CN116286792A - 一种全血基因组dna快提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA提取领域，具体而言，涉及一种全血基因组DNA快提取试剂盒及其使用方法，可用于常规PCR扩增和荧光定量PCR。本发明提供的全血基因组DNA快提取试剂盒，包括独立包装的红细胞裂解液、Solution A和Solution B；所述红细胞裂解液包括如下组分：浓度为155mM的NH4Cl，浓度为12mM的NaHCO3，和浓度为0.1mM EDTA；所述Solution A包括如下组分：浓度为0.2M的NaOH；所述Solution B包括如下组分：浓度为1M pH 7.8的Tris‑HCl。本发明的试剂组分简单，成本低廉，全血投入量只需要20μl，且省去蛋白酶k、吸附柱和磁珠等试剂耗材，很大程度上降低成本，在核酸提取过程中省去清洗等步骤，整个提取过程5min即可完成，提取效率高。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取领域，具体而言，涉及一种全血基因组DNA快提取试剂盒及其使用方法，可用于常规PCR扩增和荧光定量PCR。
背景技术
随着分子生物学技术快速发展，基因组水平上的研究已成为研究热点。分子生物学中很多实验都涉及到基因组DNA提取，基因组DNA提取作为分子实验中最基础的实验之一，常规PCR扩增、荧光定量PCR和文库构建等实验都需要提取DNA，随着现代诊断技术和精准医疗的蓬勃发展，需要处理的样品量日益增多，因此高效DNA提取方法成为相关研究领域的迫切需求。
目前基因组DNA提取的方法有很多种，例如苯酚氯仿抽提法、SDS法、离心柱法和磁珠法，每种方法各有优缺点。并且市面上全血DNA提取试剂盒种类繁多，但目前的全血DNA提取试剂盒提取时存在诸多缺点，样本处理时间长、提取过程复杂和样本量多的时候相对成本比较高。
基因组DNA提取的步骤主要分为裂解、DNA与磁珠或者吸附柱结合、清洗和洗脱四个环节，清洗步骤作为核酸纯化过程中非常重要的环节，清洗的效果会直接影响提取的效率与纯度。目前核酸提取过程中最常用的清洗方法多为乙醇清洗，DNA在乙醇中的溶解度较低，经过不同含量的乙醇清洗后，可除去残留的蛋白与盐离子，从而得到高纯度的DNA。在清洗环节中，市场上常见的提取试剂清洗液多为两种，第一种清洗液为高浓度的胍盐与乙醇，用于除去残留的蛋白质和盐类，第二种为75％～85％乙醇溶液，用于除去残留的盐类，对核酸进一步纯化。
市场上常用的基因组DNA提取步骤比较多，都需要吸附柱或者磁珠，提取过程相对比较复杂，全血投入量比较多，急需一种实验操作简单、快速、成本低和提取效率高的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全血基因组DNA快提取试剂盒及其使用方法，旨在解决现有技术中DNA提取操作方法复杂、步骤多和用时长，全血投入量只需20μl，且省去蛋白酶k、吸附柱和磁珠等试剂耗材，很大程度上降低成本和简化实验流程。
本发明中，解决技术问题的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种全血基因组DNA快提取试剂盒。
所述的全血DNA快提取试剂盒，包括独立包装的红细胞裂解液、Solution A和Solution B；
所述红细胞裂解液包括如下组分：浓度为155mM的NH4Cl，浓度为12mM的NaHCO3，和浓度为0.1mM EDTA；
所述Solution A包括如下组分：浓度为0.2M的NaOH；
所述Solution B包括如下组分：浓度为1M pH 7.8的Tris-HCl。
优选的，所述的全血DNA快提取试剂盒中，检测试剂由独立包装的红细胞裂解液、Solution A和Solution B组成；
所述的红细胞裂解液由如下组分组成：155mM NH4Cl，12mM NaHCO3和0.1mM EDTA。
优选的，所述的Solution A为0.2M NaOH。
优选的，所述的Solution B为1M pH 7.8Tris-HCl。
在本发明的第二方面，提供了一种全血基因组DNA快提取试剂盒的使用方法。
所述全血基因组DNA快提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)准备1.5ml EP管，加入20μl全血；
(2)加入1ml红细胞裂解液，颠倒数次离心管混匀，置于离心机中7000转离心30s，移弃上清；
(3)重复步骤(2)一次；
(4)将EP管放置振荡器上振荡数秒；
(5)加200μl Solution A，振荡5秒；
(6)加入40μl Solution B，混匀，即得最终DNA。
在本发明的第三方面，提供了利用第一方面所述全血基因组DNA快提取试剂盒或利用第二方面所述方法提取的DNA进行PCR的方法，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μl，选用EZ#1为Taq酶；
引物如下：
C-F:CATCTGGACTCTTCTTCTCATGCC
C-R:GAGCTCAAACACCCAGCAAGAAG
反应体系和扩增程序如下：
在本发明的第四方面，提供了利用第一方面所述全血基因组DNA快提取试剂盒或利用第二方面所述方法提取的DNA进行荧光定量PCR的方法，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μl，选择EZ#3为Taq酶。
引物如下：
Q-F:GAACTCTTGTGCTCACGCTGCT
Q-R:ACTGCAGAAAGGAAGTGTGCCAA
探针为：Q-QF:5'-FAM-AAGGGACCAACAGGCAGTCTTCGT-3'-MGB
扩增体系和扩增程序如下：
本发明具有如下技术效果：
与现有技术相比，本发明提供的全血基因组DNA快提取试剂盒在室温条件下储存和操作，无需特殊条件，其使用方法简单，组分简单，不需要蛋白酶处理、过柱纯化和测浓度，全血投入量只需要20μl，单个样本的整个提取过程5min左右即可完成，提取后的DNA在使用特定的DNA聚合酶情况下可直接进行PCR扩增和荧光定量PCR。
附图说明
图1为使用EZ#1酶扩增a1,a2,a3和b样本电泳图。
图2为使用Taq HS DNA Polymerase酶扩增a1,a2,a3和b样本电泳图。
图3为使用EZ#3酶扩增a1,a2,a3和b样本荧光曲线图。
图4为使用Taq HS DNA Polymerase酶扩增a1,a2,a3和b样本荧光曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
EZ#1酶和EZ#3酶为江苏伟禾生物科技有限公司市售商品。
实施例1
本实施例的全血DNA快提取试剂盒，检测试剂由独立包装的红细胞裂解液、Solution A和Solution B组成；
红细胞裂解液组分如下：浓度为155mM的NH4Cl，浓度为12mM的NaHCO3，和浓度为0.1mM的EDTA。
Solution A组分为：浓度为0.2M的NaOH。
Solution B组分为：浓度为1M pH 7.8的Tris-HCl。
本实施例的全血基因组DNA快提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)准备三管全血样本和三个1.5ml EP管，每个EP管内加入20μl全血；
(2)加入1ml红细胞裂解液，颠倒数次离心管混匀，置于离心机中7000转离心30s，移弃上清；
(3)重复步骤(2)一次；
(4)将EP管放置振荡器上振荡数秒；
(5)加200μl Solution A，振荡5秒；
(6)加入40μl Solution B，混匀，即最终DNA，标记编号a1，a2，a3。
对比例1
于江苏康为世纪生物科技有限公司购买试剂盒Blood Genomic DNA Mini Kit，按照试剂盒说明书提取DNA，提取后的DNA进行浓度和纯度测定，编号为b。
对比例提供的DNA浓度和纯度测定结果。
| Num | Name | ID | Type | 260nm | 280nm | 230nm | 260/280 | 260/230 | C:ng/μl |
| 1 | User1 | b | DNA-50 | 1.436 | 0.753 | 0.650 | 1.91 | 2.21 | 71.823 |
DNA质量鉴定：
(1)常规PCR:样本a1,a2,a3，b(稀释到30ng/μl进行实验)，酶分别为EZ#1(本公司市售产品)和Taq HS DNA Polymerase(南京诺唯赞，P132-d2)，引物为C-F:CATCTGGACTCTTCTTCTCATGCC
C-R:GAGCTCAAACACCCAGCAAGAAG
反应体系和扩增程序如下：
PCR缓冲液成分如下：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μMdNTP，2mM DTT，3％DMSO，0.02％吐温20。
Taq酶为EZ#1和Taq HS DNAPolymerase。
扩增产物电泳图如图1和图2：图1为使用EZ#1酶扩增a1,a2,a3和b样本电泳图。图2为使用Taq HS DNA Polymerase酶扩增a1,a2,a3和b样本电泳图。
结果分析：使用Taq HS DNA Polymerase酶只能扩出b样本，使用EZ#1扩增a1,a2,a3和b样本都正常，而且与②中b条带亮度差不多。因此在使用EZ#1酶情况下，本发明提供的全血基因组DNA快提取试剂盒提取的DNA质量相当于使用江苏康为世纪Blood Genomic DNAMini Kit提取的DNA(30ng/μl)，但本发明提供的全血基因组DNA快提取试剂盒使用方法简单，组分简单，不需要蛋白酶处理、过柱纯化和测浓度，全血投入量只需要20μl，都优于江苏康为世纪Blood Genomic DNA Mini Kit试剂盒。
(2)荧光定量PCR：样本a1,a2,a3，b，酶分别为EZ#3(本公司市售产品)和Taq HSDNA Polymerase(南京诺唯赞，P132-d2)，
引物为Q-F:GAACTCTTGTGCTCACGCTGCT
Q-R:ACTGCAGAAAGGAAGTGTGCCAA
探针Q-QF:5'-FAM-AAGGGACCAACAGGCAGTCTTCGT-3'-MGB
PCR缓冲液成分如下：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μMdNTP，2mM DTT，3％DMSO，0.02％吐温20。
Taq酶为EZ#3和Taq HS DNA Polymerase。
图3为使用EZ#3酶扩增a1,a2,a3和b样本荧光曲线图。
CT值：b样本做两个重复，CT值分别为22.74和23.19
a1,a2,a3每个样本做两个重复，CT值分别为24.26和24.30，23.54和23.82，23.93和24.03。
图4为使用Taq HS DNA Polymerase酶扩增a1,a2,a3和b样本荧光曲线图。
CT值：b样本做两个重复，CT值分别为22.39和23.09，a1,a2,a3和b样本没有荧光。
结果分析：使用Taq HS DNA Polymerase酶只能扩出b样本，使用EZ#3酶扩a1,a2,a3和b四个样本扩增曲线和CT值都与②中b样本的CT值相近。因此在使用EZ#3酶情况下，本发明提供的全血基因组DNA快提取试剂盒提取的DNA质量相当于使用江苏康为世纪BloodGenomic DNA Mini Kit提取的DNA(30ng/μl)，但本发明提供的全血基因组DNA快提取试剂盒使用方法简单，组分简单，不需要蛋白酶处理、过柱纯化和测浓度，全血投入量只需要20μl，都优于江苏康为世纪Blood Genomic DNA Mini Kit试剂盒。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种全血基因组DNA快提取试剂盒，其特征在于，包括独立包装的红细胞裂解液、Solution A和Solution B；
所述红细胞裂解液包括如下组分：浓度为155mM的NH4Cl，浓度为12mM的NaHCO3，和浓度为0.1mM EDTA；
所述Solution A包括如下组分：浓度为0.2M的NaOH；
所述Solution B包括如下组分：浓度为1M pH 7.8的Tris-HCl。
2.根据权利要求1所述的全血基因组DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的全血DNA快提取试剂盒中，检测试剂由独立包装的红细胞裂解液、Solution A和Solution B组成。
3.根据权利要求2所述的全血基因组DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的红细胞裂解液由如下组分组成：155mM NH4Cl，12mM NaHCO3和0.1mM EDTA。
4.根据权利要求2所述的全血基因组DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的SolutionA为0.2M NaOH。
5.根据权利要求2所述的全血基因组DNA快提取试剂盒，其特征在于，所述的SolutionB为1M pH 7.8Tris-HCl。
6.如权利要求1-5任意一项所述全血基因组DNA快提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备1.5ml EP管，加入20μl全血；
(2)加入1ml红细胞裂解液，颠倒数次离心管混匀，置于离心机中7000转离心30s，移弃上清；
(3)重复步骤(2)一次；
(4)将EP管放置振荡器上振荡数秒；
(5)加200μl Solution A，振荡5秒；
(6)加入40μl Solution B，混匀，即得最终DNA。
7.利用如权利要求1-5任意一项所述全血基因组DNA快提取试剂盒或利用如权利要求6所述方法提取的DNA进行PCR的方法，其特征在于，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μl，选用EZ#1为Taq酶；
引物如下：
C-F:CATCTGGACTCTTCTTCTCATGCC
C-R:GAGCTCAAACACCCAGCAAGAAG
反应体系和扩增程序如下：
8.利用如权利要求1-5任意一项所述全血基因组DNA快提取试剂盒或利用如权利要求6所述方法提取的DNA进行荧光定量PCR的方法，其特征在于，具体如下：
将DNA样本稀释到30ng/μl，选择EZ#3为Taq酶，
引物如下：
Q-F:GAACTCTTGTGCTCACGCTGCT
Q-R:ACTGCAGAAAGGAAGTGTGCCAA
探针为：Q-QF:5'-FAM-AAGGGACCAACAGGCAGTCTTCGT-3'-MGB
扩增体系和扩增程序如下：
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| CN202310122237.6A CN116286792A (zh) | 2023-02-16 | 2023-02-16 | 一种全血基因组dna快提取试剂盒及其使用方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487796A (zh) * | 2023-11-06 | 2024-02-02 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种细胞dna快提取试剂盒及其使用方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN1944673A (zh) * | 2006-06-12 | 2007-04-11 | 山东省医药生物技术研究中心 | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法及专用试剂盒 |
| CN104178424A (zh) * | 2013-05-24 | 2014-12-03 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种红细胞裂解液及其裂解方法 |
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-
2023
- 2023-02-16 CN CN202310122237.6A patent/CN116286792A/zh active Pending
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| CN117487796A (zh) * | 2023-11-06 | 2024-02-02 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种细胞dna快提取试剂盒及其使用方法 |
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