CN102660635A - 一种定性检测hla-b*1502基因亚型的荧光pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及荧光探针；所述PCR分型引物序列如SEQ IDNO：3-4和/或SEQ ID NO：6-7所示。本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间短，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测。

Description

一种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中区分HLA-B基因中的1502基因亚型的荧光聚合酶链式反应(PCR)试剂盒。

背景技术

HLA(human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。HLA是具有高度多态性的同种异体抗原，其化学本质为一类糖蛋白。HLA按其分布和功能分为I类抗原和II类抗原。HLA I类抗原，由HLA-A、B、C位点编码；HLAII类抗原受控于HLA-D区(包含5个亚区)。以上各基因(名称为WHO命名委员会1975年修订)均系多态性位点(复等位)，且共显性。如果把MHC作为一个整体来看待，其多态性则更为突出。保守地估计，至少存在1300个不同的单体型，相应地约有17×107个基因型。这就是除同卵双生子以外几乎无HLA相同者的遗传基础，从而HLA可视作个体的“身份证”。

近年的研究表明，HLA-B的基因多态可能与癫痫患者服用芳香族抗癫痫药物后发生的严重不良反应相关。在众多HLA-B等位基因与SJS/TEN关联性的研究中，HLA-B*1502基因型是关注的热点之一。Locharernkul C等在泰国人群中对10例服用芳香族抗癫痫药物发生严重不良反应和50例健康对照组进行HLA2B等位基因分型发现，HLA-B等位基因HLA-B*1502与芳香族抗癫痫药物所致的严重不良反应相关，此结果与Chung WH、Hung SI、Man CB等在香港、台湾的人群的研究结果一致，而Lonjou C等对高加索人群的研究未能得出上述结论。因此，HLA-B*1502多态与芳香族药物所致严重不良反应是否相关，以及能否作为芳香族抗癫痫药物不良反应易感性标志，成为抗癫痫药物安全用药领域的热点问题。现在社会对于药物不良反应的重视程度越来越高，所以检测1502基因亚型成了卡马西平用药指导也有了一定的趋势。

针对HLA主要是借助血清学、细胞学或分子生物学方法检测个体的HLA抗原特异性或HLA基因型。目前常规采用血清学方法进行HLA-B的分型，但由于高质量的抗血清难于获得及抗血清之间存在较多的交叉反应，导致血清学分型结果错误和空白较多。PCR序列特异寡核苷酸探针(sequence specific oligonucleotide probe，SSOP)是近年发展起来的一种较有希望的HLA-DNA分型方法，但该方法操作较烦琐，而且耗时长，这些缺陷在大批量样品的检测上尤其突出。由于我们主要针对的是单独的1502基因亚型的分型，所以需要找到一个相对准确、快速、简单的方法。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。

荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是：它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯-6-羧基荧光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。

目前市场上还没有利用荧光PCR技术进行HLA-B基因分型的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性高、成本低并且能够作分型检测的定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒，包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及荧光探针；所述PCR分型引物序列如SEQ ID NO：3-4和/或SEQ ID NO：6-7所示。

进一步地，所述荧光探针序列如SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：8所示。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

进一步地，所述阳性对照品为插入有如SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2，所述的核苷酸序列的重组质粒。

进一步地，所述质粒为HLA-B*1502质粒。

进一步地，所述的阳性对照品的浓度为1.0×10⁶-9.0×10⁶拷贝/微升。

进一步地，所述的阳性对照品的浓度为5.0×10¹⁰拷贝/微升。

进一步地，所述阴性对照品为人的基因组DNA。

进一步地，所述荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的一种；标记探针3’端的荧光猝灭基团为TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

本发明的优点及有益效果：

1)本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒定性准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；

2)本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；

3)本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒检测速度快；

4)本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒步骤简单；

5)本发明提供的定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒可同时进行高通量的样本检测。

荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间短，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为临床样本的检测结果分布图；

图2为临床纯合子的扩增曲线；

图3为临床杂合子的扩增曲线；

图4为阴性对照的扩增曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

1.引物和探针的设计与合成

使用Primer Express 2.0，针对HLA-B*1502的2号外显子和3号外显子以及中间的内含子区域，研究表明目前针对HLA-B基因分型主要集中在这个区域(Hughes AL，Nei M.Pattern of nucleotide substitution at MHCclass I loci reveals overdominant selection.Nature，1988，335(6186)：167-170；Hughes AL，Yeager M.Natural selection at major histo-compatibilitycomplex loci of vertebrates.Annu Rev Genet，1998，32：415-435；Gao X，Nelson GW，Karacki P，Martin MP，Phair J，Kaslow R，Goedert JJ，BuchbinderS，Hoots K，Vlahov D，O′Brien SJ，Carrington M.Effect of a single amino acidchange in MHC class I molecules on the rate of progres-sion to AIDS.N EnglJ Med，2001，344(22)：1668-1675；徐筠娉，邓志辉，邹红岩等，中国汉族个体HLA-A、-B基因全长序列的测定及调控区多态性。遗传HEREDITAS(Beijing)，2010年7月，32(7)：685-693)，筛选特异的突变位点，在选择好的突变位点上进行荧光探针的筛选，在设计好荧光探针基础上设计相应的上下游引物。引物与荧光探针均委托专业公司合成，其中引物为PAGE纯化，荧光探针为HPLC纯化，标记探针5’端的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的一种；标记探针3’端的荧光猝灭基团为TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。优选地，荧光探针分别在5’端标记FAM荧光基团和VIC荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。

扩增序列如表1：

表1.特异性荧光探针与引物序列

2.HLA-B*1502质粒阳性模板对照品的制备

本实施例中HLA-B*1502质粒作为阳性模板用于制备阳性对照品。所述HLA-B*1502质粒的核苷酸序列如下：

检测位点一核苷酸插入序列如SEQ ID NO：1所示，检测位点二核苷酸插入序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的质粒具体可以为pMD18*T质粒。

重组质粒构建的具体试验步骤如下：

1)在HLA-B*1502检测位点一和检测位点二基因突变位点周围序列中选取一段如SEQ ID NO：1和2所示序列。

2)进行片段合成(Invitrogen合成)，设计时将突变位点包含在内。

3)将合成好的如SEQ ID NO：1和2所示的片段按以下方式连接到pMD18*T载体上：

合成的目的片段DNA    4.5μl

16℃连接过夜。

4)将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；

自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50μl移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。

细菌   50μl

DNA    5μl

轻轻混匀，静置冰上30分钟。

于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900μl LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。取50μl涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。

5)次日，挑选单克隆菌落，接种，摇菌。

6)进行菌落PCR，送PCR产物进行DNA测序鉴定(Invitrogen测序)。

7)鉴定成功后，摇菌，提取质粒(按照Invitrogen质粒提取试剂盒操作)，

于-20℃保存。

提取的质粒，紫外分光光度计定量，稀释到浓度为5×10¹⁰拷贝/微升。

3.对照品选择

使用正常人基因组DNA为阴性对照；HLA-B*1502重组质粒(浓度为5×10⁶拷贝/微升)为阳性对照。

4.荧光PCR反应液组成

表2.PCR反应液组成

原料名称	终浓度
		PCR Buffer	(0.8-2)×
MgCl2	2-5mM
		dNTP	0.1-0.5mM
HLA-B*1502引物	0.1-0.50μM
		HLA-B*1502探针	0.1-0.50μM
UNG酶	0.05-1U
		Taq酶	0.5-3U
H2O	适量
		DNA模版	2μl
总体积	40μl

由于针对两个检测位点进行扩增，所以每一组引物和探针组成一种荧光PCR反应液，本试剂盒提供两种荧光PCR反应液，同时用于HLA-B*1502的分型。

实施例2：试剂盒的使用

1.样本检测

分别取阳性对照和阴性对照，作为DNA模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、及含有特异性PCR引物和特异性荧光探针的荧光定量反应液中，组成PCR反应体系。在阳性对照品中HLA-B*1502质粒的检测位点一和检测位点二PCR反应体系中分别加入各自对应并且已经稀释混匀好的HLA-B*1502质粒标准品(5.0×10⁶拷贝/微升)，作为样本定性判定的标准。

该体系各主要成分如下：

2.反应程序

设置收集FAM和VIC荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下：

表3.PCR反应程序

3.结果判断

基线范围的Ct值(循环数)为6-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。

4.质控标准

(1)各类对照质控品判断结果如下表：

表4.质控品标准检测结果

5.结果报告：

结果如图1所示，样本结果的判断标准如下：

表4.报告样本检测结果

图2，图3，图4分别显示的是临床检测结果中纯合子，杂合子以及阴性对照的实际扩增图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (9)

1.一种定性检测HLA-B*1502基因亚型的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及荧光探针；所述PCR分型引物序列如SEQ ID NO：3-4和/或SEQ ID NO：6-7所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列如SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：8所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为插入有如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒为HLA-B*1502质粒。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品的浓度为1.0×10⁶-9.0×10⁶拷贝/微升。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品的浓度为5.0×10¹⁰拷贝/微升。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为人的基因组DNA。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的一种；标记探针3’端的荧光猝灭基团为TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

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