CN100469895C - 用于乙肝病毒的荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒，属于生物技术领域。本发明的方法是通过对乙型肝炎病毒表面抗原，核心抗原和E抗原区等三对不同的引物和探针的优化，筛选出了扩增效果最好的一对引物和探针。比较了用不同方法提取的血清DNA样本进行荧光定量PCR扩增时乙肝病毒拷贝数的变化，优化了乙肝病毒的提取方法。本发明采用优化的引物和探针以及简单的病毒DNA提取方法进行定量PCR检测，具有灵敏度高，特异性强，成本低廉，耗时短，检测准确等优点。本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒。本发明可以用于临床及科研中对乙肝病毒患者血清HBV的定量检测，从而指导临床治疗。

Description

用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明具体涉及一种快速定量检测乙肝病毒血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

乙肝病毒感染是引起急、慢性肝脏疾病的主要原因。全球约有30％的人口，即20亿人曾感染过乙肝病毒，约有3.5亿慢性HBV感染者正面临着发展为致死性肝病的风险，每年约有100万慢性乙肝感染者死于肝硬化和肝癌。在已知的人类致癌因子中，乙肝病毒仅次于烟草位居第二。而我国作为肝炎大国，约50％—70％的人群受过乙肝病毒感染，8％—12％的人群为乙肝病毒表面抗原携带者。

鉴于慢性乙肝病毒的高发病率和病死率，而且感染持续周期长，医疗费用累积起来相当可观。同经济负担一样，乙肝病毒感染给病人的生活质量和生活期望带来了沉重的负担。同时，由于劳动力和工作时间的减少，在发病率高的国家，慢性乙型肝炎感染对国家经济和社会造成的影响尤为严重。

目前最常见的基因检测方法主要有杂交法和PCR(聚合酶链式反应)，杂交法的特异性优于PCR法，但灵敏度受限，PCR的灵敏度胜过杂交法。常规的PCR方法易污染、阳性率低、需进行后处理，而且不能准确提供病毒在体内含量的高低。血液中乙肝病毒的定量分析对于疾病的治疗和预后等都有一定的意义，例如使用干扰素抗病毒治疗的病人，判断疗效的重要手段之一是观察HBV基因含量在治疗前后一定时间内的变化。病毒基因首先呈对数级下降，则预示有反应性；继之至某一阶段降至检测灵敏度之下，最终病毒可能被完全清除。荧光定量PCR技术具有实时监测、绝对定量和高通量检测等特点，而且操作简便，灵敏度高，能用于血站筛查献血员，同时也对乙肝治疗方案的选择、疗效观察和判断预后等提供了重要工具。

荧光定量PCR是利用PCR扩增时在加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记有一报告荧光基团和一淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq(肽可)DNA聚合酶的5′-3.外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分开，从而荧光检测系统可以接受到荧光信号，即每扩增一条DNA(脱氧核糖核苷酸)链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。另一种相对定量方法是在PCR反应中加入SYBR GREEN I(赛博绿I)染料，它能特异性地嵌入DNA双链中，从而发射荧光信号，而不掺入双链中的SYBR GREEN I染料则不发出任何荧光。该方法特异性不强，不适于临床应用。

发明内容

本发明的技术任务在于提供一种精确、简便的用于定量乙肝病毒血清DNA的方法；本发明的又一技术任务在于提供一种用于该方法的试剂盒。

本发明的一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的特点在于，在按下述方法优化得到的引物和对应探针，乙肝病毒DNA提取方法的基础上，对血清样本中提取的血清DNA进行荧光定量PCR扩增，实现对乙肝病毒的定量检测。

所述的优化得到的探针和引物序列是源于乙肝病毒表面抗原S区的基因保守区域，上、下游引物和探针序列分别为：

RSU：5’AGAATCCTCACAATACCGCAGAGT3’

RSL：5’CACACGGTAGTTCCCCCTAGAA3’

PS：5’FAM-AGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAAT-TAMARA3’

所述的优化探针序列是同乙肝病毒核心抗原C区、E抗原基因保守区域内的引物和探针比较得到的：

乙肝病毒核心抗原C区的引物和探针序列为：

RCU：5’GTCTTTCGGAGTGTGGATTCG3’

RCL：5’CGGCGATTGAGACCTTCGT3’

PC：5’FAM-TCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTC-TAMARA3’

乙肝病毒E抗原C区的引物和探针序列为：

RXU：5’ACTCCCCGTCTGTGCCTTCT3’

RXL：5’CATTCGGTGGGCGTTCAC3’

PX：5’FAM-CCGGACCGTGTGCACTTCGCTT-TAMARA3’

优选的，上述的乙肝病毒DNA的提取方法如下：待检测血清和阴性对照血清100μl加入A液100μl，80℃保温10分钟，12000转速离心5分钟，取上清，加入50μl B液；所述的A液为0.4M NaOH，B液为0.4M Tris-HCl pH7.5；

优选的，上述的荧光定量PCR扩增条件为：94℃3分钟1个循环→94℃10秒，60℃30秒40个循环；其中荧光信号收集设置在每一循环的60℃30秒内；

本发明所述的一种用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测方法的试剂盒，该试剂盒含有血清DNA提取溶液A和B，2×定量PCR反应液，Taq DNA聚合酶，标准品，阴性对照，阳性对照；

上述的用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测方法的试剂盒中，所述的血清DNA提取溶液A和B分别为为0.4M NaOH、0.4M Tris-HCl pH7.5；

上述的用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测方法的试剂盒中，优选的，所述的2×定量PCR反应液包括反应缓冲液、400μM/L dNTP、0.4μmol/L的上下游引物RSU与RSL、0.2μmol/L的探针PS；所述的Taq DNA聚合酶为20μl反应总体系中含有1U；所述的反应缓冲液是100mM/L Tris-HCl pH8.3、100mM/LKCl、7.5mM/LMgCl₂。

上述的用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测方法的试剂盒中，优选的，所述的标准品为插入到pGEM-T载体上的一段长为74个碱基对的乙肝表面抗原S区的一部分序列的重组载体，用于构建重组载体标准曲线的标准品拷贝数分别为1×10³—10⁷等5个梯度；

上述的用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测方法的试剂盒中，优选的，所述的阴性对照为不含乙肝病毒的正常人血清，阳性对照为含有乙肝病毒的患者血清。

本发明在对乙肝病毒全基因组序列比对的基础上在乙肝病毒的保守区域针对表面抗原S、核心抗原C以及E抗原共设计了三对引物和探针，经定量PCR优化筛选出了扩增效果最好的一对引物和探针。同时，对乙肝病毒DNA的提取方法进行了筛选，缩短了病毒DNA提取时间，简化了操作流程，从而提高了检测灵敏度，准确度。荧光定量PCR在扩增完后直接通过标准曲线定量起始病毒拷贝数，能为临床提供可靠的信息。同时，所提供的荧光定量PCR试剂盒操作简单快捷，适于临床检验的要求。

以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明。

附图说明

图1乙肝病毒表面抗原S、核心抗原C以及E抗原区用于重组入克隆载体的PCR扩增产物凝胶电泳图谱。其中泳道1与2、3与4、5与6分别源于S区，C区与E区，扩增片段大小分别为74bp、153bp、94bp(base pair，碱基对)；泳道M为DL-2000分子量Marker，片段大小从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2对同一标本分别采用针对乙肝病毒表面抗原S、核心抗原C以及E抗原等区域的三对引物和探针进行荧光定量PCR扩增，以及三个区域的1×10³-1×10⁷等5个梯度的标准样本进行荧光定量PCR所得到的扩增曲线。横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值。

图3对同一样本分别采用针对乙肝病毒表面抗原S、核心抗原C以及E抗原等区域的三对引物和探针进行荧光定量PCR扩增得到的三个区域的标准曲线图。其中，横坐标代表拷贝数，纵坐标代表循环数。图3A样本采用乙肝病毒表面抗原S区的标准品检测时的标准曲线；图3B样本采用乙肝病毒核心抗原C区的标准品检测时的标准曲线；图3C样本采用乙肝病毒E抗原区的标准品检测时的标准曲线。

图4以重组有乙肝病毒表面抗原S区的克隆载体为标准品，采用六种不同血清DNA提取方法，对三例阳性乙肝血清标本进行检测时得到的荧光定量曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值。

图5以重组有乙肝病毒表面抗原S区的克隆载体为标准品，采用六种不同血清DNA提取方法，检测三例阳性乙肝血清标本时得到的标准曲线，横坐标代表拷贝数，纵坐标代表循环数。

图6以重组有乙肝病毒表面抗原S区的克隆载体为标准品，采用NaOH裂解法对8例临床标本进行检测时得到的荧光定量曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值。

图7以重组有乙肝病毒表面抗原S区的克隆载体为标准品，采用NaOH裂解法对8例临床标本进行检测时得到的标准曲线，横坐标代表拷贝数，纵坐标代表循环数。

具体实施方式

实施例1.乙肝病毒荧光定量PCR引物和探针的设计与合成

(1)序列比对：利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast网站提供的序列比对功能进行HBV全基因序列比对，找出全基因组范围内的保守区域。

(2)利用Beacon Designer 2.1(分子信标设计软件2.1)软件设计荧光定量PCR引物和探针，所设计的三对引物和探针分别位于表面抗原S、核心抗原C和E抗原的保守区域内，引物和探针序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

S 区上、下游引物和探针：

RSU：5’AGAATCCTCACAATACCGCAGAGT3’

RSL：5’CACACGGTAGTTCCCCCTAGAA3

PS：5’FAM-AGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAAT-TAMARA3’

C 区上、下游引物和探针：

RCU：5’GTCTTTCGGAGTGTGGATTCG3’

RCL：5’CGGCGATTGAGACCTTCGT3’

PC：5’FAM-TCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTC-TAMARA3’

X 区上、下游引物和探针：

RXU：5’ACTCCCCGTCTGTGCCTTCT3’

RXL：5’CATTCGGTGGGCGTTCAC3’

PX：5’FAM-CCGGACCGTGTGCACTTCGCTT-TAMARA3’

实施例2.检测标准品的制备

(1)病毒DNA的提取

乙型肝炎病毒患者血清50μl加入50μl 0.4M NaOH，80℃保温10分钟。15000转速离心30秒，取上清，加入25μl 0.4M Tris-HCl pH7.5。

(2)PCR扩增

采用与荧光定量PCR表面抗原S、核心抗原C和E抗原相同的上下游引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系为25μl，其中包括

10×PCR缓冲液成分为500mM/L Tris-HCl pH8.3，500mM/LKCl，20mM MgCl₂。扩增采用MJ Research公司PTC-220扩增仪，程序为94℃2分钟预变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒循环30次，72℃延伸5分钟。扩增片段大小分别为74bp，154bp，94bp(图1)。

(3)PCR产物回收与克隆载体的构建

25μl PCR产物经电泳检测后，采用QIAGEN公司的凝胶回收试剂盒回收。回收的PCR产物经定量后与pGEM-T(Promega公司)克隆载体连接，转化入DH5α宿主菌并将阳性克隆经测序鉴定。

(4)重组载体的定量与标准品的准备

采用Omega公司的质粒提取试剂盒提取质粒，经紫外定量后换算成copies/μl(拷贝数/微升)，即为标准品。

实施例3.标准曲线的制备及其优化

根据定量后得到的拷贝数，将三个区域的样本分别作成1×10³-10⁷(copies/μl)等5个梯度稀释的检测标准品，分别做出针对于三个区域的三条标准曲线，检测同一病毒标本在三条不同标准曲线上的Ct值(Ct即cycle threshold，指每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时的所经历的循环数)和拷贝数，从而确定扩增效果最好的标准曲线。其中，每一样本都设有三个重复，为降低加样误差，提高实验可重复性，采用Thermo Electron(赛摩公司)电动加样枪加样，每一实验孔做三个重复。

(1)病毒DNA的提取

同检测标准品的制备中(1)病毒DNA的提取

(2)荧光定量PCR扩增

扩增体系为20μl,其中包括

其中2×PCR反应液包括100mM/L Tris-HCl pH8.3，100mM/LKCl，7.0mM/L MgCl₂)、400μM/L dNTP、0.4μmol/L的上下游引物、0.2μmol/L的探针。上下游引物和探针分别为表面抗原S、核心抗原C、E抗原的RSU，RSL，PS；RCU，RCL，PC；RXU，RXL，PX；DNA为相应的三个区域的标准品DNA1μl，或是待测乙肝病毒DNA样本2μl。

PCR扩增采用Bio-Rad PTC-225PCR扩增仪，程序为：

94℃ 3分钟1个循环

94℃ 20秒、60℃ 40秒共计40个循环

其中荧光信号的收集设置在在60℃ 40秒的每一个循环中。

(3)标准曲线的制备

PCR荧光信号的分析采用Bio-Rad(伯乐)公司iCycler^TMiQ 3.0a版本的软件，所得到的实时PCR扩增曲线以及相应的三条标准曲线分别见附图2，3A、3B、3C。同一标本在三条不同标准曲线中的Ct值和拷贝数及其标准方差和变异系数见表1

表1 同一样本在三条不同标准曲线中Ct值和拷贝数的变化

根据对同一标本在三条不同标准曲线上所对应的Ct值和拷贝数的分析，表面抗原S标准曲线效果最佳，其次为E抗原区和C抗原区。

实施例4.乙肝病毒血清DNA的不同提取方法对荧光定量PCR检测的影响

(1)提取乙肝病毒患者阳性血清DNA

方法1：异硫氰酸胍法

①100μl乙肝血清，加入3倍体积的异硫氰酸胍裂解液(4M异硫氰酸胍、0.2％巯基乙醇、0.1M Tris-Cl，pH7.5)，混匀。

②加入等体积的氯仿、异戊醇溶液(24：1)充分混匀，于室温12000rpm(转速/分钟)离心15分钟。

③小心将上清液移入另一1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。-20℃放置2个小时，4℃，12000rpm离心15分钟。

④离心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm离心10分钟。

⑤沉淀自然干燥后溶于30μl纯水中。

方法2：蛋白酶K法

①100μl乙肝血清加入100μl蛋白酶K裂解液(1mol/L Tris-HCL、0.5mol/L EDTAPH8.0、100g/L SDS、200μl/ml的蛋白酶K)，55℃温育2小时，将处理后的样品煮沸15min。

②以下操作同方法1异硫氰酸胍法中的②-⑤。

方法3：NaI法

①100μl血清加入100μlNaI裂解液(6mol/L NaI、0.5％SDS、26mmol/L Tris-HCl、13mmol/L EDTA，PH8.0)，60℃温育15分钟。

②以下操作同方法1异硫氰酸胍法中的②-⑤。

方法4：NaOH裂解法

100μl血清加入100μl 0.3mol/L的NaOH，80℃温育10分钟，12000rpm室温离心5分钟，吸取上清加入50μL 0.4mol/L的Tris-HCl PH7.5，4℃保存。

方法5：碱裂解法

100μl血清加入100μl碱裂解液(1mol/L NaOH，2mol/L NaCl，0.5％SDS)煮沸10分钟，12000rpm室温离心5、分钟，吸取上清4℃保存。

方法6：直接煮沸法

取100μl血清加100μlPBS煮沸10分钟，12000rpm室温离心5分钟，吸取上清4℃保存。

(2)荧光定量PCR反应

同(三)标准曲线的制备及其优化中的步骤2)，但所用的引物和探针采用表面抗原区的RSU、RSL、PS。

(3)PCR荧光信号的分析采用Bio-Rad公司iCycler^TMiQ 3.0a版本的软件

乙肝病毒血清DNA六种不同方法所得到的扩增曲线如图4，相应的标准曲线如图5，根据图5的标准曲线得到的三种不同标本六种不同方法的拷贝数和Ct值如表2，表3。

表2 不同提取方法对乙肝病毒检测含量的影响

注：拷贝数/ml指每毫升血清中所含乙肝病毒的拷贝数

表3 不同提取方法对乙肝病毒检测Ct值的影响

从表2，3中可以看出，病毒提取的最佳方法是方法4，即NaOH裂解法。其次是直接煮沸法，但该方法不适于提取粘稠度较高的血样标本。方法5对三种血清标本的检测结果均为阴性；方法1、2、3由于操作繁琐，不可避免地丢失了大量DNA。

实施例5.临床标本检测

根据上述优化的标准曲线和血清DNA提取方法，采用本发明提供的试剂盒对8例阳性临床标本进行检测，所得到的Ct值和拷贝数平均值及其相应的标准差和变异系数见表4。

表4 采用NaOH裂解法提取乙肝病毒血清DNA，以S区重组克隆载体作为标准品时各标本的Ct值和拷贝数

序列表

<110>山东省医药生物技术研究中心

<120>乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒

<160>9

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(24)

<400>1

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(22)

<223>

<400>2

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(25)

<223>5’端连有荧光基团FAM，3’端连有淬灭基团TAMARA

<400>3

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(21)

<223>

<400>4

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(19)

<223>

<400>5

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(28)

<223>5’端连有荧光基团FAM，3’端连有淬灭基团TAMARA

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(20)

<223>

<400>7

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(18)

<223>

<400>8

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<221>misc_feature

<222>(1)…(22)

<223>5’端连有荧光基团FAM，3’端连有淬灭基团TAMARA

<400>9

Claims (1)

1.一种用于乙肝病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒含有血清DNA提取溶液A和B，2×定量PCR反应液，Taq DNA聚合酶，标准品，阴性对照，阳性对照，所述含有血清DNA提取溶液A和B分别为0.4M NaOH、pH7.5的0.4M Tris-HCl，其特征在于，

(1)所述的2×定量PCR反应液包括PCR反应缓冲液、400μM/L dNTP、0.4μmol/L的上下游引物RSU与RSL、0.2μmol/L的探针PS；所述引物和对应探针是源于乙肝病毒表面抗原S区的基因保守区域的探针和引物序列，上、下游引物和探针序列分别为：

RSU：5’AGAATCCTCACAATACCGCAGAGT 3’

RSL：5’CACACGGTAGTTCCCCCTAGAA 3’

PS：5’FAM-AGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAAT-TAMARA 3’；

所述的PCR反应缓冲液是100mM/L Tris-HCl pH8.3，100mM/L KCl，7.0mM/L MgCl₂；所述的Taq DNA聚合酶为20μl反应总体系中含有1U单位；

(2)所述的标准品为插入到pGEM-T载体上的一段长为74个碱基对的乙肝病毒表面抗原S区的一部分序列的重组载体，用于构建重组载体标准曲线的标准品拷贝数分别为1×10³—10⁷ 5个梯度；

(3)所述的阴性对照为不含乙肝病毒的正常人血清，阳性对照为含有乙肝病毒的患者血清。

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