫阳性样品)。

在36个样品中，样品Ct值为21.83～31.60不等，均小于同批次阴性对照的Ct值，由此判定这些样品是卡耶塔环孢子虫阳性(表2)。

同时，选取其中来自不同国家的8个样品，包括：中国(n＝2)、秘鲁(n＝2)、尼泊尔(n＝1)、美国(n＝2)和西班牙(n＝1)，采用在本发明之前已有的基于卡耶塔环孢子虫核基因组SSU rRNA基因序列设计的引物：Cyclo250F(5′-TAGTAACCGAACGGATCGCATT-3′)和Cyclo350RN(5′-AATGCCACGGTAGGCCAATA-3′)(退火温度67℃)，以及上述本发明中的qPCR反应体系和程序设置(退火温度除外)，进行qPCR和熔解曲线分析，以比较本发明与核基因组SSU rRNA qPCR方的扩增效率和分辨率。结果如表3和图1和2所示，采用本发明中线粒体SSUrRNA qPCR得到的Ct值显著低于采用核基因组SSU rRNAqPCR得到的Ct值(Student’s t-test,p＜0.01)，由此说明本发明的扩增效率更高，检测更灵敏。

表2实施例2中所采用的卡耶塔环孢子虫样品及其采用本发明中的线粒体SSUrRNA qPCR方法所得的Ct值

表3本发明中的线粒体SSU rRNA qPCR与核基因组SSU rRNA qPCR的扩增效率的比较

实施例3

采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR对实施例2中的36个样品进行扩增后，进一步采用本发明中的熔解曲线分析对36个阳性样品进行基因型区分，发现这些样品的Tm值之间存在明显差异，表面这些样品具有不同的基因型(图3，表4)。并且，这些基因型的分布与地理来源密切相关，即不同国家的样品具有各自特异性的基因型(Tm值差异显著)，特别是来自中国的样品的Tm值明显高于来自秘鲁的样品的Tm值，这表明来自这两个国家的样品各自具有特异性的基因型(图4)。因此，本发明建立的方法不仅具有高分辨率，而且可用于卡耶塔环孢子虫的地理来源追踪。

相比而言，若采用在本发明之前已有的基于核基因组SSU rRNA基因设计的引物进行qPCR和熔解曲线分析后，发现这些样品的Tm非常相近(图5)，无法对这些样品的基因型进行快速区分，因此该方法的分辨率较低，也无法用于卡耶塔环孢子虫的基因型区分和溯源。

表4实施例3中所采用的卡耶塔环孢子虫样品及其采用本发明中的线粒体SSUrRNA qPCR方法所得的Tm值

NA-None available，未能获得Tm

实施例4

采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR对实施例2中的36个样品进行扩增后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析和测序分析，并与实施例3中的通过熔解曲线分析获得的结果进行比对。

通过琼脂糖凝胶电泳分析，发现这些阳性样品的扩增产物片段大小之间存在明显差异(图6)，并且这些差异与样品的地理来源有关，来自中国和秘鲁的样品的qPCR产物的片段大小之间存在明显差异(图7)，但若采用之前已有的基于核基因组SSU rRNA基因设计的引物进行qPCR，扩增产物片段大小之间并未出现明显差异(图8)。这与实施例3中的熔解曲线分析结果一致。

进一步对36个阳性扩增产物进行测序分析，其结果如表4所示：其中35个产物测序成功，测序失败22234号样品的扩增产物在测序结果中出现了双峰，并且其Tm值明显低于其他来自中国的样品，这可能是由于这个样品中存在混合感染。在成功测序的35个样品中，共发现了9个基因型(表5，图9)。这9个基因型之间的序列多态性包括1个单核苷酸突变、1个7-bp多核苷酸突变、15-bp的重复序列拷贝数差异(AATAGTATTATTTAT、AATAGTATTATTTTT或AATAGTACTATTTTT)，以及AT富含序列长度多态性。并且，这9个基因型在地理分布上也存在特异性(表4，图4)。所有来自中国样品的基因型与其他国家样品的基因型明显不同。在来自中国的样品中，除来自开封的样品之外，其它样品均属于同一个基因型，该基因型仅包含1个15-bp的重复序列和同一种7-bp多核苷酸突变(GTTATTA)，而来自开封的样品的基因型则包含了另一种7-bp多核苷酸突变(GTTTTTA)(表5，图9)。来自印度尼西亚的样品的基因型包含2个15-bp的重复序列拷贝；来自尼泊尔的3个样品中，共检测到2个基因型，这2个基因型均含有3个15-bp的重复序列拷贝，但其包含的7-bp多核苷酸突变则不相同(TAATAAC和GTTATTA)；来自西班牙和危地马拉的样品的基因型中均包含4个15-bp的重复序列拷贝；在来自秘鲁的样品中共检测到2个基因型，其中一个包含4个15-bp的重复序列拷贝，另一个包含5个15-bp的重复序列拷贝(表5，图9)。在来自美国的2个样品中，其中来自罗德岛的样品的基因型与来自秘鲁的样品的基因型相同，另一个来自弗吉尼亚的样品的基因型则与来自印度尼西亚的样品的基因型相同(表5，图9)。通过测序结果所发现的卡耶塔环孢子虫基因型分布的地理差异性与通过熔解曲线分析(实施例2)发现的结果一致。

通过以上扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析和测序分析，进一步证明了本发明建立的qPCR不仅具有高分辨率，而且可快速对卡耶塔环孢子虫进行精确的基因型区分，并且获得的基因型在地理分布上存在明显的特异性，即不同地理来源的样品具有不同的基因型，因此该发明可用于环孢子虫病暴发的调查和污染源追踪。

表5采用本发明中线粒体SSU rRNA qPCR对实施例2中的卡耶塔环孢子虫样品进行扩增和产物测序分析的结果

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒

<130> YG18105443AA042

<141> 2018-07-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 卡耶塔环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)

<400> 1

gagcggtgtg tttaaggcaa 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 卡耶塔环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)

<400> 2

ctgctgggac tttgtctctt gt 22

Claims (9)

1.一种用于卡耶塔环孢子虫的快速分型和溯源的qPCR引物，其特征在于，所述引物由上游引物Cyc-Mito-F1和下游引物Cyc-Mito-R1组成，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

2.权利要求1所述的qPCR引物在非疾病治疗诊断目的卡耶塔环孢子虫分型、溯源和快速检测中的应用。

3.一种非疾病治疗诊断目的用于卡耶塔环孢子虫分型和溯源的qPCR检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取DNA；

S2.以步骤S1提取的DNA为模板，用权利要求1所述qPCR引物进行qPCR扩增；

S3.把步骤S2中得到的qPCR扩增产物，进行扩增曲线和熔解曲线分析，以鉴定待测样品的基因型，进而推测其地理来源。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应体系为包含以下终浓度的试剂：dNTPs 200 µM，MgCl₂ 3 mM，上游引物和下游引物各500 nM，1×Gene Amp PCRbuffer，1×Eva Green荧光染料，DNA聚合酶2.5 U，DNA模板1 µL，BSA 400 ng/µL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 5 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s，共50个循环；95℃ 10 s，48℃ 30 s，然后按0.1 ℃/s的速率从48℃升温至95℃，每升温0 .1℃采集一次荧光信号。

6.一种用于卡耶塔环孢子虫分型、溯源和快速检测的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的qPCR引物。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含qPCR检测所需试剂。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含阳性和阴性对照。

9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含从待测样品中提取DNA所需的试剂。

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