KR101814740B1

KR101814740B1 - 유전자 증폭 방법을 이용한 식중독 유발 세균의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 키트

Info

Publication number: KR101814740B1
Application number: KR1020150161369A
Authority: KR
Inventors: 명현군; 고영준; 이휘호
Original assignee: 솔젠트(주)
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2018-01-05
Also published as: KR20170057929A

Abstract

본 발명은 유전자 증폭 방법을 이용한 식중독 유발 세균의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 시료로부터 핵산을 추출하고, 추출된 미량의 핵산을 WGA (Whole Genome Amplification) 반응을 통해 분자농축을 함으로써, 횟감으로 사용되는 생선에 오염된 미량의 식중독 유발 세균을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 효과를 갖는다.

Description

유전자 증폭 방법을 이용한 식중독 유발 세균의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 키트{Method for Detection of Food Poisoning Bacteria By Using Gene Amplification and Kit for Use in The Same Method}

본 발명은 유전자 증폭 방법을 이용한 식중독 유발 세균의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생선에 오염된 미량의 식중독 유발 세균을 분자농축방법 및 유전자 증폭 방법을 통해 신속 및 정확하게 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.

회와 같은 날것으로 섭취하는 경우가 많은 수산생물은 미량으로 오염된 미생물(박테리아, 바이러스 등)에 의해 식중독과 같은 질병을 유발하는 경우가 많다. 현재 식품공전에 따르면, 날것으로 섭취하는 생선과 같은 경우 식중독균과 같은 미생물을 검출하기 위해 생선 조직에서 채취한 미생물을 선택 배지에서 배양하여, 식중독균으로 추측되는 균을 분리한 후, 이를 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인하는 것이다.

일반적인 면역학적 방법은 높은 정확도로 세균의 검출이 가능하지만, 미량 오염되어 있는 식중독균을 검출하기 위해서는 많은 양의 시료를 필요로 하고, 또한 각 미생물들에 특이적인 항체를 생산하기 위해서는 해당 세균의 정제, 항체 생산 또는 펩타이드 제작이 필수적이며 이에 따른 높은 항체 생산 비용이 요구된다. 여기에 단백질의 특성상 보관과 활용에 어려움이 많고, 한 번에 한 종류 또는 제한된 검출만이 가능한 경우가 많아 사용에 제약이 많으며, 세균의 배양 및 실험 단계에 있어서 긴 시간이 소모된다.

이러한 단점을 개선하기 위하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 방법을 이용한 각종 세균 검출 키트들이 연구 개발되기 시작하였다. 중합효소연쇄반응 방법을 이용한 검출 키트들은 높은 정확성과 간편성, 신속성 때문에 각종 분야에서 날로 그 수요가 증가하고 있다. 특히, 최근 많이 사용되고 있는 실시간(Real-Time) 중합효소연쇄반응(PCR) 방법은 핵산의 증가를 중합효소연쇄반응 주기 마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, 중합효소연쇄반응 증폭 산물과 반응하는 형광 물질의 검출과 정량으로 해석하는 방법이다. 이 방법은 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하며, 결과를 수치화할 수 있고, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 핵산 염색물질에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 인체 유해물질에 덜 노출되는 장점이 있고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 통해 엔트 포인트(end-point) 중합효소연쇄반응 또는 항원/항체 반응과 같은 정성적인 결과가 아닌 높은 특이도를 갖는 정량적인 결과를 확인할 수 있다. 또한 형광 표지 인자로 표지된 프로브를 이용하기 때문에 DNA 칩이나 항원/항체반응에 사용되는 시료의 양 보다 적은 양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다.

그러나, 미량 오염되어 있는 미생물에서 중합효소연쇄반응 방법을 통해 측정을 하기 위해서는 오염된 미생물의 양이 많거나, 검출이 가능할 정도의 균주 수로 증가하기 위한 시간을 필요로 하게 된다. 수산생물의 특성상 시료의 양이 적고 날것을 섭취하는 특성 상 배양을 통한 시간을 보내는 것은 식중독균과 같은 오염균을 검출의 목적에 맞지 않으므로 신속하고 효율적인 추출과 이를 보완할 수 있는 농축방법을 필요로 하며 이를 전체적으로 검출하여 진단할 수 있는 시스템을 필요로 하게 된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-1299627호 대한민국 등록특허 제10-0919261호 대한민국 등록특허 제10-1100932호

본 발명자들은 유전자 진단 방식에 기초하여 생선과 같은 식품에 미량 존재하는 식중독 유발 세균을 검출하는 방법 및 시스템을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생선과 같은 식품에 미량 존재하는 식중독 유발 세균의 핵산을 효과적으로 추출하고 분자농축한 후에 이를 실시간(real-time) 중합효소연쇄반응을 이용하여 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자 증폭 방법을 이용하여 식중독 유발 세균을 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 식중독 유발 세균을 검출하기 위한 용도의 실시간 중합효소연쇄 반응용 키트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유전자 증폭 방법을 이용하여 식중독 유발 세균을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 검출 대상 식중독 유발 세균을 용해시킨 후 상기 검출 대상 세균의 핵산을 자성 비드(magnetic bead)에 결합시키는 단계;

(b) 상기 핵산이 결합된 자성 비드를 세척하여 오염물질을 제거하는 단계;

(c) 상기 핵산이 결합된 자성 비드로부터 핵산을 용출시키는 단계;

(d) 상기 용출된 핵산을 분자 농축하는 단계; 및

(e) 상기 분자 농축된 핵산에 대해 실시간(real-time) 유전자 증폭를 행하는 단계.

이하에서 본 발명의 방법을 각 단계별로 나누어 상세히 설명한다.

단계 (a): 검출 대상 식중독 유발 세균을 용해시킨 후 상기 검출 대상 세균의 핵산을 자성 비드(magnetic bead)에 결합시키는 단계

본 발명의 방법에서 먼저 검출 대상 식중독 유발 세균을 용해시켜 지놈 핵산을 세포로부터 빠져나오도록 유도한다. 본 발명에서 상기 식중독 유발 세균은 예를 들어 비브리오속(Vibrio spp.)세균, 황색포도상구균((Staphylococcus aureus), 살모넬라속(Salmonella spp.)세균, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 검출 대상 시료는 상기 식중독 유발 세균이 감염되었을 것으로 추정되는 시료이며, 예컨대 혈액 또는 생선일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 검출 대상 세균을 용해시키는데 사용하는 용해 완충액(lysis buffer)는 Chaotropic reagent, 계면활성제(detergent), EDTA 및 트리스(Tris)를 포함한다. 상기 Chaotropic reagent는 예를 들어 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate) 또는 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)를 포함한다. 상기 계면활성제(detergent)로는 Triton X-100, zwitterionic detergent, 또는 CHAPS를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 세포가 용해된 용액에 핵산에 결합할 수 있는 자성 비드를 첨가하여, 핵산과 자성 비드와의 결합을 유도한다. 핵산과 자성 비드와 반응시켜 핵산을 자성 비드에 결합시킨 후 핵산이 결합된 자성 비드를 용액으로부터 분리한다. 자성 비드의 분리는 자성 비드에 자기장을 가하여 자성 비드를 고정시킨 후 자성 비드로부터 용액을 제거하여 행할 수 있다.

단계 (b): 상기 핵산이 결합된 자성 비드를 세척하여 오염물질을 제거하는 단계

상기 핵산이 결합된 자성 비드를 용액으로부터 분리한 후 자성 비드에 결합된 오염물질을 세척한다. 상기 오염물질의 세척은 세척 완충액(washing buffer)를 사용하여 행한다. 상기 세척 완충액은 에탄올, 이소프로판올 및 염(salt) 중 하나 이상의 성분을 포함한다.

단계 (c): 상기 핵산이 결합된 자성 비드로부터 핵산을 용출시키는 단계

상기한 바와 같이 핵산이 결합된 자성 비드를 세척 완충액을 사용하여 세척한 후 자성 비드로부터 핵산을 분리하여 용출시킨다. 상기 핵산의 용출은 용출 완충액(elution buffer)을 사용하여 행한다.

단계 (d): 상기 용출된 핵산을 분자 농축하는 단계

상기 용출된 핵산의 분자 농축은 WGA (Whole Genome Amplification) 방법을 통해 진행한다. 본 발명에서 분자 농축을 위해 사용되는 WGA는 PCR 기반 WGA 방법과 MDA (Multiple Displacement Amplification) 방법을 모두 포함하며, 보다 바람직하게는 MDA 기반 방법을 통한 분자 농축을 사용한다. 본 발명의 상기 핵산의 분자 농축을 위한 WGA 방법에서는 거대분자군집(macromolecular crowding) 효과를 나타내는 물질을 첨가하여 WGA를 수행할 수 있다. 상기 거대분자군집(macromolecular crowding) 효과를 나타내는 물질은 예컨대 PEG (polyethylene glycol)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

단계 (e): 상기 분자 농축된 핵산에 대해 실시간(real-time) 유전자 증폭를 행하는 단계

상기 분자 농축된 핵산에 대해 이를 주형으로 하여 실시간 유전자 증폭을 행하여 검출 대상 세균의 존재 여부를 진단한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 비브리오속(Vibrio spp.)세균, 황색포도상구균((Staphylococcus aureus), 살모넬라속(Salmonella spp.)세균, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 검출하는 경우 서열번호 1 - 36에 개시된 프라이머 및 프로브를 사용한 TaqMan 방식의 실시간(real-time) 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 행하여 실시한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 프라이머 - 프로브 세트 중 어느 하나 이상의 세트를 포함하는 식중독 유발 세균인 비브리오속(Vibrio spp.)세균, 황색포도상구균((Staphylococcus aureus), 살모넬라속(Salmonella spp.)세균, 또는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 검출하기 위한 용도의 실시간 중합효소연쇄 반응용 키트를 제공한다:

서열번호 1, 2 및 3으로 이루어지는 제1의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 4, 5 및 6으로 이루어지는 제2의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 7, 8 및 9으로 이루어지는 제3의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 10, 11 및 12으로 이루어지는 제4의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 13, 14 및 15으로 이루어지는 제5의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 16, 17 및 18으로 이루어지는 제6의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 19, 20 및 21으로 이루어지는 제7의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 22, 23 및 24으로 이루어지는 제8의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 25, 26 및 27으로 이루어지는 제9의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 28, 29 및 30으로 이루어지는 제10의 프라이머 - 프로브 세트;

서열번호 31, 32 및 33으로 이루어지는 제11의 프라이머 - 프로브 세트; 및

서열번호 34, 35 및 36으로 이루어지는 제12의 프라이머 - 프로브 세트.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)" 는 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'-말단 서열 또는 3'-말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)" 는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging) 될 수 있다.

본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응에서 프로브는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)에 사용되는 프로브의 5'-말단 및 3'-말단에는 리포터-형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 태깅되어 있을 수 있다.

본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 바람직하게는, DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

한편, 유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 더욱 포함한다.

본 발명의 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명은 유전자 증폭 방식을 이용한 식중독 유발 세균의 검출 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 시료로부터 핵산을 추출하고, 추출된 미량의 핵산을 WGA (Whole Genome Amplification) 반응을 통해 분자농축을 함으로써, 횟감으로 사용되는 생선에 오염된 미량의 식중독 유발 세균을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 효과를 갖는다.

도 1a은 본 발명에 사용되는 핵산 추출 방법의 모식도를 그린 그림이다.
도 1b는 제조사별 자성 입자를 사용하여 핵산을 추출한 결과를 보여준다.
도 2는 용해 (lysis) 완충액의 양에 따른 핵산 추출 양의 차이를 아가로스 젤 (agarose gel) 전기영동 실험을 통해 비교한 그림이다.
도 3은 대조군과 실험군의 핵산 추출 정도를 나노드롭 분광광도계 (nanodrop spectrophotometer) 측정 값을 통해 비교한 표이다. 대조군은 기존의 컬럼 타입(column type)의 핵산 추출 방법이며, 실험군은 자성 비드 타입(magnetic bead type)의 핵산 추출 방법을 사용한 결과이다.
도 4는 도 3에서 측정한 대조군과 실험군의 핵산 추출 정도를 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동 실험을 통해 비교해 놓은 그림이다. 흡광도 값을 통해 나타나는 것과 달리 실험군의 핵산 양이 많은 것으로 나타났으며, 이는 핵산 추출 용액 내 흡광값에 영향을 주는 물질이 대조군에 비해 실험군 내에 상대적으로 적게 오염된 것으로 확인된다.
도 5는 자성 나노입자(magnetic nano-particle)와 결합한 핵산을 용출시키기 위해 용출(elution) 완충액을 넣고 용출에 필요한 시간을 확인한 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동 실험 결과를 보여주는 그림이다.
도 6은 자성 나노입자(magnetic nano-particle)와 결합한 핵산을 용출시키기 위해 용출(elution) 완충액을 넣고 용출에 필요한 시간을 확인한 나노드롭 분광광도계(nano-drop spectrophotometer) 측정값을 나타낸 표이다.
도 7은 추출한 핵산의 품질을 비교하기 위해 다른 제품과 동일한 조건에서 핵산을 추출한 후 나노-드롭 분광광도계(nano-drop spectrophotometer) 측정값을 기준으로 25ng씩을 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동 실험을 하여 비교한 그림이다.
도 8은 도 7에서 사용한 핵산의 품질을 비교하기 위해 멀티플렉스(multiplex) 중합효소연쇄반응 실험방법을 이용하여 비교한 그림이다.
도 9는 핵산의 양이 정량된 인간 지놈 DNA (human genomic DNA)를 대조군으로 사용하여 회사별로 추출한 핵산의 정량 값을 실시간유전자증폭 실험 기법을 이용하여 실험한 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 분자농축에 사용되는 MDA (Multiple Displacement Amplification) 기법을 설명하여 주는 모식도이다.
도 11은 Picogreen 정량분석을 통해 미량의 미생물에서 추출한 핵산의 양을 정량한 결과이다.
도 12는 Crowding reagent를 이용한 WGA 테스트에 대한 결과자료이다. 30분 반응시킨 후 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동 한 결과이다.
도 13은 PEG 유무에 따른 WGA 반응에 주는 영향을 실시간유전자증폭 방법을 통해 측정한 결과이다. 추출한 핵산을 순차 희석하고 PEG 유무에 따른 핵산 증가량을 확인한 결과이다.
도 14는 유해균에서 추출한 핵산을 실시간유전자증폭 진단키트에서 테스트한 결과를 나타낸 그림이다. 1/10의 양으로 순차적 희석을 통해 추출한 핵산을 희석하고 이를 주형으로 하여 실시간유전자증폭을 진행한 결과이다.
도 15는 유해균에서 추출한 핵산을 해당 진단 키트 SET A에 테스트한 결과로, 비브리오(Vibrio) 균과 살모넬라(Salmonella) 균만을 검출하는 것을 보여주는 결과이다.
도 16은 유해균에서 추출한 핵산을 해당 진단 키트 SET B에 테스트한 결과로, 포도상구균(Staphylococcus)과 리스테리아(Listeria) 균만을 검출하는 것을 보여주는 결과이다.
도 17은 분자농축을 통해 증폭시킨 핵산을 통해 미량의 핵산에서 단 시간내에 측정이 가능함을 나타내는 결과이다. 분자농축에 사용된 핵산은 도 15와 16에 사용된 핵산의 1/200 양을 사용하였고, 나타난 결과는 Ct값을 기준으로 유사한 결과를 나타내는 그림이다.
도 18a 및 도 18b는 분자농축의 효율을 비교한 것으로 DNA는 추출한 핵산만을, normal WGA는 기존에 판매하는 WGA 키트를 사용하여 분자농축 한 결과, enhanced WGA는 PEG를 사용하여 분자농축을 진행한 결과중 하나이다. DNA만을 사용한 경우 보다 WGA를 진행한 것이, 일반 WGA결과 보다 PEG을 사용한 enhance WGA의 Ct 값이 더 앞당겨지는 것을 알 수 있으며 효과적으로 분자농축이 가능함을 보여주는 결과이다.
도 19는 식중독균 검출을 위해 개발한 분자진단키트와 분자 농축을 통해 나타난 검출 시간 단축을 보여주는 결과로, DNA는 추출한 핵산만을 사용한 결과를, WGA는 판매하는 WGA를 사용하여 분자농축을 진행한 결과이며, eWGA는 enhanced WGA를 나타내는 결과이다. 반응에 사용된 핵산의 양은 동일하며, 실시간(real-time) PCR에 들어가는 핵산의 양은 일정하고 분자농축에 의해 단시간 내에 검출이 가능함을 보이는 결과이다.
도 20은 UDG 시스템을 반응 시약에 적용하여 이전 반응물(U+T PCR product)가 반응에 영향을 미치지 않게 반응액 내에서 제거되어 더 이상 반응되지 않는 것을 보여주는 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 핵산의 추출에 사용할 자성 비드(Magnetic bead)의 선정 단계

먼저 실험하고자 하는 제조사별 자성 비드(magnetic bead)를 선정하여 아래 표 1에 표시한 각각의 제품 간 성능을 비교하는 실험을 진행하였다. 검출 대상 박테리아를 용해시켜 각 제품별로 결합되는 정도를 측정하였다. 각 제조사별로 측정한 결과를 바탕으로 핵산 추출 시약에 적용할 자성 비드(magnetic bead)를 선별하였다.

실험에 사용하는 용액은 SolGent™ Genomic DNA Prep Kit(Solgent. co. Ltd, SGD61-S120, Korea)에 들어있는 시약을 사용하였으며, 전혈(whole blood) 200 ㎕를 Ependorf 1.5ml 튜브에 넣고 SGB Lysis Buffer(Solgent, Korea) 1 ml을 첨가한 후 inverting mix를 30초간 진행한 후 얼음위에서 10분간 정치하였다. 정치한 후 vortex mixing을 1분간 진행하고, 12,000rpm(revolutions per minute)의 속도로 원심분리기(Eppendorf, 5415D, Germany)에서 5분간 원심분리를 진행하였다. 상층액을 제거한 후 SGD2(Solgent co.Ltd, Korea) 용액 800㎕를 각 각 넣어준 후 vortex mixing을 통해 침전물(pellet)을 현탁하였다. 현탁한 용액 1ml에 각 제조사별로 자성 입자(magnetic bead)를 100㎕씩 첨가한 후 10초 동안 vortex mixing을 통해 혼합한 후, 자성 스탠드(magnetic stand)에서 3분간 정치하여 자성 입자(magnetic bead)와 용액을 서로 분리시켰다. 분리된 용액을 최대한 제거한 후, 70% 에탄올(100% 에탄올 70ml + D.D.W 30ml)을 각 튜브 당 500㎕씩 넣어준 후 vortex mixing하여 현탁하였다. 현탁한 튜브를 자성 스탠드(magnetic stand)에 3분간 정치하여 용액과 자성 입자(magnetic bead)를 서로 분리하였다. 분리된 용액을 최대한 제거하였고, 70% 에탄올을 첨가하여 세척(washing)하는 과정을 1번 더 반복하여(총 2회 진행) 자성 비드(magnetic bead)에 붙은 불순물을 제거하였다. 에탄올을 제거한 튜브를 상온에서 5분간 정치하여 남아있을 수 있는 에탄올을 제거한 후, TE(Tris-EDTA, pH8.0) 버퍼를 50 ㎕씩 넣고 vortex mixing을 5초간 진행하였다. 이후 자성 스탠드(magnetic stand)에 3분간 정치하고 분리된 상층액을 새로운 1.5ml Eppendorf 튜브에 옮긴 후 DNA의 순도와 양을 측정하였다. 도 1b은 제조사별 자성 입자를 사용하여 핵산을 추출한 결과를 보여준다. 아래 표 2는 Nano drop(Thermo scientific, USA)으로 측정한 결과이다.

실시예 2: 세포 용해( lysis )를 위한 완충액(buffer) 제조 단계

2-1: 실험의 개요

세포의 막을 효율적으로 용해시키고, 핵산 분해 효소들을 불활성시키며, 다른 오염원들을 제거하는 기능이 효율적으로 작동하는 조건을 확립하기 위해 용해 완충액(lysis buffer)의 조성을 변경하면서 실험을 진행하였다. 이러한 구성성분 중 Chaotropic reagent는 일반적으로 수소이온의 결합을 깨는 물질을 통칭하고 있으며, 핵산 추출에서 세포 용해(cell lysis) 역할과 세포 내 단백질의 접힘(folding)을 풀어 변성시키는 역할, 그리고 핵산과 실리카(silica)가 잘 결합할 수 있는 가교(bridge)를 형성하는 것으로 알려져 있다. 원핵생물의 경우 세포막 자체만을 용해(lysis)시키는 것으로 충분하기 때문에, 검출대상 식중독균에서 핵산을 추출하기 위한 완충액의 조성을 연구하였다. 세포막이 용해되면 핵산이 핵산분해효소에 노출되게 되어, 이를 보호하는 물질을 필요로 하게 된다. 핵산 분해 효소들은 금속 2가 이온들을 보조인자(co-factor)로 사용하며, 이러한 금속이온들을 킬레이션(chelation)할 수 있는 물질로 그 활성을 억제한다. 대표적인 것이 EDTA(Ethylenediaminetetra-acetic acid)를 사용하고 있으며, 이를 조절하는 실험을 진행하였다. pH의 변화에 따라 핵산에 미치는 영향이 있으므로, 완충(buffering) 작용을 할 수 있는 물질의 최적 농도를 찾기 위한 실험을 진행하였다. 본 발명에서 사용한 완충액 시스템(buffer system)은 트리스(tris)를 기반으로 하며, 완충효과가 좋은 것으로 판단되어 이를 조절하는 실험을 진행하였다. 그 외 계명활성제(detergent)와 같은 추가 첨가물에 대한 실험을 진행하였다.

2-2: Chaotropic reagent

Chaotropic reagent는 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate)와 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)를 기준으로 실험을 진행하였으며, 농도는 0.1M에서 5.0M까지 순차적으로 희석하여 준비하였다. 각각 1 ml의 시약에 전혈 200㎕를 첨가하여 혼합하였다. 혼합한 용액이 담긴 튜브를 얼음에 넣고 10분간 정치하였으며, 정치 후 vortex mixing을 통해 잘 섞어주었다. 이 용액에 자성 비드 100㎕를 넣고 약하게 vortex mixing 해 준 후, 자성 스탠드(magnetic stand)에 튜브를 꽂고 5분간 정치하였다. 용액과 비드가 분리되면 용액을 모두 제거한 후, 80% 에탄올(100% 에탄올 80ml + D.D.W 20ml) 용액으로 2번 세척을 진행하였고, DNA 수화 용액(hydration solution)을 50㎕ 첨가하여 자성 비드(magnetic bead)를 풀어준 후 다시 자성 스탠드(magnetic stand)에 꽂고 용액과 비드(bead)를 분리하여 핵산이 용출된 용액을 회수하였다.

2-3: Detergent, EDTA , 및 Tris

Detergent는 핵산 추출 시약에 주로 사용되는 Triton X-100(LPS, Korea), zwitterionic detergent, CHAPS(Sigma, USA)를 혼합하여 비교 실험을 하였으며, 여기에 EDTA, Tris를 함께 첨가하여 실험을 진행하였다. 실험은 각 시약을 혼합한 형태로 진행하였으며, 이에 사용된 과정은 chaotropic reagent를 실험한 방법과 동일하게 진행하였다.

실시예 3: 용해된 용액에서 지놈 DNA와 비드가 결합하는 조건을 선정하는 단계

자성 비드(Magnetic bead)에 핵산의 결합이 잘 되는지의 여부를 확인하기 위해 박테리아를 용해시킨 후 자성 비드(magnetic bead)를 첨가한 샘플과 첨가하지 않은 샘플을 비교하여, 핵산의 결합정도를 확인하였다. 사용한 비드(bead)는 상기 테스트한 제조사별 제품으로, 실험한 후 결정된 자성 비드(magnetic bead)로 다른 제품에 비해 좋거나 비슷한 성능을 나타난 후보군 비드(bead)로 선정하였다.

Chaotropic reagent는 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate, GTC)를 기준으로 실험을 진행하였으며, GTC 시약 400 ㎕에 전혈 200 ㎕를 각각 넣고, 자성 비드(magnetic bead)를 넣어주었다. 이 때, 자성 비드(magnetic bead)는 50 - 400㎕ 사이의 양으로 넣어주었으며 최적으로 결합할 수 있는 비드(bead)의 양을 결정하고자 하였다. 또한 용해(lysis)된 혈액과 비드(bead)를 섞은 후 정치시간을 5초 - 1분으로 하여 두었으며, 자성 스탠드(magnetic stand)에 튜브를 꽂고 5분간 정치하였다. 용액과 비드(bead)가 분리되면 용액을 모두 제거한 후, 80% 에탄올 용액으로 2번 세척을 진행하였고, DNA 수화 용액(DNA hydration solution)을 50㎕ 첨가하여 자성 비드(magnetic bead)를 풀어준 후 다시 자성 스탠드(magnetic stand)에 꽂고 용액과 비드(bead)를 분리하여 핵산이 용출된 용액을 회수하였다. 각 조건에서 추출된 핵산의 추출양은 아가로스 젤(agarose gel)과 나노-드롭(nano-drop) 측정값을 이용하여 확인하였다.

실시예 4: 표적 DNA와 비드가 결합되어 있는 상태를 유지하면서 다른 오염물들을 제거하기 위한 세척 완충액(washing buffer)의 제조 단계

모든 세포는 다양한 물질을 함유하고 있으며, 핵산 추출을 위해 넣은 비드(bead)에 핵산만이 결합하지 않기 때문에, 대상으로 하는 핵산만을 추출하기 위해 비드에 붙은 다른 물질들을 제거하는 과정이 필요하였다. 일반적으로 세척(washing) 완충액에 사용되는 시약은 70-80％ 에탄올이며, 이소프로판올(isopropanol), 염(salt) 조절을 통해 최적의 세척 완충액의 조건을 확립하고자 하였다. 이를 위해 자성 비드(magnetic bead)를 준비하고 여기에 GTC 400 ㎕에 배양된 균주 200㎕를 넣고 10초간 vortex mixing한 후 상온에서 1분간 정치하였다. 정치 후 자성 스탠드(magnetic stand)에 장착하고 마이크로-튜브(micro-tube)내에 자성 비드(magnetic bead)만을 남긴 후 용액을 완전히 제거하였다. 자성 스탠드(Magnetic stand)에서 마이크로-튜브(micro-tube)를 제거한 후, 30-80% 에탄올, 25-40% 이소프로판올, 0.1M-1.5M NaCl 농도들을 조합한 세척(washing) 완충액을 500㎕씩 넣어준 후 5초간 vortex mixing을 통해 섞어주었다. 이후 자성 스탠드(magnetic stand)에 마이크로-튜브(micro-tube)를 장착하여 비드(bead)외의 나머지 용액을 모두 제거하고, 세척 횟수를 반복하였다. 남은 세척 완충액을 제거한 후, 상온에서 5분간 건조시키고 50-100㎕ 용출(elution) 완충액을 넣고 10초 간 vortexing한 후 자성 스탠드(magnetic stand)에 장착하였다. 이후 분리된 용액을 새로운 마이크로-튜브(micro-tube)에 옮기고 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동과 나노-드롭(nano-drop) 측정값을 통해 비교하였다.

실시예 5 : 비드에서 DNA만을 용출(elution)시키는 단계

핵산을 용출하는데 사용하는 버퍼는 일반적으로 트리스(Tris)를 기반으로 하는 시약들이 대부분이다. 트리스(Tris)는 용출된 핵산의 완충 작용을 할 수 있어 자주 사용되며, 핵산 분해 효소의 활성을 저해할 수 있는 EDTA도 많이 사용된다. 본 발명자들은 일반적으로 핵산 용출에 사용되는 TE 버퍼(Tris-EDTA buffer)를 사용하였다. 비드에서 DNA를 효율적으로 용출시키는 최적의 조건을 확립하기 위해 자성 비드(magnetic bead)를 준비하고 여기에 GTC 400 ㎕에 배양한 균주 200 ㎕를 넣고 10초간 vortex mixing한 후 상온에서 1분간 정치하였다. 정치 후 자성 스탠드(magnetic stand)에 장착하고 마이크로-튜브(micro-tube)내에 자성 비드(magnetic bead)만을 남긴 후 용액을 완전히 제거하였다. 자성 스탠드(Magnetic stand)에서 마이크로-튜브(micro-tube)를 제거한 후, 세척 완충액을 500㎕씩 넣어준 후 5초간 vortex mixing을 통해 섞어주었다. 이 후 자성 스탠드(magnetic stand)에 마이크로-튜브(micro-tube)를 장착하여 비드(bead)외의 나머지 용액을 모두 제거하고, 세척 횟수를 1회 반복하였다. 남은 세척 완충액을 제거한 후, 상온에서 5분간 건조시킨 후 용출(elution) 완충액을 100㎕씩 넣고, 10, 30, 60, 120, 300, 600초 간 정치한 후 자성 스탠드(magnetic stand)에 장착하여 용액과 비드를 분리한 후, 핵산이 용출된 용액을 회수하여 정치 시간에 따른 핵산의 양과 품질을 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동과 나노-드롭(nano-drop) 측정값으로 확인하였다.

실시예 6: 용출된 핵산의 순도 및 오염원의 잔존 여부를 확인하는 단계

상기 실시예 5에서 얻어진 핵산의 순도를 확인하기 위하여 나노-드롭 분광광도계(nano-drop spectrophotometer)를 사용하여 230nm, 260nm 및 280nm의 파장 값을 확인하여 핵산의 양과 순도를 확인하였다. 추출된 핵산이 있는 용액을 2㎕를 마이크로-피펫(micro-pipette)으로 채취하여 측정 위치에 올리고, 측정 버튼을 눌러 측정한 후 값을 분석하였다. 또한 추출한 용액을 2㎕, 5㎕ 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동하여 핵산의 품질과 양을 나노-드롭(nano-drop) 측정값과 비교하여 실제 핵산의 품질을 확인하였다.

실시예 7: 잔존하는 오염원 및 핵산 증폭의 저해제를 제거하는 단계

용출된 핵산 속의 오염원 존재 여부와 핵산 증폭 저해제가 포함되어 있는지를 확인하기 위해 중합효소연쇄반응을 이용하여 그 유무를 확인하였다. 먼저 추출한 핵산을 순차적으로 희석하여 종래(conventional)의 중합효소연쇄반응을 진행하였으며, 증폭된 핵산 유무는 아가로즈 젤(agarose gel) 전기영동 결과를 통해 확인하였다. 정확한 핵산 증폭의 저해 여부를 판단하기 위하여 실시간(real-time) 유전자증폭을 진행하여 핵산 증폭에 미치는 영향을 확인하였다. 자세한 반응시약과 조건은 아래의 표 3(실시간 중합효소연쇄반응 조건과 반응 시간)에 나타내었다.

반응이 끝난 결과물은 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동을 통해 비특이적 밴드(non-specific band)의 유무와 증폭 여부를 확인하였으며, 증폭저해를 나타내는 물질이 발견된 조건이 나타날 경우 이를 해결하기 위하여 용해(lysis) 완충액과 세척 완충액을 조절하였다. 용해(Lysis) 완충액의 경우 GuHCl과 GTC의 농도를 0.1M - 5.0M 사이에서 조절하였고, 계면활성제(detergent) 용액의 농도 0.1 - 5.0％ 사이에서 변경하였으며, 세척 완충액의 경우 에탄올의 %농도를 15 - 70% 사이에서 조절하였고, 염(salt)의 농도를 0.1M - 3.0M 사이에서 조절하여 저해제와 오염물질을 제거를 확실하게 하였다.

실시예 8: 미량 오염된 표준 균주에 대해 핵산을 추출하는 단계

상기 설명된 핵산 추출 방법을 조직에 오염된 미생물의 핵산 추출에 적용하기 위하여, 광어, 우럭과 같은 생선 조직에 표준 균주를 임의 오염시켜서 대상 미생물의 핵산 추출이 상기 설명된 본 발명의 핵산 추출 방법이 적용될 수 있는지를 확인하였다. 오염시킨 균주는 식중독 균주로 알려진 비브리오속 균(Vibrio spp.), 황색포도상구균((Staphylococcus aureus), 살모넬라속 균(Salmonella spp.), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 이다. 해당 균주를 배양 배지에 접종하여 OD595를 0.6까지 배양한 후 이 흡광값에서 나타나는 균의 평균 CFU를 계산하였다. 이를 기준으로 해당 균주 수에서의 핵산 추출을 확인하고, Quant-it PicoGreen DNA ds assay kit(life technology)와 전기영동을 통해 핵산의 양을 정량하고, 이를 실시간유전자증폭 기법을 이용하여 핵산의 품질을 확인하였다.

실시예 9 : 미량 핵산의 검출을 위해 추출한 핵산을 분자농축 하는 단계

핵산의 추출 대상 세균의 개체수가 많은 경우는 추출된 핵산의 양이 많고 다음 실험을 진행하는데 있어 문제가 발생하지 않는다. 그러나 검체 표면에 미량으로 오염되어 있는 세균에서 핵산을 추출하여 중합효소연쇄반응과 같은 과정을 거치기에는 상대적인 핵산양이 부족할 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 추출된 핵산을 분자적으로 농축하는 방법을 사용하였다. 미량 추출한 핵산을 분자농축하기 위해 WGA (Whole genome amplification) 반응을 진행하였다. 배양한 균주를 순차 희석하여 핵산을 추출하고, 추출한 핵산에서 1 ㎕를 1X WGA DB 완충액(buffer) 1㎕와 혼합하고 상온에서 5분간 정치하였다. 5분 후 혼합액에 1X WGA NB 완충액(buffer)를 2㎕ 넣고 섞어준 후, WGA SB 완충액(buffer)을 6㎕ 넣고 잘 섞어주었다. 여기에 9㎕ WGA RB 완충액(buffer)와 1㎕ EM을 넣고 섞어준 후, 스핀 다운(spin down)한 후에 30℃에서 시간을 조절하여 반응하였다. 반응한 시간은 15분, 30분, 45분, 60분, 120분을 진행하였으며, 음성대조군과 양성대조군을 사용하여 반응에 문제가 없는 것을 확인하였다.

실시예 10: 거대분자군집(macromolecular crowding) 효과를 이용한 미량 핵산의 검출을 위한 분자농축 단계

WGA (Whole Genome Amplification) 반응 시간을 단축하기 위해 거대분자군집(macromolecular crowding) 효과를 보일 것으로 기대되는 시약들을 사용하였다. 이러한 시약으로서 PEG(polyethylene glycol)을 사용하여 WGA 반응에 미치는 영향을 확인하였다. 상기 실시예 9에서 설명된 방법에 따라 추출한 핵산 1㎕를 1X WGA DB 완충액(buffer)와 혼합하고 상온에서 5분간 정치하였다. 5분 후 혼합액에 2㎕ 1X WGA RB 완충액(buffer)을 넣고 섞어준 후, 6㎕ WGA SB 완충액(buffer)와 해당 농도의 PEG를 넣고 잘 섞어주었다. 여기에 9㎕ WGA RB 완충액(buffer)와 1㎕ EM을 넣고 섞어준 후, 스핀 다운(spin down)한 후에 30℃에서 시간을 조절하여 반응시켰다. 반응은 15분, 30분, 45분, 60분, 120분의 반응시간에서 진행하였으며, 음성대조군과 양성대조군을 사용하여 반응 결과에 문제가 없는 것을 확인하였다. 증폭에 사용한 반응물은 실시간(real-time) 유전자증폭 반응을 통해 증폭량의 차이를 확인하였고, 거대분자군집(macromolecular crowding) 시약을 넣지 않은 대조군과 넣은 실험군을 비교하여 증폭되는 양의 차이를 확인하였다.

실시예 11 : 미량 핵산을 이용한 분자 진단 키트의 제조

핵산을 추출하고 분자농축한 시료를 통해 해당 오염균의 정보를 진단하기 위한 분자진단을 행하였다. 대상 균은 10종을 타겟으로 하였으며, 비브리오 균주 7종, 살모넬라 균주 1종, 포도상구균 1종, 리스테리아 1종의 총 10종으로, Taqman probe 방식을 이용한 분자진단 방법으로 행하였다. 먼저 각 균주의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 얻고, 이를 바탕으로 각 유전자별 진단이 가능한 유전자 부위의 후보군을 선정하였다. 검출 후보 유전자는 다음의 유전자를 선정하였다: hlyA(α-Hemolysin) 유전자; sdiA(Suppress division inhibitros) 유전자; spa(S. aureus-specific staphylococcal protein A) 유전자; vpm(V. parahaemolyticus metalloprotease) 유전자; tlh(Thermolabile hemolysin) 유전자; tdh(Thermostable direct hemolysin) 유전자; trh(Thermostable driect hemolysin-related hemolysin) 유전자; ctxA(Cholera toxin) 유전자; epsM(Cholera toxin secretion protein) 유전자; ftsZ(Filamenting temperature-sensitive mutant Z) 유전자; rpoB(β-subunit of RNA polymerase) 유전자; ompU(Outer membrane protein) 유전자; invA(Invasion protein A) 유전자; Collagenase 유전자; 16s rDNA 유전자; ATPase 유전자.

선정한 유전자 부위에서 프라이머(primer), 프로브(probe)를 각각 디자인한 후, 민감도 및 교차 반응성 여부에 대한 테스트를 진행하였다. 테스트를 겆쳐 최종 확정한 분자 진단용 올리고뉴클레오타이드 정보는 아래의 표 4에 나타내었다.

각 후보군에서 선정된 프라이머(primer)와 프로브(probe)는 LOD (limit of detection)와 유효성(validation) 등의 실험을 진행하고, 멀티플렉스(multiplex) 중합효소연쇄반응을 위해 반응 시약 구성 및 농도 조절을 진행하였다. 균주 검출을 위한 프로브(probe)는 FAM, CY5, CalRed 형광염료(fluorescence dye)와 BHQ 퀀처염료(quencher dye)를 사용하였으며, 4개의 형광 채널을 가진 BioRad CFX96 실시간유전자증폭 장비를 사용하였다. 이를 위해 SET A와 SET B로 진단키트를 나누었으며, SET A는 비브리오(Vibrio)균과 살모넬라(Salmonella) 균을 검출하고, SET B는 리스테리아(Listeria)와 포도상구균(Staphylococcus) 균을 검출한다. 각 키트에는 내부표준물질(internal control)로 표고버섯(lentinula) 유전자에서 만든 대조군 주형(control template)와 이에 대한 프라이머(primer), 프로브(probe) 세트를 함께 넣어 결과 분석의 정확성을 높이고자 하였다.

실시예 12 : 추출한 핵산과 분자농축에 따른 검출 효과 비교

식중독 유발 원인균의 표준균주에서 상기 핵산 추출 방식으로 추출한 핵산 10 pg을 사용하여 검출키트 SET A와 SET B의 PCR template로 사용하고, 기존에 솔젠트(주)에서 판매중인 WGA kit(SEQ-TempliGenTM WGA kit)를 normal WGA 샘플로 핵산 10 pg을 1시간 반응을 진행하여 PCR template로 사용하였으며, enhanced WGA는 본 발명에서 개발한 WGA 방식을 사용하여 핵산 10pg을 사용하여 1시간 반응을 진행한 후 PCR template를 사용하였다. 추출된 핵산이 각 반응에 들어간 양은 10pg으로 동일하며 분자농축에 의해 각 반응별로 얼마나 검출 시간이 단축되며, 증폭된 형광값과 Ct값 등에 나타나는 영향을 확인하고자 하였다. 결과는 도 18과 도 19에 나타나 있는 것처럼 분자농축에 의해 검출 시간이 단축되며, 특히 enhanced WGA의 경우 검출시간의 단축이 극대화되어 미량 핵산에서의 검출이 더 용이해질 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 13: 오염 방지를 위한 UDG ( Uracil DNA glycosilase ) 시스템의 적용

반복 실험에 의한 교차 오염을 방지하기 위하여 우라실(uracil) DNA를 인지하고 자르는 UDG (Uracil DNA glycosilase) 시스템을 반응 버퍼에 적용하였다. UDG가 PCR 반응에 영향을 주지 않고, 오염된 이전 실험 산물을 효과적으로 제거하는 조건을 찾기 위해 우라실(uracil)이 포함된 dNTP를 사용하여 PCR template를 준비하고, 이를 실제 반응 용액에 인위적으로 섞은 후, 용액 내에서 제거되는 것을 확인하였고, 실제 PCR에 영향을 주지 않는 것을 실시간(real-time) PCR을 통해 확인하고, 아가로스 젤 전기영동을 통해 오염된 PCR 산물은 제거되고 증폭하고자 하는 서열만이 증폭되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Solgent Co., Ltd. <120> Method for Detection of Food Poisoning Bacteria By Using Gene Amplification and Kit for Use in The Same Method <130> PN150548 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 1 gacgacgtcc agctaataac g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 2 cagatgctaa caaagctcaa gc 22 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 3 cagaaactgg tgaagaaaat ccattcatcg gta 33 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 4 tggtggaaac acgccaagg 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 5 actgcattag gagcgccac 19 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 6 accaatgact gttgccactg ttcaaactcg 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 7 cagtgaaggg aaaatgcaag aagaag 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 8 ccaagcgctt gcaactgctc tttag 25 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 9 tttgccgaaa aatctggaag gtcttgtagg t 31 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 10 cgtcgatctt agttgctaca ccg 23 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 11 caaacttccg tacttacatc tcttacaac 29 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 12 atgattgatg ctggcgatgt attgggtaaa gtt 33 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 13 gcgtaatccg aaacgctgg 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 14 cgatcgatcc ggtattaaag c 21 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 15 aatttcaggc agggtcattt acattgggat g 31 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 16 cgacggacat cgacagacg 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 17 cagccttgac ccggaagc 18 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 18 taatttgatg gatctcatta cacttaagtt gg 32 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 19 gtgagtacag cggccgtgtc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 20 cggttcggga ccaaatcgca 20 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 21 aaattgcttc gaatcggttc ggccatcata 30 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 22 cggtaaccaa tgcttccaaa tc 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 23 caaccaaccg caactctccc 20 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 24 agccctccaa ggcaactcga gtacag 26 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 25 cgctacgacc tgtctacgg 19 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 26 agcttcttca tcacttcgac g 21 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 27 tgtttcgtca agagtgcctt gctcttca 28 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 28 ccgagcattt gtgtaagttc ctcttt 26 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 29 cgcgcgcaac tgcattatga tttac 25 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 30 tcgagcgcgt aaagcaatgg aagaatattt aga 33 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 31 gagggaaacc tgccaatcc 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 32 cttggagcat tcccacaacc 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 33 agcttggagg gaagagccgt gga 23 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 34 gttgggttaa gtcccgcaac g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for real time PCR <400> 35 ttatcaccgg cagtctccct g 21 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for real time PCR <400> 36 acccttatcc ttgtttgcca gcgagtaat 29

Claims

다음의 단계를 포함하는 유전자 증폭 방법을 이용하여 식중독 유발 세균을 검출하는 방법:
(a) 검출 대상 식중독 유발 세균을 카오트로픽(chaotropic) 시약, 계면활성제(detergent), EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 용해시킨 후 상기 검출 대상 세균의 핵산을 자성 비드(magnetic bead)에 결합시키는 단계;
(b) 상기 핵산이 결합된 자성 비드를 세척하여 오염물질을 제거하는 단계;
(c) 상기 핵산이 결합된 자성 비드로부터 핵산을 용출시키는 단계;
(d) 상기 용출된 핵산을 거대분자군집(macromolecular crowding) 효과를 나타내는 물질의 존재 하에서 WGA(Whole Genome Amplification) 방법을 통해 분자 농축하는 단계; 및
(e) 상기 분자 농축된 핵산에 대해 실시간(real-time) 유전자 증폭을 행하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 식중독 유발 세균은 비브리오속(Vibrio spp.) 세균, 황색포도상구균((Staphylococcus aureus), 살모넬라속(Salmonella spp.)세균, 또는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 핵산이 결합된 자성 비드의 세척은 에탄올, 이소프로판올 및 염(salt) 중 하나 이상의 성분을 포함하는 세척 완충액(washing buffer)를 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 거대분자군집(macromolecular crowding) 효과를 나타내는 물질은 PEG (polyethylene glycol)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)에서 실시간(real-time) 유전자 증폭은 서열번호 1 - 36에 개시된 프라이머 및 프로브를 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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