CN102344919A - 一种无需提取动物组织dna的直接pcr方法 - Google Patents

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徐海岳
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Abstract

本发明涉及一种无需提取动物组织DNA的直接PCR的方法，该方法通过将动物组织用组织裂解液进行消化，以消化液为模板直接进行PCR扩增。所用组织裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl组成。与目前常用的方法相比，该方法可以同时处理大量动物组织样品，实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作，快速简化操作步骤，节省成本。

Description

一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法
技术领域
本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及利用特定的组织裂解液对动物组织包括耳组织、血液或毛发进行快速消化，然后直接用少量的该消化液作为模板，实现PCR扩增。
背景技术
基因组DNA的制备对完成PCR扩增是必不可少的，在动物遗传育种中，PCR扩增是进行基因多态性分析、微卫星分析、基因克隆和测序等研究工作的基础。目前，经常用于DNA提取的动物组织包括耳组织、血液及毛。通常，动物组织样品DNA的提取采用的是传统的酚-氯仿抽提法，但该方法存在步骤繁琐、耗时、耗试剂及安全性差等缺点。如果用该方法大量提取动物组织样品时，上述的缺点将更加突出。一些在此基础改进的方法已有报道，同时也有很多商业化的DNA提取试剂盒，但这些改进的方法及商业试剂盒存在一个共性：提取过程仍需要组织样品的裂解、DNA的乙醇或异丙醇沉淀和70％乙醇清洗DNA这三步，因此在提取大量动物组织样品的DNA时，也同样表现出耗时及费用高的缺点。此外，有报道用整个果蝇的胚胎、幼虫及成虫直接作为模板进行PCR扩增。但用整个动物组织如耳组织、毛囊直接作为模板进行PCR扩增是行不通的。
发明内容
本发明的目的是提供一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，此方法可以同时处理大量动物组织样品，实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作，快速简化操作步骤，节省成本。
本发明提供一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，其中PCR扩增所用的模板为动物组织经组织裂解液消化后的消化液。
所述PCR反应按如下步骤进行：
将动物组织与组织裂解液混合，37～55℃温育25～30min，优选为55℃温育30min，95℃变性5min，取2μl作模板；
PCR反应体系：终浓度为250μM的dNTP，10mMTris-Cl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，2pM上游引物，2pM下游引物，2μl组织消化液，1U Taq DNA聚合酶，用ddH2O补足至20μl；
PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸20～40s，40个循环，然后72℃延伸7min，最后16℃保温。
所述的动物组织选自耳组织、血液或毛发，所述的毛发带有毛囊。
所述组织裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl组成。
所述Tris-Cl的浓度为10mM～100mM，优选10mM，pH8.0；所述的EDTA浓度为1～4mM，优选为2mM，pH8.0，所述的蛋白酶K的浓度为100ug/ml～200ug/ml，优选为200μg/ml；所述的NaCl的浓度为0～0.8M，优选为0.2M。
本发明提供的无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，和目前存在的方法和试剂盒相比，该方法简单、快速和节约成本。使用该方法，仅需一步处理动物组织样品，然后直接取2μl处理液为模板完成PCR扩增。此外，该方法特别适用于小组织样品如一根动物毛，因为用目前存在的方法和试剂盒，至少需要5～6根动物毛才能完成DNA的提取。该方法从样品处理到PCR扩增都在PCR仪上完成，在动物中可以实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作如基因分型、微卫星分析、亲子鉴定及基因的克隆和测序。
附图说明
图1所示为不同裂解液处理猪耳组织后直接PCR法扩增的产物。图中，1、2、3、4分别表示用裂解液1、裂解液2、裂解液3、裂解液4处理猪耳组织后直接PCR法扩增的产物。5表示没有经任何裂解液处理，直接用耳组织作模板PCR扩增的产物。
图2所示为裂解液中不同EDTA浓度对PCR扩增效率的影响。
图3所示为裂解液中不同EDTA浓度的PCR电泳图。
图4所示为裂解液中不同NaCl浓度对PCR扩增效率的影响。
图5所示为马毛、鸡血、及猪耳组织经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增结果。图中1、3和5表示马毛、鸡血及猪耳组织经优化组织裂解液处理后直接PCR扩增的结果；2、4和6表示用传统酚-氯仿抽提法从马毛、鸡血及猪耳组织提取的DNA为模板PCR扩增的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
配置四种不同的组织裂解液：
裂解液1：10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，200μg/ml蛋白酶K；
裂解液2：10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，200μg/ml蛋白酶K，0.1％SDS；
裂解液3：10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，200μg/ml蛋白酶K，0.01M NaCl；
裂解液4：10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，200μg/ml蛋白酶K，0.1％SDS，0.01M NaCl；
取0.01g的耳组织，放入一个干净的200μl PCR管，充分剪碎，然后分别取上述4种不同的裂解液50μl，先用55℃温育30min，然后再95℃变性5min让蛋白酶K失活，最后直接取2μl 4种不同的消化液作为模板，以未经任何裂解液处理的耳组织为对照，进行PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。
PCR反应体系：终浓度为250μM dNTP，10mMTris-Cl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，2pM上游引物，2pM下游引物，2μl组织消化液，1U Taq DNA聚合酶，用ddH2O补足至20μl。
PCR扩增的上游引物为P1：5’GGGGATTTGGGTTTTGGTTA 3’；下游引物P2：5’CAGACGATCTACGGCAGTCA 3’。PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸40s，40个循环，然后72℃延伸7min，最后16℃保温。
扩增结束后，取5μl扩增产物进行琼脂糖胶分析。结果发现，组织裂解液1和3处理组在电泳分析时有明显的PCR产物(图1中，1和3泳道)，而组织裂解液2和4(含有0.1％SDS)处理组，检测不到PCR产物(图1中，2和4泳道)，泳道5也未扩增出PCR产物。说明耳组织未经任何处理不能直接作为PCR的模板，SDS不适宜作为组织裂解液的成分。
实施例2
裂解液：10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，100μg/ml蛋白酶K，0.01M NaCl
取0.01g的耳组织，放入一个干净的200μl PCR管，充分剪碎，然后取上述的裂解液50μl，先用37℃温育25min，然后再95℃变性5min让蛋白酶K失活，最后直接取2μl消化液作为模板，以未经任何裂解液处理的耳组织为对照，进行PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。PCR反应体系和反应条件同实施例1。
扩增结束后，取5μl扩增产物进行琼脂糖胶分析。结果发现，经裂解液消化的耳组织能扩增出700bp左右的片段，而未经消化耳组织不能扩增出条带。
实施例3
对裂解液1：10mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0，200μg/ml蛋白酶K中的EDTA浓度进行优化，设置1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM 11个不同浓度。耳组织的处理方式和PCR反应体系和条件同实施例1。每个浓度做三个处理，每个处理做三个重复的PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶检测后发现，6mM浓度以后已经检测不到条带(图2)。前3个浓度的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，纯化产物经NanoDrop 2000(NanoDropTechnologies，Wilmington，DE，USA)测定。结果表明，2mM EDTA是最佳浓度(图3)。
实施例4
在优化后的组织裂解液1：10mM Tris-Cl pH8.0，2mM EDTApH8.0，200ug/ml蛋白酶K的基础上，对NaCl的浓度进行了优化。设置0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8M 10个浓度。耳组织的处理方式、PCR反应体系和条件同实施例1。每个浓度做三个处理，每个处理做三个重复的PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。所有PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，纯化产物经NanoDrop2000(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)测定。结果表明，0.2M是组织裂解液中NaCl的最佳浓度(图4)。
实施例5
取一根有明显毛囊的马毛放入一个干净的PCR管，然后取5μl优化的组织裂解液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，2mM EDTA(pH8.0)，0.2MNaCl，200μg/ml蛋白酶K)完全浸没毛囊，再去除毛囊上部大部的毛组织，55℃温育30min，95℃变性5min，然后取2μl该组织裂解液直接作为模板进行PCR扩增，扩增马线粒体上的D-loop区。上游引物P3：5’CTAGCTCCACCATCAAC ACC3’，下游引物P4：5’ATGGCCCTGAAGAAAGAACC3’。
PCR反应体系同实施例1。
PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环，然后72℃延伸7min，最后16℃保温。
结果表明，马毛经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增的效果(图5中第1泳道)同用酚-氯仿抽提法提取马毛的DNA为模板的PCR扩增的效果一致(图5中第2泳道)。
实施例6
取2μl鸡血放入一个干净的200μl PCR管，然后用48μl优化的组织裂解液(10mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0，0.2M NaCl，200μg/ml蛋白酶K)与之充分混匀，55℃温育30min，95℃变性5min，然后取2μl该组织裂解液直接作为模板进行PCR扩增，扩增鸡cyt3A80基因片段。上游引物P5：5′TGCCTGGTTGCTTATGTC 3′，下游引物P6：5′GCTAACTGGGAATTGCTG 3′。
PCR的反应体系同实施例1
PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸20s，40个循环，然后72℃延伸7分钟，最后16℃保温。
结果表明，鸡血经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增的效果(图5中第3泳道)同用酚-氯仿抽提法提取鸡血的DNA为模板的PCR扩增的效果一致(图5中第4泳道)。
实施例7
取0.01g的耳组织，放入一个干净的200μl PCR管，充分剪碎，然后取50μl优化的组织裂解液(10mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0，0.2M NaCl，200μg/ml蛋白酶K)与之混匀，55℃温育30min，95℃变性5min，然后取2μl该组织裂解液直接作为模板进行PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。上游引物P1：5’GGGGATTTGGGTTTTGGTTA 3’，下游引物P2：5’CAGACGATCTACGGCAGTCA 3’。
PCR反应体系同实施例1
PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸40s，40个循环，然后72℃延伸7分钟，最后16℃保温。
结果表明，猪耳组织经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增的效果(图5中第5泳道)同用酚-氯仿抽提法提取猪耳组织DNA为模板的PCR扩增的效果一致(图5中第6泳道)。
序列说明：
SEQ ID NO.1～6分别是引物P1、P2、P3、P4、P5和P6。
Figure ISA00000217351200011
Figure ISA00000217351200021

Claims (10)

1.一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，其特征在于，以动物组织消化液为模板直接进行PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述动物组织消化液按如下步骤获得：将动物组织与组织裂解液混合，37～55℃温育25～30min，95℃变性5min。
3.根据权利要求2所述的PCR方法，其特征在于，所述动物组织消化液按如下步骤获得：动物组织与组织裂解液混合，55℃温育30min，95℃变性5min。
4.根据权利要求1、2或3所述的PCR方法，其特征在于，所述组织裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl组成。
5.根据权利要求4所述的PCR方法，其特征在于，所述Tris-Cl的浓度为10～100mM，pH8.0，所述的EDTA浓度为1～4mM，pH8.0，所述的蛋白酶K的浓度为100～200μg/ml，所述的NaCl的浓度为0～0.8M。
6.根据权利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述的Tris-Cl的浓度为10mM，所述的EDTA浓度为2mM，所述的蛋白酶K的浓度为200μg/ml，所述的NaCl浓度为0.2M。
7.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述的动物组织选自耳组织、血液或毛发。
8.根据权利要求7所述的PCR方法，其特征在于，所述的毛发带有毛囊。
9.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述的PCR的反应体系如下：
终浓度为250μM dNTP，10mMTris-Cl，pH8.3，50mM KCl，1.5mMMgCl2，2pM上游引物，2pM下游引物，2μl组织消化液，1U Taq DNA聚合酶，用ddH2O补足至20μl。
10.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR的反应条件如下：
94℃预变性4min，94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸20～40s，40个循环，然后72℃延伸7min，最后16℃保温。
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