CN106811550B - 一种草鱼呼肠孤病毒ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别引物及含有其的试剂盒与诊断检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物，由以下1对引物组成：HRM‑Ⅱ‑F：5'CACCGGAGTTAAACTTCATCGC‑3'(SEQ ID NO：1)；HRM‑Ⅱ‑R：5'CCTGTGGCAGACCGGCAGATAA 3'(SEQ ID NO：2)；根据草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和已知的Ⅱ型野毒株S2基因5’端和3’端保守区域设计而获得，疫苗株和野毒株扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，这些突变位点为疫苗株所特有，满足HRM对于的GCRVⅡ型疫苗株和野毒株的鉴定分析，同时本发明还根据所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物设计出相应的检测试剂和以及检测方法，提高该技术的实用性能。

Description

一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别引物及含有其 的试剂盒与诊断检测方法

技术领域

本发明涉及一种草鱼呼肠孤病毒体外检测方法，尤其涉及草鱼呼肠孤病毒II型疫苗株和强毒株鉴别诊断方法及试剂盒，本发明属于病毒分子生物学领域。

背景技术

草鱼是我国最重要的淡水养殖鱼类之一，在我国淡水养殖中占重要地位，其产量约占我国淡水养殖总产量的20％以上。近年来，越南、缅甸等东南亚国家的草鱼养殖规模也越来越大，草鱼养殖渐有国际化的趋势。但草鱼病毒性出血病的频频发生大大降低了其成活率，给养殖户造成了巨大的经济损失，据不完全统计，每年由于草鱼出血病导致的经济损失至少达10亿，该病病原及其防治技术的研究多次被列为国家科技攻关项目。

草鱼出血病(grass carp hemorrhage)是草鱼的一种严重病毒性疾病，主要危害1月龄草鱼和2月龄草鱼种，而且还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条鱼等,并能使这几种鱼发生出血病症状而死亡，该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重影响了广大养殖者的积极性和我国淡水养殖业的健康发展。草鱼出血病的病原为草鱼呼肠孤病毒(grasscarp reovirus，GCRV)，它隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率一般为30％-50％，最高可达60％-80％，为养殖业带来巨大损失。

目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防，细胞弱毒疫苗和组织浆灭活疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了一定的效果。尽管疫苗接种的实施在草鱼出血病的预防上取得了很大的成功，然而鱼群的群体免疫依然存在一些缺陷。目前，缺少有效的检测鉴别方法能对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒疫苗株与引发鱼出血病的Ⅱ型强毒株予以鉴别区分。之前研究人员针对病原或者鱼体产生的抗体建立了GCRV的检测方法，例如病毒分离、免疫荧光检测、RT-PCR检测、RT-LAMP检测、TaqMan rea-l time PCR检测、S6基因序列分析、草鱼呼肠孤病毒HZ08株全基因组分子特征分析等，在不同的领域虽然有其成功的应用，但是仍然不能够区别Ⅱ型-GCRV强、弱毒株。科学正确地鉴定每一例草鱼出血病病例是由免疫弱毒疫苗后携带了Ⅱ型-GCRV弱毒疫苗株，还是由于感染了Ⅱ型-GCRV强毒株，对科学判断草鱼出血病的发病率有着重要的影响，对及时采取针对性的有效措施也有着指导意义。因此，建立一个可靠的、快速的Ⅱ型-GCRV强、弱毒株鉴别检测方法具有现实意义，它既可以用于筛选出那些无典型症状的出血病草鱼，也能鉴别区分Ⅱ型-GCRV强、弱毒株。

迄今为止，人们在应对Ⅱ型-GCRV的强、弱毒株鉴别检测问题上鲜有研究。经常作为病毒检测“金标准”的电子显微镜检测技术，虽可捕捉观测到病毒粒子，但很难从形态上对Ⅱ型-GCRV病毒强、弱毒株予以区分；根据血清学建立的特异性抗体检测方法，往往费时费力，且在实际应用中往往无法确定这些抗体的存在是由于Ⅱ型-GCRV强毒株感染产生还是接种Ⅱ型-GCRV弱毒株应答产生；基于常规PCR建立的检测方法，难免在实验操作、结果判定、尤其是实验中难以避免使用溴化乙锭(一种有致癌作用的染料)等方面使得操作人员不愿接受；而多重Real-time RT-PCR往往由于技术的复杂性，而使得操作人员不易掌握。HRM分析技术具有操作简便、快速，高通量、低成本，灵敏度高、特异性好，并且真正实现闭管操作的技术特点，是近年来国际上新兴的单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism,SNP)及突变研究工具。DNA双链的HRM熔解曲线图形取决于许多因素，包括GC含量、长度、序列和杂合性。其原理是实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，由于SNP位点不匹配，双链DNA会在逐步升温过程中分别变性，释放出有变化的荧光强度。在进行针对已知核苷酸位点的基因分型工作中，无需序列特异性探针，可直接采用小片段扩增，在PCR扩增结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的曲线分析。因此，HRM分析能够有效区分不同SNP位点及不同基因型。HRM分析技术具有操作简便、快速，高通量、低成本，灵敏度高、特异性好，并且真正实现闭管操作的技术特点，宁蓬勃等曾使用HRM法对猪瘟石门株和C株进行鉴别，且取得了较好的结果。

因此，基于定量PCR(quantitative PCR,qPCR)检测的高分辨溶解曲线(Highresolution melting,HRM)技术，建立单孔、无探针、高灵敏度、快速便捷的Ⅱ型-GCRV强、弱毒株鉴别检测方法，既为本研究遴选阴性GCRV感染细胞株及确定Ⅱ型-GCRV强、弱毒株是否在细胞中形成唯一感染提供研究方法，也可为草鱼养殖业中草鱼出血病的临床诊断、流行病学调查、病原监测等提供重要的检测工具，为我国草鱼出血病疫苗的推广使用、草鱼出血病的防控甚至彻底消灭提供重要的技术保障。

疫苗免疫是防治草鱼出血病最为有效的措施，也是今后控制和消灭草鱼出血病的最为关键的环节。当前，唯一获得法规许可的商品化草鱼出血病疫苗为弱毒活疫苗，而在实际应用过程中，因为缺乏有效的鉴别诊断方法，一旦草鱼发病或者带毒，无法区分是疫苗株免疫还是野毒株感染所致，给草鱼出血病的防控造成巨大困扰。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株进行鉴别诊断的检测方法，该方法敏感性强，特异性高，可以快速、准确的对GCRVⅡ型疫苗株和野毒株进行检测、定量分析和区分鉴定。

本发明专利中，基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物设计出相应的检测试剂和以及检测方法，可以很好的解决背景技术中提到问题。

本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的目的之一在于提出了一种基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物，能够实现HRM对于的GCRVⅡ型疫苗株和野毒株的鉴定分析，所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物，由以下1对引物组成：

HRM-Ⅱ-F：5'CACCGGAGTTAAACTTCATCGC-3'(SEQ ID NO：1)；

HRM-Ⅱ-R：5'CCTGTGGCAGACCGGCAGATAA 3'(SEQ ID NO：2)；

该对检测引物是分别根据草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和已知的Ⅱ型野毒株S2基因5’端和3’端保守区域设计而获得，疫苗株和野毒株扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，这些突变位点为疫苗株所特有，满足HRM对于的GCRVⅡ型疫苗株和野毒株的鉴定分析。

本发明的另一个目的在于提出了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒，能够实现快速对于的GCRVⅡ型疫苗株和野毒株的鉴定分析。所述草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒，包括引物液、Tap DNA聚合酶、10×HRMQ-PCR buffer(含500mM KCl,100mM Tris-HCl,15mM MgCl2，10mM dNTP混合物)，所述引物液为所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物经合成之后的稀释水溶液。

进一步，所述草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒中，还含有草鱼呼肠病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株的阳性和阴性参考品。

进一步的，所述阳性参考品为灭活的草鱼呼肠病毒Ⅱ型疫苗株(JX0902株)和野毒株(HuNan1307株)培养液；所述阴性参考品为无RNA的去离子水。

作为本发明的另一个目的，在于提出了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测方法，简便易行，结果可靠。所述草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测方法，包括如下步骤：

1)提取待检组织总RNA；

2)对待检样品总RNA进行逆转录反应；

3)将所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物稀释后加入HRM Q-PCR反应体系中，再加入Tap DNA聚合酶，以反转录产物cDNA为模板，进行HRM Q-PCR扩增反应；

4)扩增过程完成后，参考该仪器制造商推荐的参数，以2s时间0.1℃的温度增量在70～90℃温度区间进行HRM分析，来区分疫苗株和野毒株。

作为优选的，所述HRM Q-PCR反应体系为25μL，包括所述引物液，其中每条引物(SEQ ID NO:1～2)的终浓度均为1pmol/μL，2.5μL 10×HRM Q-PCR buffer，5U Tap DNA聚合酶，终浓度各为0.1mM的dNTP混合物，用3μL反转录产物cDNA作为模板，用水补至25μL。

作为优选的，所述HRM Q-PCR buffer扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，52℃退火30s，72℃延伸10s，循环45次。

需要重点说明的是，本发明中公开的引物对是解决本发明中背景技术的一个重要点，即，所述的扩增引物对HRM-Ⅱ-F：5'CACCGGAGTTAAACTTCATCGC-3和HRM-Ⅱ-R：R：5'CCTGTGGCAGACCGGCAGATAA 3'是基于大量的创新性研究工作而获得：一是完成了弱毒疫苗株和多个野毒株的全基因组序列测定；二是比较和分析了弱毒疫苗株和与大量野毒株的全基因组序列差异，分别在5’端和3’端保守区域设计多对上、下有引物，而且疫苗株和野毒株的扩增片段之间存在一个或多个固定的碱基突变位点；三是通过对扩增过程的HRM分析，筛选出疫苗株和野毒株的HRM有明显差异的引物对，以达到对疫苗株和野毒株的鉴别检测。

本发明的所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物，是根据草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株S2基因5’端和3’端共有的保守区域设计而获得，疫苗株和野毒株的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，这些突变位点为疫苗株所特有，满足HRM对于的GCRVⅡ型疫苗株和野毒株的鉴定分析，同时本发明还根据所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物设计出相应的检测试剂和以及检测方法，提高该技术的实用性能。

本发明中，根据HRM技术可以对DNA序列中单个碱基差异予以区分这一原理，针对目前草鱼呼肠孤病毒变异株及疫苗毒株的多种性，而目前的检测技术难以判定区分GCRV苗株和野毒株的现状，基于GCRV疫苗株和野毒株的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，首次建立了GCRVⅡ型疫苗株和野毒株高分辨率溶解曲线HRM鉴别检测技术，实现疫苗株和野毒株的鉴别诊断。该检测方法的优势效果还在于：高通量，1次可同时检测10-384样本；高敏度，HRM检测灵敏度达1％-0.1％，是传统“PCR+测序”方法25-250倍；特异性好，PCR产物无需后续处理，特异性达100％，重复性好：用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。

附图说明

图1为引物检测GCRVⅡ型弱毒疫苗株和野毒株的PCR扩增效果，其中其中M为DNA分子量标准，1、2、3、4、5分别为以弱毒疫苗株JX0902与野毒株HuNan1307、HZ08、GD1607和GX1407为模板的扩增结果，6为以水为模板的阴性对照；

图2为引物检测GCRVⅡ型弱毒疫苗株和野毒株的qPCR扩增和HRM分析效果；

图3为HRM Q-PCR标准化检测和鉴别检测效果；

图4为HRM Q-PCR特异性分析效果；

图5为HRM Q-PCR敏感性分析效果；

图6为PCR和HRM Q-PCR对草鱼出血病临床样品的检测效果；其中A为PCR对临床样品的检测结果，M为DNA分子量标准，1为阴性对照，2-10分别为9分草鱼出血病临床样品。

具体实施方式

下面结合具体实施案例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施案例尽是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明任何技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：特异性引物的设计与合成

从NCBI获得HuNan1307、GD108、106、918、HeNan988、HeNan794、HZ08和109共8个GCRV-Ⅱ型野毒株和弱毒疫苗株908株的S2基因序列进行比对、分析，采用Oligo 6.0软件，分别根据草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和已知的Ⅱ型野毒株S2基因5’端和3’端保守区域设计引物，疫苗株和野毒株扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点。上游引物HRM-Ⅱ-F序列为：5’-CACCGGAGTTAAACTTCATCGC-3’,下游引物HRM-Ⅱ-R序列为：5’-CCTGTGGCAGACCGGCAGATAA-3’，预期的PCR扩增产物长度为233bp。

实施例2：RNA提取和cDNA制备

按Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司，货号：15596-026)的说明书或按照QiagenRNA提取试剂盒(购自Qiagen公司，货号：74104)的说明书步骤，从感染相应病毒的鱼体内脏组织中提取RNA，作为RT-PCR反应的模板。Trizol法提取总RNA的主要步骤如下：取组织样品加入500μl Trizol试剂，混匀后静置5分钟，加入400μl氯仿，振荡混匀1min，12000rpm于4℃离心15min，取上清加入等体积异丙醇，颠倒混匀，4℃放置15min,12000rpm于4℃离心15min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，12000rpm于4℃离心5min，用30μl无RNAse水重悬沉淀。然后将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

实施例3：GCRVⅡ病毒PCR检测

采用PCR方法检测被弱毒疫苗株JX0902和野毒株HuNan1307、HZ08、GD1607和GX1407分别感染的GSB细胞。PCR体系为：c DNA 1.0μL，上游引物HRM-Ⅱ-F和下游引物HRM-Ⅱ-R分别为0.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10×PCR buffer 1.0μL，Taq酶0.5μL，超纯水加至10μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min；4℃结束反应。用琼脂糖和电泳缓冲液制备10g/L的琼脂糖电泳胶，进行电泳。电泳结束后用凝胶成像系统对电泳胶进行观察和照片采集。结果显示，无论是在弱毒疫苗株或野毒株感染的GSB细胞样品中，经扩增后均可得到位置相同、大小约233bp的条带，与预期结果相符(见图1)。

实施例4：对GCRVⅡ型疫苗株和野毒株的qPCR检测

对弱毒疫苗株JX0902和野毒株HuNan1307、HZ08、GD1607和GX1407分别感染的GSB细胞，采用实时荧光定量PCR进行检测，反应体系为：10×HRM Q-PCR buffer 2.5μL，25pmol/μL的HRM-Ⅱ-F和HRM-Ⅱ-R引物各1μL，5U Tap DNA聚合酶，10mM的dNTP 1μL，3μL反转录产物cDNA作为模板，超纯水加至25μL。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，52℃退火30s，72℃延伸10s，循环45次。扩增过程完成后，以2s时间间隔，0.1℃的温度增量在70～90℃温度区间进行HRM分析。分析软件为QIAGEN公司的Rotor-GeneTMQ software。

结果显示，无论是弱毒疫苗株株还是野毒株，经HRM检测后均能得到特异性的溶解曲线，检出结果与PCR检测获得的阳性结果相一致。采用HRM分析方法可实现对弱毒疫苗株和野毒株的特异性检测。

实施例5标准化检测和鉴别检测

对于弱毒疫苗株JX0902和野毒株HuNan1307感染的GSB细胞样品中检测获得熔解曲线之后，进一步进行HRM分析，如图3A所示，随着温度的逐渐增加，在82℃区间位置，JX0902株和HuNan1307株的熔解曲线逐渐分开，从而达到鉴别检测的目的。在图3B所示的鉴别性曲线中，对JX0902株和HuNan1307株感染GSB细胞样品中得到HRM特异性熔解曲线，采用HRM分析软件进一步给予展示。GCRV-Ⅱ不同毒株感染的GSB细胞样品中可以得到不同区域位置的特异性熔解曲线，此时JX0902株和HuNan1307株通过HRM方法给予鉴别区分，实现了鉴别检测。

实施例6特异性分析

为了检测本发明试剂盒的特异性，用本发明的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒来检测KHV、IHNV、LMBV、ISKNV、GCRV HuNan1307(Ⅱ型)、JX09-02(Ⅱ型)、JX09-01(Ⅰ型)、104株(Ⅲ型)，分析本方法对鱼类其它常见病毒和草鱼呼肠孤病毒检测情况。检测结果表明：采用HRM qPCR分析方法检测GCRV-Ⅱ感染样品中，总能得到一条特异性鉴别溶解曲线，对于其他基因型GCRV和KHV、IHNV、LMBV、ISKNV的核酸，则没有特异性溶解曲线检出(图4)。表明本发明检测试剂盒能特异性扩增出GCRV基因Ⅱ型病毒的核酸，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，具有较好的特异性。

实施例7敏感性检测

本试验对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(HuNan1307株)RNA进行10倍倍比稀释，检测结果表明，本发明试剂盒具有良好的灵敏性，最低检出限是10pg(图6)。试验结果表明，本发明试剂盒对于草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的诊断具有高度的灵敏性

实施例8临床样品检测(PCR和qPCR)

采用PCR方法选取临床获得的9份草鱼出血病样品进行检测，如图5所示，在这9份样品提取的RNA中，PCR扩增后均得到了位置相同、大小约323bp的条带，提示这9尾鱼存在GCRVⅡ型的感染，但仅从这一步的PCR检测，无法鉴别区分是弱毒疫苗株还是野毒株造成的感染。应用建立的HRM分析方法，对不同养殖场获取的草鱼出血病临床样本进行检测。如图6所示，有9份样品检测到HRM特异性熔解曲线，阳性结果与PCR中的阳性样本检测结果相一致。进一步应用HRM检测分析方法，对得到的9份样品的HRM特异性熔解曲线进行鉴别分析，HRM可以区分弱毒疫苗株和野毒株的不同感染，结果提示其中2份样品为弱毒疫苗株阳性，而另外7份为野毒株阳性感染。

Claims (7)

1.一种基于高分辨率溶解曲线的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物，由以下1对引物组成：HRM-Ⅱ-F：5'CACCGGAGTTAAACTTCATCGC-3'；HRM-Ⅱ-R：5'CCTGTGGCAGACCGGCAGATAA 3'。

2.一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒，其特征在于，包括引物液、Taq DNA聚合酶、10×HRM Q-PCR buffer，所述引物液含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2中所述草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒，其特征在于：还含有草鱼呼肠病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株的阳性和阴性参考品。

4.根据权利要求3中所述草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测试剂盒，其特征在于：所述阳性参考品为灭活的草鱼呼肠病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株培养液；所述阴性参考品为无RNA的去离子水。

5.一种非疾病诊断目的的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测方法，包括如下步骤：

1)提取待检组织总RNA；

2)对待检样品总RNA进行逆转录反应；

3)将权利要求1所述引物稀释后加入HRM Q-PCR反应体系中，再加入Taq DNA聚合酶，以反转录产物cDNA为模板，进行HRM Q-PCR扩增反应；

4)扩增过程完成后，以2s时间0.1℃的温度增量在70～90℃温度区间进行HRM分析，来区分疫苗株和野毒株。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述HRM Q-PCR反应体系为25μL，包括权利要求1所述的引物组，其中每条引物的终浓度均为1pmol/μL，2.5μL 10×HRM Q-PCRbuffer，5U Taq DNA聚合酶，终浓度各为0.1mM的dNTP混合物，用3μL反转录产物cDNA作为模板，用水补至25μL。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，HRM Q-PCR buffer扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，52℃退火30s，72℃延伸10s，循环45次。

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