CN107988428A

CN107988428A - 虾虹彩病毒（siv）的raa恒温荧光检测方法及试剂

Info

Publication number: CN107988428A
Application number: CN201711107946.8A
Authority: CN
Inventors: 程奇; 钱冬; 黄震巨; 张建勋; 肖文; 余国君; 陶智勇; 徐锦余; 霍胜楠; 沈弘; 郑晓叶; 郑天伦; 沈伟良; 吕文浩
Original assignee: Hangzhou Public Survey Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Public Survey Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-11-10
Also published as: CN107988428B

Abstract

本发明公开了一种虾虹彩病毒（SIV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到2fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

Description

虾虹彩病毒(SIV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种虾虹彩病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

虹彩病毒科病毒形成二十面体病毒粒子，直径120～300nm，具有线性双链DNA基因组，基因组大小约102～212kbp，在细胞质中进行复制。虹彩病毒含有丰富的主要衣壳蛋白(MCP)，蛋白区域高度保守，通常被用来鉴定不同的物种。虹彩病毒科最近被划分为5个属：虹彩病毒属(Iridovirus)，绿病毒属(Chloriridovirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，蛙病毒属(Ranavirus)和肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)。虹彩病毒宿主很广，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物。其中无脊椎虹彩病毒(invertebrateiridescent viruses，IIVs)主要感染昆虫和陆生两栖类动物，到目前为止关于IIVs在甲壳纲、十足目中的报道较少，尤其是以螃蟹为研究对象。

目前，对虾类虹彩病毒的检测主要有电镜观察、常规组织学方法、免疫组织化学法和原位杂交，但这些技术分别使用时，却各有局限性。电镜观察法耗时长，费用高并且需要具备特殊的实验器材且视野较窄；组织病理观察不太适用与早期检测，通常在病毒严重感染机体全身，产生明显的、不可逆转的组织病变时，方可得到确证；免疫组织化学法和原位杂交操作相对比较繁琐，灵敏度不高，且不嫩对病毒进行定量研究。现在也常用的PCR-电泳法，但操作复杂。另外，PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于对虾现场普及推广使用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供虾虹彩病毒(SIV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种虾虹彩病毒(SIV)核酸的检测试剂盒，包括：虾虹彩病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述虾虹彩病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述虾虹彩病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、虾虹彩病毒标准品和ddH₂O中至少一种。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，虾虹彩病毒标准品为含有虾虹彩病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有虾虹彩病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种虾虹彩病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在虾虹彩病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和ddH₂O。存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述虾虹彩病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述虾虹彩病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；

本发明所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为虾虹彩病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为虾虹彩病毒阴性结果。

有益效果

1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；

3、高特异性：本发明对对虾其他的病症对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、虾虹彩病毒(HPV)、对虾肝肠胞虫(EHP)的DNA均不发生扩增。

4、高灵敏度：本发明的检测极限可以达到2fg/反应

5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。

附图说明

图1为本发明中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。

图2为RAA检测方法对SIV的灵敏度实验图，从左到右依次为20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL的阳性标准品的扩增结果。

图3为RAA检测方法对SIV的特异性实验图。

具体实施方法

以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。

实施例1：

本发明对虾虹彩病毒在Genebank数据库中搜索虾虹彩病毒株基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。

表1引物和探针序列:

由图1结果可见，第四组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表2。其它引物探针曲线上升高度较低，CT值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第四组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。

表2引物探针筛选结果分析

组别\结果	CT值	荧光强度
			第一组	18.33	350,000
第二组	11.11	500,000
			第三组	13.56	300,000
第四组	7.83	540,000

实时例2：所述试剂盒虾虹彩病毒

本发明所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、BBuffer、RAA干粉试剂、虾虹彩病毒标准品和ddH₂O。

本发明所述的试剂盒，其中，所述的A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

本发明所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

本发明所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID NO.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2为1:1。

本发明提供的虾虹彩病毒的特异性探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。

本发明提供的虾虹彩病毒标准品包含虾虹彩病毒保守区基因序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

质粒的碱基序列(SEQ ID NO.4):

GGGCGGGAGA TGGTGTTAGA TGGGCAGTCA TGGATGAACC AAATGCTGAC

GAAATCATCA GTTCGGGAAC GTTAAAGGGT CTCACGGGAA ACGATTCGTA

TTGGGCTCGA GATTTGTTCC AACGAGGAAA GGAAACGAAA GAAATTATAC

CCTTTTTCAA ATTACACATG ATTTGCAACA AGCTTCCAGC AATCAAGGAT

GCCGATCAAG CAACGTGGAA TCGAATCAGG GTTATTCCAT TCGAAAGTAC

ATTCAAACAT GAAAACGATT GCCCCGTTGA ATTTGAAGAA CAAATGAAAC

AGAAAACATT CCCCATGGAT AAAAATTTCA CAGAAAAGAT TCCCGAAATG

GTAAAACCCC TGGCTTGGTA TCTTATTCAG AGATGGAAGA CTATCAGGAA

GTGTGAAATT GTAGAGCCAG AGATTGTAAC GGTAGCTACA TCTTCGTACC

GAAACGA

实例3：本发明所述试剂盒虾虹彩病毒

1、阳性样品核酸的提取

1.1、核酸提取：采用海洋动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取。

2、RAA反应体系的配置：每个检测样品对应一个RAA反应干粉管，每个RAA反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表3所示。

表3:

RAA反应体系组分	体积(μL)
		A Buffer	12.5μL
B Buffer	2.5μL
		引物混合液	4μL
特异性荧光探针	0.6μL
		DNA模板	2μL
ddH₂O	28.4μL
		总体积	50μL

A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc

3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行RAA扩增：39℃，40s；39℃，20min，共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。

4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定虾虹彩病毒阳性或阴性结果。

判定结果：FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为虾虹彩病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为虾虹彩病毒阴性结果。

实施例4：本发明RAA检测试剂盒在临床实际应用中的评估

采用本发明试剂盒进行临床盲样的实验，检测500份对虾；实验结果表明，本发明的第四引物对可以区分出虾虹彩病毒，与巢式PCR阳性符合率很高。在500份中，巢式PCR，有318份为阳性结果，182份为阴性结果，通过RAA方法检测的结果为318份为阳性，有181份也为阴性结果，其中一份可能由于污染没有检测出，有182份也为阴性结果，而且都是可以一一对应的。

试验例5：本发明所述试剂盒的灵敏度试验

本发明实施例2所述试剂盒提供的虾虹彩病毒标准品质粒，提取阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。

检测结果如图2所示，从左到右依次为20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的RAA荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达100fg/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的RAA恒温荧光检测试剂盒和检测方法对SIV的诊断具有高度的灵敏性。

试验例6：本发明所述试剂盒的特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实例3中的检测方法，分别对病毒WSSV、IHHNV、EHP、AHPND、HPV样本进行检测，分析本试剂盒对SIV和对虾其他常见病毒的检测情况。

检测结果表明：仅SIV样品出现正常扩增，阴性对照(ddH₂O)及IHHNV、WSSV、AHPND、HPV、EHP样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明RAA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出SIV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。

同时，采用本发明设计的1-3对引物进行同样的特异性实验，发现这些引物不能很好的特异区分不同的样本，特异性不是很好(具体实验数据略)。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

序列表

<110> 杭州众测生物科技有限公司

<120> 虾虹彩病毒（SIV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

<130> 17-100070-00002922

<141> 2017-11-10

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagatggtg ttagatgggc agtcatggat g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttgcttga tcggcatcct tgattgctgg 30

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggatgaac caaatgctga cgaaatcacg tcgggaacgt taa 43

<210> 4

<211> 457

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggcgggaga tggtgttaga tgggcagtca tggatgaacc aaatgctgac gaaatcatca 60

gttcgggaac gttaaagggt ctcacgggaa acgattcgta ttgggctcga gatttgttcc 120

aacgaggaaa ggaaacgaaa gaaattatac cctttttcaa attacacatg atttgcaaca 180

agcttccagc aatcaaggat gccgatcaag caacgtggaa tcgaatcagg gttattccat 240

tcgaaagtac attcaaacat gaaaacgatt gccccgttga atttgaagaa caaatgaaac 300

agaaaacatt ccccatggat aaaaatttca cagaaaagat tcccgaaatg gtaaaacccc 360

tggcttggta tcttattcag agatggaaga ctatcaggaa gtgtgaaatt gtagagccag 420

agattgtaac ggtagctaca tcttcgtacc gaaacga 457

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggagatgg tgttagatgg gcagtca 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctcgttgga acaaatctcg agcccaata 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggatgaac caaatgctga cgaaatcacg tcgggaacgt taa 43

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggcgggagat ggtgttagat gggcagtcat 30

<210> 9

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<212> DNA

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atggatgaac caaatgctga cgaaatcacg tcgggaacgt taa 43

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agatggtgtt agatgggcag tcatggat 28

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gcttgatcgg catccttgat tgctggaagc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggatgaac caaatgctga cgaaatcacg tcgggaacgt taa 43

Claims

1.一种虾虹彩病毒（SIV）核酸的检测试剂盒，包括：虾虹彩病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述虾虹彩病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述虾虹彩病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、B Buffer、RAA干粉试剂、虾虹彩病毒标准品和ddH₂O中至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20% PEG ；B Buffer为280mMMgAc。

5.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸检测试剂盒，虾虹彩病毒标准品为含有虾虹彩病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述含有虾虹彩病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

8.虾虹彩病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA 为模板，在虾虹彩病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、BBuffer和ddH₂O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述虾虹彩病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述虾虹彩病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。