CN105441421A - 一种细胞裂解方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞裂解方法，以及基于该裂解方法的细胞裂解物直接进行PCR的方法。本发明的细胞裂解方法包括将待测细胞与特定细胞裂解液按特定的细胞：裂解液的比例进行混合；所得混合物在30℃～70℃孵育5～30min，然后在92-98℃变性8～12min。基于该裂解方法的细胞裂解物可以直接进行PCR，与现有的PCR方法相比，可以绕开DNA提取步骤，省时省力，能够简单、快速、高效处理各种动物细胞以直接进行PCR扩增鉴定；该方法特别适用于转基因动物细胞高通量细胞鉴定。

Description

一种细胞裂解方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，尤其涉及一种细胞裂解方法以及使用该细胞裂解方法获得的细胞裂解物直接进行PCR的方法。

背景技术

在过去数十年中，PCR已成为用于DNA分析的“役用马(workinghorse)”,因为它允许指数扩增核酸。然而，进一步改善用于PCR分析的作业流程仍是挑战，特别是如果分析仅可以对源于较小数目细胞的DNA执行。

此外，在转基因动物细胞的筛选及鉴定过程中，要获得表达量高的细胞株或双敲除的细胞株往往需要对许多细胞克隆进行PCR鉴定，而基因组DNA模板的制备对PCR的扩增必不可少。传统的DNA抽提方法为酚-氯仿抽提法，但该方法耗时耗力，步骤繁琐，而且酚-氯仿对人体有毒，因此该方法用的很少。目前DNA提取主要通过商业化的DNA提取试剂盒。但是商业化试剂盒同样需要经过细胞裂解、DNA乙醇(异丙醇)沉淀和70％乙醇清洗三步把DNA提取出来，耗费时间和精力，且成本较高。如果将细胞直接裂解后以裂解液作为模板进行PCR，不仅节省时间精力，而且成本低廉，十分适合高通量细胞鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可以用于直接进行PCR的细胞裂解方法，以及用该裂解方法的细胞裂解物直接进行PCR的方法；本发明的用细胞裂解物直接进行PCR的方法不但能绕开DNA提取步骤，省时省力，而且其扩增效率高，以较少细胞的裂解物即能进行PCR检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种细胞裂解方法，所述方法包括：

(1)将待测细胞与细胞裂解液按比例进行混合；所述细胞裂解液包括Tris-HCl、EDTA和蛋白酶K；

(2)将步骤(1)所得混合物在30℃～70℃孵育5～30min，然后在92-98℃变性8～12min。

对于上述细胞裂解方法：

步骤(1)中，作为优选，所述细胞裂解液包括≤100mM的Tris-HCl、≤30mM的EDTA和≤300μg/ml的蛋白酶K，其pH为7.6-8.4；

进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μg/ml的蛋白酶K，其pH为7.8-8.2；

更进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μg/ml的蛋白酶K，其pH为8.0。

此外，步骤(1)中，作为优选，待测细胞与细胞裂解液的混合比例为800000-1500000个细胞/ml裂解液，优选为1000000个细胞/ml裂解液。

步骤(2)中，作为优选，所述孵育为在40℃～60℃孵育5～30min，更优选在55℃孵育5min。

步骤(2)中，作为优选，所述变性为在94-96℃变性8～12min，更优选在95℃变性10min。

上述细胞裂解方法中，所述待测细胞为动物细胞；优选地，所述待测细胞为猪、小鼠或人类的各种细胞。

第二方面，本发明提供了一种用细胞裂解物直接进行PCR的方法，该方法为：使用如第一方面所述的细胞裂解方法裂解细胞，将所得细胞裂解物加入反应体系中直接进行PCR。

上述方法中，作为优选，每个PCR反应体系中使用500～60000个细胞的裂解产物，更优选使用4000～30000个细胞的裂解产物，最优选使用20000个细胞的裂解产物。

发明人发现，在用细胞裂解物直接进行PCR的实验中，从500～60000个细胞的裂解物中都能扩增出目的条带，其中从4000～30000个细胞的裂解物中扩增的条带较亮，扩增效率较好。因此，进行PCR检测的优选最低细胞裂解量为4000个细胞，最佳细胞裂解量为20000个。

在一个优选的实施方案中，每20μLPCR反应体系的组成如下：

4μL5×HFbuffer，0.5μLdNTP(各2.5mM)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1μL细胞裂解液，0.2μLphusion酶，用ddH₂O补足至20μL；所述细胞裂解液的配方为：10mMTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0)，200μg/mL蛋白酶K。

优选地，所述PCR反应程序如下：

98℃，30s；(98℃，10s；60℃，20s；72℃，30s～2min；)×30～35个循环；72℃，10min；16℃，2min。

本发明的用细胞裂解物直接进行PCR的方法可扩增出长度达3200bp的DNA。

第三方面，本发明提供了如第一方面所述的细胞裂解方法或如第二方面所述的用细胞裂解物直接进行PCR的方法在转基因动物细胞检测中的应用。

本发明提供的用细胞裂解物直接进行PCR的方法，无需提取动物细胞DNA；与现有的PCR方法相比，本发明的PCR方法绕开DNA提取步骤，省时省力，能够简单、快速、高效处理各种动物细胞直接进行PCR扩增鉴定。使用该方法，仅需一步处理动物细胞样品，然后直接取1μL处理液为模板完成PCR扩增。该方法特别适用于转基因动物细胞高通量细胞鉴定。

附图说明

图1为不同配方裂解液的细胞裂解物的PCR扩增结果；

图2为不同Tris-HCl浓度、蛋白酶K浓度的裂解液的细胞裂解物的PCR检测结果；

图3为不同EDTA浓度的裂解液的细胞裂解物的PCR检测结果；

图4为不同裂解温度的细胞裂解物的PCR检测结果；

图5为不同裂解时间的细胞裂解物的PCR检测结果；

图6为不同裂解细胞量的细胞裂解物的PCR检测结果；

图7为本发明的细胞直接PCR对于不同扩增长度的扩增效果；

图8为以细胞裂解物为模板与以DNA为模板进行的PCR的效果比较；

图9为使用本发明的细胞直接PCR法检测转基因动物细胞；

图10为图9的PCR产物的酶切鉴定基因剪切效率。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所用各引物的序列信息见表1。

表1引物序列信息表

实施例1四种基础细胞裂解液配方(1×)

裂解液1:10mMTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0)，200μg/mL蛋白酶K，5％SDS；

裂解液2：10mMTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0),200μg/mL蛋白酶K，5％SDS，0.1MKCl；

裂解液3：10mMTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0)，200μg/mL蛋白酶K，

裂解液4：10mMTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0),200μg/mL蛋白酶K，0.1MKCl；

0.25％胰酶消化PK15细胞，PBS清洗一次，2000rpm离心5min，去上清，加500μLPBS重悬细胞，用Countstar自动细胞计数仪计数，取30000个PK15细胞，分别放入6个1.5ml离心管中，加PBS补足到18μL，然后分别取上述4种不同的10×细胞裂解液2μL，混匀，阴性对照直接加20μLPBS重悬细胞，55℃温育10min，95℃变性10min，直接取1μL消化液作为模版，以提取的PK15细胞DNA为阳性对照模板，以未经裂解液处理的PK15细胞为阴性对照模板，以ddH2O为空白对照，以GHR2-F/R引物(序列信息见表1)进行PCR扩增，扩增猪GHR基因452bp片段。

PCR反应体系：5×HFbuffer，0.5μLdNTP(各2.5mM)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1μL细胞裂解液(100ngPK15细胞总DNA)，0.2μLphusion酶，用ddH2O补足至20μL。

PCR扩增条件：98℃,30s；(98℃,10s，62℃，20s，72℃，30s)×35cycle；72℃，10min；16℃，2min。

扩增结束后，取5μL扩增产物进行1.5％浓度的琼脂糖凝胶分析。结果发现，细胞裂解液3和4处理组在电泳分析时有明显的条带，而细胞裂解液1和2(含有0.5％SDS)处理组，检测不到PCR产物(如图1)，说明SDS不适宜作为细胞裂解液的成分。细胞裂解液3和4的组分差别是是否含有KCl，而裂解液3和4条带强弱变化不大，因此KCl的有无对PCR的影响可忽略，因此接下来实验的配方用裂解3的组分。

实施例2裂解液3各组分浓度优化

对裂解液3组分Tris-Cl(PH8.0)，EDTA(PH8.0)，蛋白酶K各组分浓度进行优化，

①Tris-Cl(PH8.0)浓度摸索：

EDTA(PH8.0)浓度为10mM，蛋白酶K浓度为200μg/mL，Tris-Cl(PH8.0)缓冲液浓度分别设0、10、20、40、60、80、100mM7个浓度梯度。

②EDTA(PH8.0)浓度摸索：

Tris-Cl(PH8.0)缓冲液浓度为10mM，蛋白酶K浓度为200μg/mL，EDTA(PH8.0)浓度分别设0、2、4、6、8、10、15、20、30mM9个浓度。

③蛋白酶K浓度摸索

Tris-Cl(PH8.0)缓冲液浓度为10mM，EDTA(PH8.0)浓度为10mM，蛋白酶K浓度分别设0、50、100、150、200、250、300μg/mL7个浓度。

PK15细胞的处理方式、PCR反应体系和条件同实施例1。经电泳结果条带强弱分析表明，3组分Tris-Cl(PH8.0)，EDTA(PH8.0)和蛋白酶K的最佳浓度分别为10mM、10mM和100μg/mL(图2、图3)。

实施例3裂解温度和裂解时间条件优化

裂解液各组分浓度：10MmTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0)，100μg/mL蛋白酶K。设置30、35、40、45、50、55、60、65、70℃9个裂解温度及1、5、10、15、20、25、30min9个裂解时间。PK15细胞的处理方式、PCR反应体系和条件同实施例1。经电泳结果分析在30～60℃和1～30min范围内，电泳结果条带强弱无差异(图4、图5)，我们选取55℃的裂解温度和5min的裂解时间。

实施例4裂解细胞量条件优化

设置100、500、1000、2000、4000、6000、8000、10000、20000、30000、60000个细胞量梯度。根据实施例3的条件裂解PK15细胞，PCR反应体系和条件同实施例1。裂解细胞后进行PCR扩增，电泳分析，从500～60000都能扩增出目的条带，其中从4000～30000扩增条带较亮，扩增效率较好。因此，进行PCR检测的最低细胞裂解量为4000个细胞，最佳细胞裂解量为20000个。(图6)。

实施例5PCR扩增长度

设置1000、1500、2400、2700、3200bp扩增长度。根据实施例4的条件裂解PK15细胞，裂解细胞量为20000个细胞，PCR反应体系同实施例1，利用IGF1-F1/R1、IGF1-F2/R1、IGF1-F3/R3、IGF1-F4/R4、IGF1-F5/R4引物(各引物序列见表1)扩增IGF1基因，PCR反应条件为：98℃,30s；(98℃,10s，62℃，20s，72℃，2min)×35cycle；72℃，10min；16℃，2min。电泳分析，以本发明的细胞裂解液为模板，PCR扩增长度可达3200bp(图7)。

实施例6不同物种的细胞裂解后PCR比较

以试剂盒提取猪PK15、小鼠Hepa1-6细胞和人Hela细胞的DNA作为对照，以实施例4条件进行裂解猪PK15细胞、小鼠Hepa1-6细胞和人Hela细胞进行PCR扩增，

猪所用引物为GHR2-F/R，小鼠所用引物为LRG1-F/R，人所用引物为PIK3R1-F1/R1，各引物序列见表1。

PCR扩增条件：98℃,30s；(98℃,10s，62℃，20s，72℃，50s)×35cycle；72℃，10min；16℃，2min。

结果表明，猪PK15、小鼠Hepa1-6细胞和人Hela细胞经过细胞裂解液处理后直接PCR扩增的效果同试剂盒提取的猪PK15、小鼠Hepa1-6细胞和人Hela细胞的DNA为模版扩增的效果一致。(图8)

实施例7细胞直接PCR法在转基因动物细胞检测中的应用

构建特异识别猪生长激素受体(GHR)基因的TALENs表达载体，通过共转染巴马胎猪成纤维细胞系，G418筛选获得抗性克隆细胞株，根据实施例4的条件裂解抗性克隆细胞，PCR结果如图9，PCR产物通过酶切鉴定基因剪切效率如图10。

Claims (10)

1.一种细胞裂解方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将待测细胞与细胞裂解液按比例进行混合；所述细胞裂解液包括Tris-HCl、EDTA和蛋白酶K；

(2)将步骤(1)所得混合物在30℃～70℃孵育5～30min，然后在92-98℃变性8～12min。

2.如权利要求1所述的细胞裂解方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞裂解液包括≤100mM的Tris-HCl、≤30mM的EDTA和≤300μg/ml的蛋白酶K，其pH为7.6-8.4；

优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μg/ml的蛋白酶K，其pH为7.8-8.2；

进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μg/ml的蛋白酶K，其pH为8.0。

3.如权利要求1或2所述的细胞裂解方法，其特征在于，步骤(1)中，待测细胞与细胞裂解液的混合比例为800000-1500000个细胞/ml裂解液，优选为1000000个细胞/ml裂解液。

4.如权利要求1或2所述的细胞裂解方法，其特征在于，步骤(2)中，所述孵育为在40℃～60℃孵育5～30min，优选在55℃孵育5min。

5.如权利要求1或2所述的细胞裂解方法，其特征在于，步骤(2)中，所述变性为在94-96℃变性8～12min，优选在95℃变性10min。

6.如权利要求1或2所述的细胞裂解方法，其特征在于，所述待测细胞为动物细胞；

优选地，所述待测细胞为猪、小鼠或人类的各种细胞。

7.一种用细胞裂解物直接进行PCR的方法，其特征在于，使用如权利要求1-6任一项所述的细胞裂解方法裂解细胞，将所得细胞裂解物加入反应体系中直接进行PCR。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每个PCR反应体系中使用500～60000个细胞的裂解产物，优选使用4000～30000个细胞的裂解产物，更优选使用20000个细胞的裂解产物。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序如下：

98℃，30s；(98℃，10s；60℃，20s；72℃，30s～2min；)×30～35个循环；72℃，10min；16℃，2min。

10.如权利要求1-6任一项所述的细胞裂解方法或如权利要求7-9任一项所述的方法在转基因动物细胞检测中的应用。