CN101454462A - 与药物不良反应相关的hla等位基因及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于一种决定某些特定HLA等位基因(例如HLA－B*1502或HLA－B*5801)存在的方法，及一种可实施本方法的试剂盒。本发明并同时揭露一种评估患者是否具有发生因某个基因标记的存在或缺失(例如HLA－B*1502、HLA－B*5801，或是HLA－B*4601)而导致的药物不良反应(例如史狄芬－琼森征候群、毒性表皮坏死溶解症，或是过度敏感症候群)风险的方法。

Description

与药物不良反应相关的HLA等位基因及其检测方法
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2006年5月11日提交的美国专利申请No.60/800,121的权益，其内容在此被整体结合进来。
【背景技术】
药物不良反应(Adverse Drug Reaction，简称ADR)为一种非预设且不希望发生的药物反应。特别是指药物在剂量上为预防用剂量、诊断用剂量，或是治疗用剂量所造成之非预期与非预定之反应。依据广泛撷用之统合分析，ADR位在最常见死因之第四位与第六位之间(Lazarou etal.，JAMA，279(15)：1200-1205，1998)。2-3％住院患者是因皮肤ADR而住院治疗(Bigby et al.，JAMA，256(24)：3358-3363，1986)，其病征之严重性从轻微斑状丘疹(MPE)，随着严重性的增加，到甚至有致命危险的病征，例如：过度敏感症候群(HSS)、史狄芬-琼森征候群(SJS)及毒性表皮坏死溶解(TEN；李耶氏征候群(Lyell′s syndrome))，而后者的致死率可高达40％。
过度敏感症候群(HSS)除皮肤发疹外，其特征在于另伴随有全身性表征(如：发烧、嗜酸性白血球增多症，以及淋巴腺肿)的多重器官涉入(如：肝炎或肾脏炎)。史狄芬-琼森征候群(SJS)及毒性表皮坏死溶解(TEN)属于免疫复合体介导之过度敏感病变，特征在于迅速发生水疱斑疹、涉及黏膜之特定部位损伤以及脱皮(Roujeau et al.，J Invest Dermatol，102：28S-38S，1994)。大多数的史狄芬-琼森征候群(SJS)及毒性表皮坏死溶解(TEN)病例是由药物引起，例如磺酰胺类、抗痉挛药、别嘌醇(allopurinol)、非类固醇消炎药(NSAID)，及抗疟疾药(Roujeau et al.，N.Engl.J.Med.，333(24)：1600-1607，1995)。在台湾抗痉挛药(如卡马西平(carbamazepine)、苯妥英(phenytoin)与苯巴比妥)及别嘌醇，为最常引起史狄芬-琼森征候群(SJS)及毒性表皮坏死溶解(TEN)之药物。
近来药物遗传学之发展已倾向将ADR之罹患机率与特定遗传等位基因有关。例如，硫嘌呤甲基转化酶(TPMT)的基因多样性，被发现与硫唑嘌呤(azathioprine，系一种类风湿或癌症药物)所导致的药物不良反应有绝大关系(Yates et al.，Ann，Intern.Med.，126(8)：608-614，1997)。此外，研究结果也显示罹患由特定药物引发SJS/TEN/HSS的机率是由遗传决定(Gennis MA，Am.J.Med.，91(6)：631-634，1991；Edwards SG，Postgrad.Med.J.，75(889)：680-681，1999)，但其负责之遗传因子仍有待判别。
这些药物遗传学之研究显示，检测患者体内不良药物相关之等位基因有益于评估患者是否有发生药物不良反应之风险。这种由临床实验改良修正(Clinical Laboratory Improvement Amendments)之分子诊断法现已在美国及欧洲之认证实验室(reference laboratories)获得认可。
为了确定一特定等位基因的存在，需检测一个或多个特定之核苷酸。在许多例子中，需针对等位基因内的多重区域为目标以达到精确的判定。例如：目前已知用来判定一HLA-B等位基因(如：HLA-B*1502或HLA-B*5801)的方法，需检测该等位基因内至少六个区域。
【发明内容】
本发明提供一种评估患者发生药物不良反应之危险性之方法，尤其是SJS、TEN，或过度敏感症候群(Hypersensitivity，HSS)。已发现一HLA-B等位基因，HLA-B*1502，与多种药物(例如卡马西平(carbamazepine，CBZ))所诱发之SJS/TEN有关。此外，另一种HLA-B等位基因，HLA-B*5801也特别与别嘌醇所诱发SJS/TEN有关。HLA-B*5801也与别嘌醇诱发的过敏症状(Hypersensitivity，HSS)有关。由卡马西平(CBZ)所诱发较温和之皮肤反应，如：斑丘疹、多形性红斑(EM)、荨麻疹及固定药物发疹，则特别与HLA-B*4601有关。
因此，本发明提供一种评估患者因药物而发生药物不良反应风险之方法，包括采用来自患者之生物检体进行HLA定型。本发明采用之HLA等位基因可为任一与ADR相关且其灵敏度至少为40％的危险因子。危险因子的灵敏度至少为50％、60％、70％、80％、85％或90％者为佳，95％者则更佳。该药物最好选自以下各群组：卡马西平(Carbamazepine，简称CBZ)、奥卡西平(Oxcarbazepine；商品名：除癫达(Trileptal))、利卡西平(Licarbazepine)、别嘌醇(Allopurinol)、苯妥英(Phenytoin)、柳氮磺胺嘧啶(Sulfasalazine)、安默西林(Amoxicillin)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)与苯酮苯丙酸(Ketoprofen)。相对地，该药物最好不要选择非类固醇消炎药，而该危险因子为一HLA-B等位基因为佳。
评估患者因药物而发生药物不良反应之危险性之方法可由测定选自HLA-B*1502、HLA-B*5801与HLA-B*4601组群中之HLA-B等位基因之存在来达成，其中HLA-B等位基因之存在为药物不良反应危险性之指标。该药物可选自下列群组：卡马西平、奥卡西平、利卡西平、别嘌醇、奥昔嘌醇、莫待芬宁、苯妥英、柳氮磺胺嘧啶、安默西林、异丁苯丙酸与苯酮苯丙酸。
药物不良反应可为一皮肤药物不良反应，如：史狄芬-琼森征候群、毒性表皮坏死溶解，或过度敏感症候群。在一实例中，该药物为卡马西平、奥卡西平，或利卡西平，该等位基因为HLA-B*1502。另一项实例中，使用等位基因HLA-B*5801来预估史狄芬-琼森征候群、毒性表皮坏死溶解，或过度敏感症候群之风险，该药物可选自别嘌醇或奥昔嘌醇。亦可使用HLA-B15、B58或B46之其它亚型(如：HLA-B*1503或HLA-B*1558)来预估发生药物不良反应之风险。
检测等位基因之存在可通过使用由生物检体(如：血液、唾液、尿液，或毛发)制备之基因组DNA来直接测定该基因内之区域或核苷酸。该等位基因亦可利用如血清学或微细胞毒性方法测定，亦可藉由检测等位基因之等效基因标记(equivalent genetic marker)来测定，例如：单一核酸多型性(single nucleotidepolymorphism，SNP)、微卫星标记(microsatellite marker)、或任何种类之基因多样性。换言之，HLA-B*1502、5801或4601单倍体(而非该等位基因本身)之存在即为药物不良反应之指标。HLA-B*1502单倍体之等效基因标记包括：DRB1*1202、Cw*0801、Cw*0806、A*1101及MICA*019。HLA-B*5801单倍体之等效标记包括：HLA-A*3303、Cw*0302、DRB1*0301与MICA*00201。
另一方面，本发明提供一种药物遗传学图谱分析法，本方法包括测定至少一种选自HLA-B*1502、HLA-B*5801与HLA-B*4601组群中之HLA-B等位基因存在。在一实例中，测定至少两种选自以下族群中等位基因之存在，如：HLA-B*1502与HLA-B*5801。在另一实例中，则测定所有三种等位基因存在。该方法可视需要包括测定其它遗传因子。其它遗传因子可能与任何疾病或病症之发生倾向有关，包括药物不良反应。例如，所述其它遗传因子可选自由硫嘌呤甲基转化酶与长-QT征候群之基因所组群组。
本发明亦提供一种方法来测定患者是否带有HLA-B*1502或HLA-B*5801。本方法包括下列步骤：(1)测定选自HLA-B*1502的区域1-6或HLA-B*5801的区域1-6中之一的第一区域；(2)测定选自HLA-B*1502的区域1-6或HLA-B*5801的区域1-6中之一的第二区域，第二区域不同于第一区域；以及(3)判定该患者是否带有选定之基因，上述第一区域与第二区域之存在，表示该患者带有HLA-B*1502或HLA-B*5801。这些区域之测定方式，可为实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)，或序列专一性寡核苷酸竞争杂交试验及经结合之序列专一性寡核苷酸-酶联疫吸附试验(conjugated single strand oligonuceotides enzymelinked immuno-sorbent assay，CSSO-ELISA)。在一实例中，检测选自HLA-B*1502的区域1-6或HLA-B*5801的区域1-6的两个区域即足以判定HLA-B*1502或HLA-B*5801存在或缺失。相对地，HLA-B*1502或HLA-B*5801中之区域也可测定三个或三个以上。
检测HLA-B*1502的区域1、区域2，与区域3可分别通过判别下列位置之核苷酸来完成：区域1中的位置1与3、区域2中的位置1与6、以及区域3中的位置1与3(包括这些位置的正义链及反义链上的核苷酸)。
检测HLA-B*5801的区域1-6可分别通过判别下列位置之核苷酸来完成：区域1中的位置1、2及5，区域2中的位置1、4、6、7、8、15、16及20，区域3中的2、4、5、8及9，区域4中的位置3与5，区域5中的位置1与9，以及区域6中的位置3与10。
本发明亦提供一用来检测等位基因(如：HLA-B*1502或HLA-B*5801)之试剂盒。在一实例中，本试剂盒包含一第一探针与一第二探针，各自针对选自HLA-B*1502的区域1-6或HLA-B*5801的区域1-6的一个区域。此两种探针所针对之区域并不相同。该试剂盒可更进一步包括一针对内部对照组使用之第三探针，也可包括一个以上的额外探针，用以检测HLA-B*1502或HLA-B*5801中一或多个额外区域。
本发明进一步提供一种方法，用以测定一化合物对于一带有HLA等位基因(如HLA-B*1502、HLA-B*5801，或HLA-B*4601)的患者是否为诱发一种药物不良反应(如SJS/TEN、HSS，或较轻微之皮肤药物不良反应)之候选药物，该HLA等位基因与一药物(如卡马西平、别嘌醇，或苯妥英)引发之药物不良反应有关。本方法包括下列步骤：(1)由带有一与药物不良反应有关HLA等位基因之患者体内分离出T细胞；(2)培养增生对于引发该药物不良反应之药物有反应的T细胞；(3)由该患者身上分离出抗原呈递细胞；(4)在抗原呈递细胞存在的状况下，将增生之T细胞与化合物接触；以及(5)检测该化合物是否会活化该增生之T细胞。一活化该T细胞之化合物则为会在带有同样HLA等位基因患者体内引发药物不良反应之候选物。
如果患者发生药物不良反应之可能性高于一般大众，则称该患者属于发生该药物不良反应之“高危险群”。该患者发生该药物不良反应之可能性至少为1.5倍，至少2倍为佳，至少3、4、5、6、7、8或9倍者更佳，最佳者之可能性为至少比一般大众高10倍，并采用已知任何方法(如使用危险因子之发生率分析)来决定该可能性。例如，已知一危险因子在一般大众之普行率为5％，若此危险因子之普行率于患有药物不良反应之患者群中为10％，则带有此因子之患者发生该药物不良反应之可能性是一般大众发生该药物不良反应之可能性的2倍。
一药物不良反应之“危险因子”系为与该药物不良反应有关联之一因子。一危险因子之灵敏度以至少40％为佳，至少50％、60％、70％、80％、85％或90％者更佳，而最佳灵敏度为至少95％。以危险因子用来预测药物不良反应的灵敏度，是以患有该药物不良反应之患者带有该危险因子之百分比来表示。换言之，若每一个SJS患者皆带有等位基因A，该等位基因A用来预测SJS的灵敏度为100％。若40名SJS患者中有20位带有等位基因B，则等位基因B用来预测SJS的灵敏度为50％。
所需等位基因之“等效基因标记”系为与所需等位基因有连锁关系之遗传标记物，亦即该基因标记与所需等位基因系呈现一连锁不平衡(linkagedisequilibrium)状态。
“药物遗传学图谱分析”系指在患者体内决定是否有与疾病或病症(尤其是药物不良反应)相关之遗传因子之存在。在典型的药物遗传学图谱分析中通常会定出一组遗传因子，该组因子可能与该相同疾病、病症或药物反应有关或无关。
本发明中所用的药物化合物指药物或等同于药物的化合物，预期该药物中至少有一个氢原子被下列基团取代，包括卤素、羟基、酰胺基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、芳基、芳氧芳基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、环烷基、取代环烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代芳氧基、取代芳氧基芳基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基或取代杂环基团。这些化学基团的定义如下，它们可以包含0-10、0-6、0-4或0-2个碳原子。
本发明中“烷基”指含有1-10个碳原子或1-6个碳原子的烷基基团。“取代烷基”是指烷基基团上(尤其是含有1-10个碳原子的烷基基团)连有1-5个取代基，这些取代基选自烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰氨基、硫酰氨基、酰氧基、氨基、脒基、烷基脒基、硫代脒基、氨酰基、氨基碳酰基氨基、氨基硫酰基氨基、氨基碳酰氧基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、取代芳氧基芳基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧甲基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍磺基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、杂芳基、取代芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰胺基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NR(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、含有不同取代基的不对称双取代胺(所述不同取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)；也可以是含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基的取代烷基以及被下列基团取代的烷基/取代烷基，所述取代基团包括-SO2-烷基、-SO2-取代烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代环烷基、-SO2-芳基、-SO2-取代芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-取代杂环基或-SO2-NRR，其中R为羟基或烷基。
“烷氧基”指“烷基-O-”基团，包括如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、2-丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1，2-二甲基丁氧基等。“取代烷氧基”指“取代烷基-O-”基团。
“酰基”指下列基团：H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、取代烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、取代芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、取代杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-、取代杂环基-C(O)-，其中烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基的定义在本发明中有说明。
“酰胺基”指-C(O)NRR基团，其中R独立的选自以下基团包括羟基、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基；R也可以连接起来，和氮原子、杂环基和取代杂环基一起形成环状，其中烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基的定义在本发明中有说明。
“酰氧基”指下列基团：烷基-C(O)O-、取代烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、取代烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、取代炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、取代芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、取代环烷基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、取代杂芳基-C(O)O-、杂环基-C(O)O-和取代杂环基-C(O)O-，其中烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基的定义在本发明中有说明。
“烯基”所指烯基基团，优选含有2-10个碳原子，更优选含2-6个碳原子，至少含1个不饱和烯键，优选1-2个不饱和烯键。“取代烯基”指烯基上含有1-5个取代基，所述取代基选自下述基团：烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、氨基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨酰基、氨酰基氨基、氨硫酰基氨基、氨酰氧基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、芳氧基芳基、取代芳氧基芳基、卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰胺基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基、含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)，也可以是含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基的取代烯基以及被下列基团取代的烯基/取代烯基，所述取代基团包括-SO2-烷基、-SO2-取代烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代环烷基、-SO2-芳基、-SO2-取代芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-取代杂环基或-SO2NRR，其中R为羟基或烷基。
“炔基”所指炔基基团，优选含有2-10个碳原子、更优选含有3-6个碳原子；含至少1个不饱和炔键，优选1-2个不饱和炔键。“取代炔基”指炔基上有1-5个取代基，所述取代基选自下列基团：烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、氨基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨酰基、氨酰基氨基、氨硫酰基氨基、氨酰氧基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、芳氧基芳基、取代芳氧基芳基、卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、杂芳基、取代芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰胺基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基、含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)；也可以是含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基的取代炔基以及被下列基团取代的炔基/取代炔基，所述取代基团包括-SO2-烷基、-SO2-取代烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代环烷基、-SO2-芳基、-SO2-取代芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-取代杂环基或-SO2NRR，其中R为羟基或烷基。
“氨酰基”指下列基团：-NRC(O)-烷基、-NRC(O)-取代烷基、-NRC(O)-环烷基、-NRC(O)-取代环烷基、-NRC(O)-烯基、-NRC(O)-取代烯基、-NRC(O)-炔基、-NRC(O)-取代炔基、-NRC(O)-芳基、-NRC(O)-取代芳基、-NRC(O)-杂芳基、-NRC(O)-取代杂芳基、-NRC(O)-杂环基、-NRC(O)-取代杂环基，其中R为羟基或烷基，所述烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基的定义在本发明中有说明。
“氨酰氧基”指下列基团：-NRC(O)O-烷基、-NRC(O)O-取代烷基、-NRC(O)O-烯基、-NRC(O)O-取代烯基、-NRC(O)O-炔基、-NRC(O)O-取代炔基、-NRC(O)O-环烷基、-NRC(O)O-取代环烷基、-NRC(O)O-芳基、-NRC(O)O-取代芳基、-NRC(O)O-杂芳基、-NRC(O)O-取代杂芳基、-NRC(O)O-杂环基和-NRC(O)O-取代杂环基，其中R为羟基或烷基，所述烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基的定义在本发明中有说明。
“氧酰胺基”指下列基团：-OC(O)NRR，-OC(O)NR-烷基、-OC(O)NR-取代烷基、-OC(O)NR-烯基、-OC(O)NR-取代烯基、-OC(O)NR-炔基、-OC(O)NR-取代炔基、-OC(O)NR-环烷基、-OC(O)NR-取代环烷基、-OC(O)NR-芳基、-OC(O)NR-取代芳基、-OC(O)NR-杂芳基、-OC(O)NR-取代杂芳基、-OC(O)NR-杂环基、-OC(O)NR-取代杂环基，其中R为羟基或烷基，每个R都可以和氮原子、杂环基或取代杂环基连接成环状；所述烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基和取代杂环基的定义在本发明中有说明。
“芳基”是指6-14个碳原子组成的不饱和芳香环状基团，可以是单环(如苯基)或多稠环(如萘基或蒽基)。其中稠环可以有芳香性或没有芳香性(如2-苯并唑啉酮、2H-1，4-苯并恶嗪-3(4)-酮-7-烷等)。优选芳基包括苯基和萘基。
“取代芳基”指由1-3个取代基取代的芳基，所述取代基选自下列基团包括羟基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨基、氨酰基、氨酰氧基、氨基碳酰基氨基、氨基硫酰基氨基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、羧基氨基、氰基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、卤代基、硝基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰氨基、-S(O)2-烷基、-S(O)2-取代烷基、-S(O)2-环烷基、-S(O)2-取代环烷基、-S(O)2-烯基、-S(O)2-取代烯基、-S(O)2-芳基、-S(O)2-取代芳基、-S(O)2-杂芳基、-S(O)2-取代杂芳基、-S(O)2-杂环基、-S(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OSO2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基；含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)；含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基和-SO2RR，其中R为羟基或烷基。
“取代芳氧基芳基”指同一个或不同环上的1-3个取代基的芳氧基芳基，所述取代基选自下列基团包括羟基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、烷基、取代烷基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨基、氨酰基、氨碳酰氧基、氨碳酰胺基、氨硫酰氨基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基氨基、氰基、硫醇、硫代烷基、取代硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、卤代基、硝基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰氨基、-S(O)2-烷基、-S(O)2-取代烷基、-S(O)2-环烷基、-S(O)2-取代环烷基、-S(O)2-烯基、-S(O)2-取代烯基、-S(O)2-芳基、-S(O)2-取代芳基、-S(O)2-杂芳基、-S(O)2-取代杂芳基、-S(O)2-杂环基、-S(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OSO2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基；含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)；含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基和-SO2RR，其中R为羟基或烷基。
“环烷基”指含有3-8个碳原子的单环烷基，包括如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。此定义不包括多环烷基，例如adamantanyl。“环烯基”指含有3-8个碳原子的一个或多个不饱和度但没有芳香性的环烯基。
“取代环烷基”和“取代环烯基”所指的环烷基和环烯基优选3-8个碳原子，含有1-5个取代基选自下列基团，包括氧代(＝O)、硫代(＝S)、烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、氨基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨酰基、氨酰基氨基、氨硫酰基氨基、氨酰氧基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、芳氧基芳基、取代芳氧基芳基、卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰胺基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基、含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)，也可以是含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基的取代烯基以及含下列取代基团的取代烯基，此处所述取代基团指-SO2-烷基、-SO2-取代烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代环烷基、-SO2-芳基、-SO2-取代芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-取代杂环基或-SO2NRR，其中R为羟基或烷基。
“环烷氧基”指-O-环烷基。“取代环烷氧基”指-O-取代环烷氧基。
“卤代基”指氟代、氯代、溴代和碘代，优选氯代或溴代。
“杂芳基”指2-10个碳原子和1-4个杂原子组成的具有芳香性的环状基团，所述环中杂原子选自氧、氮、硫。该杂芳基可以是单环(例如吡啶基或呋喃基)或者多稠环(例如氮茚基(indolizinyl)或苯并噻蒽基(benzothienyl))。所述杂芳基优选吡啶基、吡咯基、吲哚基和呋喃基。
“取代杂芳基”指含有1-3个取代基的杂芳基，取代基选自下列基团，包括羟基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨基、氨酰基、氨酰氧基、氨基碳酰基氨基、氨基硫酰基氨基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、羧基氨基、氰基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、卤代基、硝基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰氨基、-S(O)2-烷基、-S(O)2-取代烷基、-S(O)2-环烷基、-S(O)2-取代环烷基、-S(O)2-烯基、-S(O)2-取代烯基、-S(O)2-芳基、-S(O)2-取代芳基、-S(O)2-杂芳基、-S(O)2-取代杂芳基、-S(O)2-杂环基、-S(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OSO2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基；含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)；含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基和-SO2RR，其中R为羟基或烷基。
“杂芳氧基”指-O-杂芳基。“取代杂芳氧基”指-O-取代杂芳基。
“杂环”或“杂环基团”指一个单环或多稠环的饱和或不饱和的基团，包括1-10个碳原子和1-4个杂原子，所述环中杂原子选自氮、硫或氧。在合并的环体系中，可以有一个或多个芳基或杂芳基。
“取代杂环基”指含有1-3个取代基的杂环基，取代基选自下列基团，包括氧代(＝O)、硫代(＝S)、烷氧基、取代烷氧基、酰基、酰胺基、硫酰胺基、酰氧基、氨基、脒基、烷基脒基、硫脒基、氨酰基、氨酰基氨基、氨硫酰基氨基、氨酰氧基、芳基、取代芳基、芳氧基、取代芳氧基、芳氧基芳基、取代芳氧基芳基、卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、羧基烷基、羧基(含取代基)烷基、羧基环烷基、羧基(含取代基)环烷基、羧基芳基、羧基(含取代基)芳基、羧基杂芳基、羧基(含取代基)杂芳基、羧基杂环基、羧基(含取代基)杂环基、环烷基、取代环烷基、胍基、胍基磺基、硫醇、硫代烷基、取代的硫代烷基、硫代芳基、取代硫代芳基、硫代环烷基、取代硫代环烷基、硫代杂芳基、取代硫代杂芳基、硫代杂环基、取代硫代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷氧基、取代环烷氧基、杂芳氧基、取代杂芳氧基、杂环氧基、取代杂环氧基、氧碳酰胺基、氧硫酰胺基、-OS(O)2-烷基、-OS(O)2-取代烷基、-OS(O)2-芳基、-OS(O)2-取代芳基、-OS(O)2-杂芳基、-OS(O)2-取代杂芳基、-OS(O)2-杂环基、-OS(O)2-取代杂环基、-OS(O)2-NRR、-NRS(O)2-烷基、-NRS(O)2-取代烷基、-NRS(O)2-芳基、-NRS(O)2-取代芳基、-NRS(O)2-杂芳基、-NRS(O)2-取代杂芳基、-NRS(O)2-杂环基、-NRS(O)2-取代杂环基、-NRS(O)2-NR-烷基、-NRS(O)2-NR-取代烷基、-NRS(O)2-NR-芳基、-NRS(O)2-NR-取代芳基、-NRS(O)2-NR-杂芳基、-NRS(O)2-NR-取代杂芳基、-NRS(O)2-NR-杂环基、-NRS(O)2-NR-取代杂环基、单或双烷基氨基、单或双(取代烷基)氨基、单或双芳基氨基、单或双(取代芳基)氨基、单或双杂芳基氨基、单或双(取代杂芳基)氨基、单或双杂环基氨基、单或双(取代杂环基)氨基、含有不同取代基的不对称双取代胺(此处不同的取代基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基)，也可以是含有常规保护基(如叔丁氧羰基Boc、苄氧羰基Cbz、甲酰基formyl等)保护的氨基的取代炔基以及含下列取代基团的取代炔基，此处所述取代基团指-SO2-烷基、-SO2-取代烷基、-SO2-烯基、-SO2-取代烯基、-SO2-环烷基、-SO2-取代环烷基、-SO2-芳基、-SO2-取代芳基、-SO2-杂芳基、-SO2-取代杂芳基、-SO2-杂环基、-SO2-取代杂环基或-SO2NRR，其中R为羟基或烷基。
杂环和杂芳基团举例如下，但不限于此，包括氮杂环丁二烯、异吲哚、吲哚、吲哚满、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基嘧啶、1，4-二氮杂萘、1，3-二氮杂萘、1，2-二氮杂萘、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、邻二氮杂菲、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、苯邻二甲酰亚胺、1，2，3，4-四氢异喹啉、4，5，6，7-四氢苯并【b】噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并【b】噻吩、吗啉代、硫吗啉代、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
“杂环氧基”指-O-杂环基。“取代杂环氧基”指-O-取代杂环基。
以下就本发明之数种实施例加以详细说明，其余本发明之特征、对象与优点可由以下叙述、图示与请求项中明显推知。
【具体实施方式】
某些证据显示，几种类似之多重系统药物过敏反应之致病机制涉及药物或其代谢物之主要组织相容性复合体(Major Histocompetibility Complex，MHC)限制呈现，该药物或其代谢物直接与MHC分子或与内生性蛋白结合，并且活化T细胞(Svensson et al.，Pharmacol.Rev.，53(3)：357-379，2000)。已发现在大泡性水痘反应中，如：SJS/TEN，显著出现皮肤浸润之CD8+细胞毒性T细胞(Hari et al.，Clin.Exp.Allergy，31(9)：1398-1408，2001)，而较温和之皮肤药物不良反应(如斑丘疹)之特征则为CD4+辅助T细胞(Pichler et al.，Int.Arch.AllergyImmumol.，113(1-3)：177-180，1997)。
HLA-B*1502、HLA-B*5801、与HLA-B*4601发现分别与CBZ所导致之SJS/TEN、别嘌醇导致之SJS/TEN/HSS、以及CBZ所导致较温和之皮肤药物不良反应(如斑丘疹、多形性红斑(EM)、荨麻疹及固定药物发疹)有关。因此这些HLA-B等位基因系为判定患者对于CBZ、别嘌醇，或与上述化合物具有相似结构之药物是否具有发生药物不良反应之风险(如SJS、TEN、HSS或较温和之皮肤药物不良反应)的有效基因标记。
卡马西平(CBZ)，亦称为癫通(Tegretol)、Tegol、G-32883、Biston、Calepsin、Carbatrol、Epitol、Finlepsin、Sirtal、Stazepine、Telesmin或Timonil，为一种芳香系抗痉挛剂。其它芳香系抗痉挛剂包括苯妥英(Dilantin)与苯巴比妥，其会如同卡马西平引起类似药物不良反应。因此，HLA-B*1502亦可用于评估对此等其它芳香系抗痉挛药出现药物不良反应之危险性。可使用HLA-B*1502作为危险因子之芳香系抗痉挛药亦包括卡马西平、苯妥英或苯巴比妥之化合物或代谢物。这些药物之代谢物系为相关领域技术人员所能明了(参见例如：Gennis et al.，1991；Leeder，Epilespia，39Suppl.7：S8-16，1998；Naisbitt et al.，Mol.Pharmacol.，63(3)：732-741，2003)，如：卡马西平-10，11环氧化物、卡马西平-10，11-二醇、卡马西平-2，3-二醇、二氢卡马西平、卡马西平儿茶酚与卡马西平邻醌、对羟基苯妥英、苯妥英二氢二醇、苯妥英儿茶酚、苯妥英甲基儿茶酚与苯妥英邻醌。
别嘌醇(allopurinol)系为一治疗高尿酸血症与慢性痛风之药物。
本发明提供一种方法，该方法通过检测患者体内是否具有某些特定之HLA等位基因或其同等基因标记，来判定该患者是否具有发生药物不良反应尤其是SJS，TEN或HSS之风险。
在一实例中，患者体内具有HLA-B*1502，表示该患者具有由CBZ、与CBZ结构类似之化合物、或其代谢物所导致SJS/TEN之风险。表一所示之化合物为可导致带有HLA-B*1502患者发生SJS/TEN之实例。
表一：与带有HLA-B*1502患者发生SJS/TEN相关之化合物
Figure A200780017021D00211
在另一项实例中，一患者体内具有HLA-B*5801，表示该患者具有由别嘌醇、与别嘌醇结构类似之化合物、或其代谢物所导致SJS/TEN或HSS之风险。表二所示之化合物为可导致带有HLA-B*5801患者发生SJS/TEN或HSS之实例。
表二：与带有HLA-B*5801患者发生SJS相关之化合物
Figure A200780017021D00221
另一项实例中，患者体内具有HLA-B*4601表示该患者具有由CBZ所导致较温和之皮肤药物不良反应风险，例如：斑丘疹。
其它HLA-B等位基因也可用于皮肤药物不良反应之预测，例如，僵直性脊椎炎与HLA-B27等位基因(如B*2701至B*2703)就有强烈关联性(Khan，Curr.Opin.Rheumatol.，12(4)：235-238，2000；Feltkamp et al.，Curr.Opin.Rheumatol.，13(4)：285-290，2001)。
直接检测基因标记(如HLA等位基因)或是其内部之特殊区域可用来判定该基因标记是否存在。从患者体内抽取制备其基因组DNA来测定等位基因之存在已属公知，例如：美国明尼苏达州的Gentra Systems公司所出产之PUREGENE DNA纯化系统。其系用以测定指定基因标记内的一段区域包括检验在正义链与反义链上的核苷酸，测定特定区域的方法为众所周知的习知技艺，例如序列专一性寡核苷酸杂交试验、实时聚合酶链反应，或是经结合之序列专一性寡核苷酸-酶联免疫吸附试验(M.Hiratsuka et al.，J.of Biochemical andBiophysic，Methods，67：87-94，2006)。
HLA-B*1502的存在可通过检测至少区域1-6(如图1所示)中的2个区域来判定，而这些区域的存在可通过检测区域内某些位置的核苷酸来判定，例如：区域1中的位置1与3、区域2中的位置1与6、以及区域3中的位置1与3。区域1-6中只要任2个区域有存在，即代表该患者带有HLA-B*1502。
HLA-B*5801的存在可通过检测至少区域1-6(如图2所示)中的2个区域来判定，而这些区域的存在可通过检测区域内某些位置的核苷酸来判定，例如：区域1中的位置1、2、5，区域2中的位置1、4、6、7、8、15、16及20，区域3中的2、4、5、8及9，区域4中的位置3与5，区域5中的位置1与9，以及区域6中的位置3与10。区域1-6中只要任2个区域存在，即代表该患者带有HLA-B*5801。
由聚合酶链反应取得之DNA产物可用序列专一性探针来检测，如：TaqMan、Beacon、Scorpions的水解性探针或是杂交探针。这些探针被设计成可与指定区域键合，例如：HLA-B*1502的区域1-6或是HLA-B*5801的区域1-6。该聚合酶链反应产物可通过DNA结合剂(如 Green)来检测。
等位基因之存在也可通过检测该等位基因之等效基因标记来判定。由于接近所需HLA等位基因之基因标记与该等位基因易于共同分离或呈现连锁不平衡状态，因此此等标记(等效基因标记)为所需等位基因是否存在之指标，进而可代表患者是否具有发生不良药物之风险。HLA-B*1502之等效基因标记举例包括：DRB1*1202、Cw*0801、Cw*0806、A*1101与MICA*019。HLA-B*5801之等效基因标记举例包括：A*3303、Cw*0302、DRB1*0301与MICA*00201。
等效基因标记可为任何型式，包括：HLA等位基因、微卫星标记与单一核酸多型性(SNP)标记。来自所需基因之适用基因标记的大小为200kb或以下(100kb、80kb、60kb、40kb，或20kb或以下)。等效基因标记可采用上述之方法或已知相关方法检测。
反之，或者此外，所需等位基因之RNA序列、cDNA序列、或是蛋白质产物均可用于测定该等位基因存在或缺失，例如：可采用血清定型法或显微细胞毒性法来测定该HLA等位基因之蛋白质产物。
为进一步提高风险预估之准确性，且可同时检测所需之等位基因与/或其等效基因标记及涉及抗原呈递细胞与T细胞之间交互作用之附属分子与共同刺激分子之基因标记。此等效基因标记包括微卫星标记，与单一核酸多型性(SNP)标记。该附属及共同刺激分子包括细胞表面分子(例如：CD80、CD86、CD28、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)、ICAM-1、CD11a、CD58、CD2等)，及发炎或促炎细胞因子、趋化因子(例如：TNF-α)与媒介物(例如：补体、细胞凋亡蛋白、酶、细胞外间质组成物等)。此外，涉及药物之生物活化作用及去毒作用之药物代谢性酶之基因标记亦为所需之物。此等基因标记亦包括微卫星标记与SNP标记物，而药物代谢性酶则包括I期酶(例如：细胞色素P450超级家族等)，与II期酶(例如：微粒体环氧化物水解酶、芳基胺N-乙酰基转化酶、UDP-葡萄糖醛酸糖苷基转化酶等)。
本发明进一步提供一种药物遗传学图谱分析法。针对特定个体决定一组遗传因子，而各遗传因子则与预测疾病或病症(包括药物不良反应)相关。本方法中，该组遗传因子包括至少一种选自HLA-B*1502、5801与4601所组成的组群之等位基因，亦包括选自该群中至少2种或所有3种之等位基因。除了HLA-B*1502、5801与/或4601以外，该组中可包括任何其它已知遗传因子，如：硫嘌呤甲基转化酶与长-QT征候群之基因，亦可包括上述附属分子、共同刺激分子，与/或药物代谢性酶之基因标记。
本发明另一方面也提供一种试剂盒，包括如检测HLA-B*1502、5801与4601所组群群之基因标记探针。此处所述之“探针”系指任何可用于探测其它物质之物。因此，探针可为会与所需基因中特定区域进行专一性杂交键合之寡核苷酸片段或复合寡核苷酸片段。该复合寡核苷酸片段系指一与发色基团或含有配体之分子(如抗原)形成共价键合之寡核苷酸片段，其针对一受体分子具有专一性之高亲和力(如抗体对抗原之专一性)。该探针亦可为一聚合酶链反应引物，与另一条引物用来共同扩增该所需基因内部的特定区域。更进一步地说，该探针可为一抗体，该抗体识别一所需基因或该基因之蛋白产物。该试剂盒可选择性地包含一探针，该探针系针对一用于内部对照之等位基因，其可为任何一普遍存在之等位基因(例如甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白、杀伤细胞免疫球蛋白类似受体(Killer cell Ig-like receptor，KIR)。检测内部对照用的等位基因之设计系为了确认该试剂盒之效能。
该试剂盒可更进一步包括其它工具与/或试剂，用以收集患者生物检体，以及制备该检体之基因组DNA、cDNA、RNA或蛋白质。例如，该试剂盒可包含用来扩增基因组DNA中特定区域之聚合酶链反应之引物，亦可包括适用于药物药物遗传学图谱分析法之探针，例如硫嘌呤甲基转化酶。
在一实例中，该试剂盒包含有一第一探针与一第二探针，各自针对选自HLA-B*1502的区域1-6或HLA-B*5801的区域1-6的一个区域。该第一探针与一第二探针所针对之区域并不相同，此两个探针可为一对聚合酶链反应引物，或是适用于杂交试验之标记寡核苷酸。该试剂盒可选择性地包括一第三探针，用以针对内部对照组，也可包括一个以上的额外探针，用以检测HLA-B*1502或HLA-B*5801的额外区域。
再一方面，本发明还提供一种方法，用以测定一化合物是否会对于带有HLA等位基因(如HLA-B*1502、HLA-B*5801，或HLA-B*4601)的患者诱发一种药物不良反应(如SJS/TEN、或HSS)。研究结果显示该药物可能被某些HLA复合体呈现以活化T淋巴细胞，而后引发药物不良反应。对于这些药物有反应的T细胞显示该T细胞涉及由该药物诱发之药物不良反应。因此，活化该T细胞之化合物会成为带有一个以上与药物不良反应相关的HLA等位基因患者引发药物不良反应之候选物。所以，该方法可以在新药开发中作为一种筛选方法以便寻找能诱发这些药物不良反应的化合物。
用于药物不良反应患者之基因组定型分析，可判定该患者是否带有与该疾病相关之HLA等位基因。该患者体内可分离出T淋巴球与抗原呈递细胞(例如B细胞或单核细胞)，并且经过体外培养，分离技术与培养方法均依照习知技艺实施(Naisbitt DJ.，Mol Pharmacol.2003 Mar；63(3)：732-741；Wu st al.，JAllergyClin Immunol.2006 Jul；118(1)：233-241.E-published on 2006 Apr 27)。依此法分离出之B细胞可被鼻咽癌病毒(Epstein-Bar virus)感染导致转型，以制成B细胞株，在该药物与自体抗原呈递细胞同时存在的状态下，培养增殖对有药物反应之T细胞。增殖后的T细胞可在自体抗原呈递细胞存在的状态下加入一待测化合物，视该化合物是否会活化该T细胞。若然，则该待测化合物即会成为在带有该相同HLA等位基因的患者其诱发药物不良反应之候选物。
以上之叙述相信已适当地将本发明在不需更进一步演绎的情况下加以说明，而使习知此领域之一般人皆能藉此实施本发明。因此，以下之实例仅为本发明提供说明，且无意以任何方式限制本发明之范围。所有公开文献皆已以引用之方式完整地并入本发明各参考文献之中。
实例一：使用实时聚合酶链反应检测HLA-B*1502及HLA-B*5801
由病人血液或唾液中抽取基因组DNA，并合成三组聚合酶链反应引物，该引物分别以HLA-B*1502的区域1和5、区域1和4、区域1，3及4(参阅图一)为目标，此外，合成一组引物，该引物以HLA-B5801的区域2和4(参阅图二)为目标。使用 Green实时聚合酶链反应系统(美商应用生命系统，AppliedBiosystem)来扩增并检测上述之目标区域。简言之，将引物、基因组DNA、及Power  Green PCR master mixture(包含于该PCR试剂盒中)，并依照下列步骤操作：(i)在95℃下加热10分钟，活化聚合酶；(ii)在95℃下加热15秒进行变性后，使其处于71℃下1分钟进行DNA片段的退火及延伸；(iii)进行40次「变性/退火/延伸」的循环，以及(iv)在95℃下加热15秒后置于60℃ 1分钟，将扩增后之产物自其模板分离下来。针对杀伤细胞免疫球蛋白类似受体(KIR)进行PCR扩增以作为内部对照组。测定患者体内之HLA-B*1502或HLA-B*5801存在或缺失系取决于HLA-B*1502/HLA-B*5801与KIR两者间Ct值之差(ΔCt值)，该Ct值(阀循环)藉由该报道染料发光强度高于背景噪声之循环数来决定，该阀循环数系由该反应之最大指数期来决定，且比传统PCR方法测量终点之累积PCR产物来得更加可靠。该阀循环数与其模板基因的复制数量有反比例关系，模版复制数量越大，测量到的阀循环数则越低。
由人类B细胞株中抽取的170个基因组DNA检体，以及从人类血液或唾液中制备的35个基因组DNA检体，依照上述之方法进行测试，以检测HLA-B*1502之存在。HLA-B*1502与KIR的Ct值范围分别为23-27及19-25，当HLA-B*1502与KIR之ΔCt值小于7，则该HLA-B*1502被认定为存在。在此等170个超级对照组中，15个gDNA发现HLA-B*1502存在，且经由Dynal SSO试剂盒测试确认，且该结果显示本方法之灵敏度及专一性皆超过99％。
由人类B细胞株中抽取的170个基因组DNA检体，以及从人类血液或唾液中制备的35个基因组DNA检体，依照上述之方法进行测试，用以检测HLA-B*5801存在。HLA-B*5801与KIR的Ct值范围分别为22-28及10-26，当HLA-B*5801与KIR之ΔCt值小于7，则该HLA-B*1502被认定为存在。由不带有HLA-B*5801之患者体内取出之DNA检体，其HLA-B*5801之Ct值约为34，且其ΔCt值大于13。所有检体中，51个g DNA发现HLA-B*5801存在，经由DynalSSO试剂盒测试确认，结果显示本方法之灵敏度及专一性皆超过99％。
实例二：使用经结合之序列专一性寡核苷酸-酶联免疫吸附试验(CSSO-ELISA)检测HLA-B*1502及HLA-B*5801
实施经结合之序列专一性寡核苷酸-酶联免疫吸附试验之步骤，如图3所示。
一般来说，使用基因组DNA作为模板，进行聚合酶链反应来生成如图1或图2所示之该专一区域的DNA产物。正向引物(forward primer)或是反向引物(reverse primer)均以配体I(Ligand I，LI)标示，且辨识方式系藉由一连结有酶(如HRP)的分子I(Molecule I，MI)。该PCR反应经由设计实施而产生包含一个以上的专一区域(即HLA-B*1502的区域1-6或是HLA-B*5801的区域1-6)。设计出有专一性的寡核苷酸竞争序列，CSSO1与CSSO2，其中CSSO1对于HLA-B*1502的区域1-6或是HLA-B*5801的区域1-6的辨识上有专一性，而CSSO2则是设计成辨识HLA-B*15的一般型(即非B*1502等位基因，或是非B*5801等位基因)。该CSSO1则以配体2(Ligand 2)标示，之后被涂布于一反应盘(reaction plateorstrip)上的分子II(Molecule II)所辨识结合。由此得到的PCR产物与反应盘上的两种CSSO进行杂交。在洗掉未结合分子后，将该酶的底物加入该反应盘中。该酶有反应(有颜色出现为有反应的讯号)即代表HLA-B*1502或HLA-B*5801的存在。
实例三：CBZ所导致之SJS/TEN与HLA-B*1502之相关性
本研究中纳入238位ADR患者(蒙古人种或其后裔)，患者来自长庚纪念医院(Chang Gung Memorial Hospital)或全台湾其它医学中心，记录患者服用药物之历史(包括剂量与服药期)及ADR之表现型。诊断标准系依据Roujeau(RoujeauJC，Invest Dermatol 102(6)：28S-30S，1994)所定义之临床形态。例如，SJS之定义为脱皮程度低于体表面积之10％，重迭之SJS-TEN之定义为脱皮10-30％，而TEN则为30％以上。SJS、重迭之SJS-TEN与TEN统称为SJS/TEN。
每名患者均停止服用有嫌疑之药物，并观察患者症状。发生皮肤药物不良反应之患者，若停止服用药物后ADR症状仍未缓解，即不纳入本研究范围中。
根据上述之标准，对不同药物，有112位患者被诊断出患有SJS/TEN，另外126位患者出现较温和之过度敏感反应。在该112位SJS/TEN患者中，有42位患者接触过卡马西平(癫通)、17位服用过别嘌醇，及53位接受过除了卡马西平或别嘌醇以外其它药物的治疗。
本研究中纳入73位可耐受癫通之患者作为对照组，亦纳入来自台湾一般人民之自愿者(n＝94；年龄范围：20至80岁)。本试验系由人体试验评议委员会(institutional review board)核准，且已取得同意书。
所有患者均进行基因组定型分析。简言之，使用序列专一性寡核苷酸(SSO)片段进行“逆向直线墨点分析法”之试剂系购自DYNAL生物技术有限公司(Bromborough，UK)。采用连结有生物素之引物对以产生连结有生物素之PCR产物，该引物对的序列为针对I类或II类HLA基因位点中第二与第三外显子序列，然后将上述连结有生物素之PCR产物与固定在一尼龙膜上之SSO探针直线墨点进行杂交。使用streptavidine-HRP及一发色性可溶性底物，判定该连结有生物素之PCR产物是否存在，当连结有生物素之PCR产物连结至其对应之专一探针时，会于阳性探针之位置产生一条蓝色“直线”。探针反应样式则利用基因组定型分析软件Dynal RELITMSSO(DYNAL生物技术有限公司；Bromborough，UK)来解读。模棱两可者则再进一步采用以序列为主之定型分析及DNA定序来解析，实施方法则依据IHWG技术手册(International Histocompatibility WorkingGroup)。参见人类主要组织相容性复合体DNA分型的基因组分析法研究HLA等位基因和相关多态性。Marcel G.J.Tilanus，Editor in Chief，ISBNNo.0-945278-02-0。
另采用高效率MALDI-TOF质谱分析仪针对某些患者则进行单一核苷酸多形性(SNP)基因组定型分析。简言之，引物及探针之设计系采用SpetroDESIGNER软件(Sequeom，San Diego，CA，USA)。进行重复聚合酶链反应(Multiplex PCR)后，使用虾子碱性磷酸酶(shrimpalk alinephosphatase)(Hoffman-LaRoche，Basel，Switzerland)将未嵌入之dNTPs进行去磷酸化，接着进行引物延伸(primer extension)。将纯化过后的引物延伸反应产物，点在一384孔之硅芯片上(SpectroCHIP，Sequenom)，使用Bruker Biflex IIIMOLDI-TOF SpectroREADER质谱分析仪(Sequenom)进行分析，其结果图谱系经由SpectroTYPER(Sequenom)处理。
不同组之等位基因出现频率在制成2 x 2表格后进行叶慈校正(Yatescorrection)，采用开方检定法(Chi-square method)比较其差异。由原始P值乘以在该基因位点中所观察到的HLA等位基因数，以校正P值，以此用来比较多重HLA等位基因(Pc)。风险对比值(odds ratio)，或称胜算比，系采用Haldane′s改良法计算，不论何种细胞，该值再加0.5，以配合可能出现数值为零的状况。
如表1所示，一位于HLA-B基因位点中的DNA变体等位基因(HLA-B*1502)与罹患药物所诱发SJS/TEN之患者有关，特别是接受卡马西平(癫通)之患者。
表1：42位患有卡马西平(癫通)诱发之史狄芬-琼森征候群/毒性表皮坏死溶解症的台湾患者体内之HLA-B*1502出现频率
Figure A200780017021D00291
a，出现SJS以外之较温和药物不良反应之患者
b，台湾一般民众
c，具有卡马西平耐受性之患者
X2，经过叶慈校正之开方检定后之P值
Pc，原始P值乘以所观察到之HLA-B等位基因数(35)之计算值。
42位接受卡马西平之SJS/TEN患者中有42位带有HLA-B*1502(100％)。53位接受其它药物之SJS/TEN患者中，有17位(32％)患者(苯妥英8位，别嘌醇2位，安默西林2位，柳氮磺胺嘧啶1位，苯酮苯丙酸1位，异丁苯丙酸1位，以及未知药物2位)亦带有该等位基因。特别一提，17位在接受苯妥英后发生SJS/TEN之患者中有8位(47.05％)亦带有HLA-B*1502等位基因。另一方面，该等位基因在卡马西平耐受组患者中出现的频率仅为4.1％(3/73)，苯妥英耐受组为0％(0/32)，罹患SJS以外之较温和药物不良反应为6.3％(9/142)，而一般族群的出现频率则为5.3％(5/94)。采用耐受组作为对照组时，与卡马西平-所诱发SJS/TEN相关之B*1502之风险对比值、灵敏度、专一性、正预估值及负预估值分别为1712、100％、95.89％、96.0％与100％。由于具有如此高度的预估值与灵敏度，此HLA-B等位基因之存在可用于判别出何者为药物所诱发SJS/TEN(尤其是卡马西平与苯妥英所诱发SJS/TEN)之高危险患者。
卡马西平所诱发温和不良反应被发现与另一种等位基因HLA-B*4601相关。在16位对卡马西平表现出此等较温合反应之患者中，有10位(62.5％)患者带有HLA-B*4601。相反地，该等位基因在卡马西平耐受组中的出现频率仅为26％(19/73)。B*4601基因与卡马西平所诱发较温和皮肤药物不良反应相关的风险对比值为4.73。因此，HLA-B*4601可用于评估卡马西平对患者是否具有诱发温和皮肤ADR之风险。
表2：患者出现卡马西平所诱发皮肤药物不良反应的表现型/基因型资料
 
ID 有嫌疑之药物 表现型 HLA-B基因型
1 卡马西平 SJS B*1502/B*3802
2 卡马西平 SJS B*1502/B*3501
3 卡马西平 SJS B*1502/B*4006
4 卡马西平 SJS B*1502/B*3802
5 卡马西平苯妥英 SJS B*1502/B*3802
6 卡马西平 SJS B*1502/B*3802
7 卡马西平 SJS B*1502/B*4001
8 卡马西平 SJS B*1502/B*3901
9 卡马西平 SJS B*1502/B*5801
10 卡马西平 SJS B*1502/B*5801
 
11 卡马西平 SJS B*1502/B*1525
12 卡马西平 SJS B*1502/B*4002
13 卡马西平 SJS B*1502/B*4006
14 卡马西平 SJS B*1502/B*5801
15 卡马西平 重迭SJS/TEN B*1301/B*1502
16 卡马西平 重迭SJS/TEN B*1502/B*3501
17 卡马西平 SJS B*1502/B*3802
18 卡马西平 SJS B*1502/B*4601
19 卡马西平 SJS B*1301/B*1502
20 卡马西平 SJS B*1502/B*5801
21 卡马西平 SJS B*1502/B*4601
22 卡马西平非固醇类消炎药 SJS B*1502
23 卡马西平 SJS B*1502/B*3501
24 卡马西平 SJS B*1502/B*4601
25 卡马西平 SJS B*1502/B*4601
26 卡马西平 SJS B*1502/B*5801
27 卡马西平 SJS B*1501/B*1502
28 卡马西平 SJS B*1502/B*4001
29 卡马西平 SJS B*1502
30 卡马西平，美乐西肯，速灵丹，苯妥英 SJS B*1502/B*5801
31 卡马西平 SJS B*1502/4601
32 卡马西平 SJS B*1502/5801
33 卡马西平 SJS B*1502/4601
34 卡马西平 SJS B*1502/5502
35 卡马西平 SJS B*1502
36 卡马西平苯妥英 SJS B*1502/4002
37 卡马西平 SJS B*1502/4001
38 卡马西平 SJS B*1502
39 卡马西平苯妥英 SJS B*1502
40 卡马西平 重迭SJS/TEN B*1502/4001
41 卡马西平 重迭SJS/TEN B*1502/4601
42 卡马西平 SJS B*1502/3802
43 卡马西平 斑丘疹 B*5801/B*4601
 
44 卡马西平 多形性红斑 B*4001/B*4601
45 卡马西平 斑丘疹 B*1301/B*4001
46 卡马西平 血管性水肿 B*4601/B*5401
47 卡马西平 斑丘疹 B*4001/B*4601
48 卡马西平，非固醇类消炎药 斑丘疹 B*4001/B*4001
49 卡马西平 斑丘疹 B*1301/B*5502
50 卡马西平 唇肿大、口腔与生殖器溃疡 B*4601/B*5801
51 卡马西平 斑丘疹 B*4601/B*5801
52 卡马西平 血管性水肿 B*4001
53 卡马西平 斑丘疹 B*4001/B*5101
54 卡马西平 斑丘疹 B*1301/4001
55 卡马西平 斑丘疹 B*4001/B*4601
56 卡马西平 多形性红斑 B*4601/B*5401
57 卡马西平 斑丘疹 B*4601
58 卡马西平 多形性红斑 B*4601/5101
实例四：别嘌醇所导致之SJS/TEN与HLA-B*5801之相关性
HLA-B*5801等位基因被发现与别嘌醇所诱发SJS/TEN有关。17位对别嘌醇出现SJS/严重ADR之患者均检测到带有HLA-B*5801等位基因(100％)(表3与4)，但在台湾一般民众中HLA-B*5801出现比率仅为18％(风险对比值155，敏感度100％，专一性82％，正预估值84.7％，负预估值100％，Pc＝3.7 x 10-9)。这些结果显示，HLA-B*5801等位基因可单独或与其它基因标记合并，用以评估服用别嘌醇之患者是否有发生SJS/TEN之风险。
表3：17位患有别嘌醇诱发之严重皮肤药物不良反应的台湾患者体内之HLA-B*5801频率
Figure A200780017021D00321
a，出现别嘌醇所诱发皮肤ADR以外之药物不良反应之患者
b，台湾一般民众
X2，经过叶慈校正之开方检定后之P值
Pc，原始P值乘以所观察到之HLA-B等位基因数(35)之计算值。
表4：出现别嘌醇所诱发皮肤ADR之患者之表现型/基因型数据
 
患者ID 有嫌疑之药物 表现型 HLA-B基因型
59 别嘌醇 SJS B*0705/B*5801
60 别嘌醇 SJS B*4001/B*5801
61 别嘌醇 SJS B*1554/B*5801
62 别嘌醇 SJS B*3901/B*5801
63 别嘌醇 SJS B*5801
64 别嘌醇 SJS B*3901/B*5801
65 别嘌醇 SJS B*3901/B*5801
66 别嘌醇 SJS B*4001/B*5801
67 别嘌醇 SJS B*1502/B*5801
68 别嘌醇 SJS B*4001/B*5801
69 别嘌醇 SJS与腿部脉管炎 B*4601/B*5801
70 别嘌醇 SJS与苔藓样疹 B*4001/B*5801
71 别嘌醇 SJS B*4002/B*5801
72 别嘌醇 SJS B*4001/B*5801
73 别嘌醇 SJS B*5101/B*5801
74 别嘌醇 SJS B*1301/5801
75 别嘌醇 SJS B*5801
实例五：别嘌醇所导致之HSS与HLA-B*5801之相关性
HLA-B*5801等位基因也被发现与别嘌醇所诱发之过度敏感症候群(HSS)有关，其病征为皮肤发疹(例如弥漫性丘疹、剥落性皮肤炎)、发热、嗜酸性白血球增多症、非典型循环性淋巴球、白血球增多症、急性肝损伤、或是肾功能恶化(Arellano et al.，Ann.Pharmacother.，27：337，1993)。
本研究中的31位患者中，患有SJS的有21位、SJS/TEN有3位、TEN有1位，以及有15位患有HSS。在纳入本研究中所有的病例中，如果该药物不良反应症候群病发于接触别嘌醇后的两个月内，以及该不良药物症候群症状随着停药消退，则认为别嘌醇是造成该病症之药物。统计时，患者具有下列症状任何之一者将被排除在外：再度接触别嘌醇后无症状，或是出现较温和的皮肤出疹(症状未达到HSS、SJS或是TEN之标准)患者。
在上述31位患者中，所有患者均在接触别嘌醇后的两个月内发生HSS症候群，其中有两位患者在再度接触别嘌醇的两天后又病发。有12位患者接受除了别嘌醇之外的药物，但是在他们的病历中发现，患者在这种合并用药的情况下，将其服用药物去除别嘌醇后，患者则未出现药物不良反应。所有的患者均患有高尿酸血症且/或痛风、以及其它慢性疾病，包括高血压(14/31)、慢性肾病(16/31)、及糖尿病(9/31)。
在服用别嘌醇至少6个月仍未出现药物不良反应症候群的98位痛风患者则纳入可耐受别嘌醇之对照组(服药平均时间为38个月，范围为6-107个月)。耐受对照组中的性别比例与一般中国人的痛风普行率相当。此外，本研究更进一步地纳入93位正常民众做为正常对照组。上述三组之人口统计学资料如表5所示。
表5：严重药物不良反应患者组、耐受对照组、以及正常民众的人口统计学数据、服用别嘌醇的剂量与时间
 
                  严重药物不耐受对照组    正常民众良反应(n＝98)       (n＝93)(n＝31)
性别男性              12            89          52女性              19            9           41
年龄(岁)中位数(范围)      57.9(18-91)   57.3(21-84) 53.9(22-91)
服用别嘌醇的剂量(毫克/天)143.3         159.2中位数(范围)                                无(50-300)       (100-400)
服用别嘌醇的时间28.2天        38个月中位数(范围)                               无(1-56)        (6-107)
在31位得到由别嘌醇诱发之药物不良反应的患者均带有(100％)HLA-B*5801等位基因，98位可耐受别嘌醇之患者中有16位(16.3％)带有HLA-B*5801等位基因(风险对比值315，Pc<10-15)，93位正常中有19位(20％)带有HLA-B*5801等位基因(风险对比值241，Pc<10-13)。与耐受对照组相比，对于别嘌醇诱发之药物不良反应，HLA-B*5801的缺失其负预估值为100％，而HLA-B*5801的存在其正预估值为66％。因此，由于具有如此高度的专一性(84％)与灵敏度(100％)，HLA-B*5801之存在可用于判别出何者为对别嘌醇所诱发严重药物不良反应(包含皮肤药物不良反应，例如SJS/TEN或HSS，以及别嘌醇所诱发之DRESS(drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms))之高危险患者。
实例六：HLA-B*1502或HLA-B*5801之等效基因标记(Genetic markersEquivalent)
接近所需HLA等位基因之基因标记倾向于共同分离(co-segregate)，或与所需等位基因出现一连锁不平衡状态(linkage disequilibrium)。因此，此等标记(等效基因标记)之存在即代表该等位基因之存在。
为了测试药物不良反应之患者带有等效基因标记之好发率，本研究测定HLA-B*1502单倍体中数种标记与药物不良反应之相关性。事实上，HLA-B*1502单倍体之HLA标记，如：DRB1*1202、Cw*0801、Cw*0806、A*1101与MICA*019，在曾接触过卡马西平之SJS/TEN患者中具有显著较高之出现频率(表6)。
表6：B*1502祖传单倍体之标记与药物不良反应之相关性
 
卡马西平SJS/TEN(n＝42) 卡马西平轻微症状(n＝16) 卡马西平耐受(n＝73) 别嘌醇1SJS/TEN(n＝17) 一般大众(n＝94)
HLA-B*1502HLA-Cw*0801HLA-Cw*0806HLA-A*1101HLA-DRB1*1202 42(100％)38(90％)3(7.1％)31(73.8％)35(83.3％) 0(0％)NDNDNDND 3(4.1％)10(13.7％)0(0％)NDND 1(5.8％)10(11.7％)0(0％)NDND 5(5.3％)10(10.6％)0(0％)28(29.8％)19(20.2％)
本研究也判定与HLA-B*5801相关之标记。在四位为HLA-B*5801同型合子的患者中研究其等位基因分布，而其祖传单倍体被定义为包括HLA-A*3303、Cw*0302、B*5801、与DRB1*0301。31位患有别嘌醇所诱发药物不良反应之患者中，有12位(38.7％)带有此祖传单倍体(表7)，但是只有7.1％的耐受组患者以及9.7％的正常民众带有此祖传单倍体。
表7：HLA-B*5801祖传单倍体之单独或组合基因位点在别嘌醇诱发药物不良反应患者、别嘌醇耐受患者、以及正常大众中的出现频率
 
                           别嘌醇诱别嘌醇耐          正常大发药物不受组              众良反应组(n＝98)           (n＝93)(n＝31)
                                                             19B*5801                     31(100％)       16(16.3％)1(20.4％)219Cw*0302                    29(93.5％)      15(15.3％)(20.4％)20A*3303                     20(64.5％)      18(18.4％)(21.5％)14DRB1*030121               (67.7％)         14(14.3％)(15.1％)19B*5801，Cw*0302            29(93.5％)       15(15.3％)(20.4％)16B*5801，Cw*0302，A*3303    20(64.5％)       13(13.3％)(17.2％)10B*5801，Cw*0302，19(61.3％)       9(9.2％)(17.2％)10DRB1*0301                                                    (10.8％)B*5801，Cw*0302，A*3303，12(38.7％)      7(7.1％)         9(9.7％)DRB1*0301
1风险对比值(别嘌醇诱发药物不良反应组/耐受组)：315(95％ CI，18.3-5409.5)，pc＝7.5 x 10-16.
2风险对比值(别嘌醇诱发药物不良反应组/正常大众组)：241(95％ CI，14.1-4111)，pc＝6.1 x 10-14.
本研究也使用短序列重复多型性(short tandem repeat polymorphism，STRP)试验决定HLA-B*5801此MHC标记之表现。简言之，由NCBI数据库中选择20个位于MHC区域内具有高度多型性的微卫星标记(microsatellite marker)，如：D6S258、D6S2972、D6S510、D6S265、D6S388、D6S2814、HLAC_CA1、HLABC_CA2、MIB、MICA、TNFd、BAT2_CA、D6S273、D6S1615、DQCAR、G51152、D6S2414、D6S1867、D6S1560、以及D6S1583。此等标记之平均异质性为0.72，预期长度为230kb。
依据数据库中数据设计引物以实施聚合酶链反应，来扩增并检测患者体内是否带有上述标记。实验使用GeneAmp 9700自动梯度温度循环调控机(美商应用生命系统，Foster City，CA，USA)，反应体积为5微升，反应试管中含有10奈克的基因组DNA，各引物的浓度为0.33微摩尔。将至多6个具有适当长度且显示出荧光讯号的聚合酶链反应产物，在实施毛细管电泳之前混合。使用ABI3730 DNA定序仪(美商应用生命系统)进行电泳来判定该多型性产物的长度，并使用LIZ500尺寸标准做为内部长度基准(美商应用生命系统)，使用GENMAPPER(美商应用生命系统)第三版来计算等位基因长度。使用SAS程序来进行等位基因的分型与扫描。所有基因组定型实验中，使用3个CEPH对照个体(1331-01、1331-02、1347-2)以及H20做为质量控制之用。
使用连锁不平衡的方式进行分析，发现到在别嘌醇诱发药物不良反应患者组别中，有一等位基因区块落于HLA-C与TNFd之间，但是在别嘌醇耐受组中并无此发现。在此区块中，辨识出靠近HLA-B等位基因处有一单倍体(MIC*358-MICA*206-TNFd*140)。此单倍体与药物不良反应之关联性和HLA-B*5801与该相同药物不良反应之关联性一致(p＝0.0018)。藉由使用STRP标记以及将MICA等位基因做测序，在所有的别嘌醇诱发药物不良反应患者体内均带有该相同的B等位基因(B*5801)、MICA等位基因(MICA*00201)、以及TNF STRP标记(TNFd*140)。除了一位患者外，其余所有患者均带有该相同的MIB标记(MIB*358)。
实例七：卡马西平反应之T细胞对奥卡西平与利卡西平的交叉反应
两位患有卡马西平诱发SJS/TEN之患者系来自长庚纪念医院，其中一位患者带有HLA-B*1502/B*4601，另一位则带有HLA-B*1502/B*5101。使用PUREGENE DNA纯化系统(Gentra system，Minnesota，USA)自患者体内抽取基因组DNA，患者的HLA-B等位基因基因型则是使用序列专一性寡核苷酸(SSO)片段进行“逆向直线墨点分析法”(DYNAL生物技术有限公司，Bromborough，U.K.)来鉴定。
使用Ficoll-Isopaque(Pharmarcia Fine Chemicals，Piscataway，NJ)密度梯度离心法自患者体内分离出周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，其中一部分的周边血液单核细胞用鼻咽癌病毒(Epstein-Bar virus)感染后转型，以建立自体B细胞株。
增殖对卡马西平有反应之T细胞的方法如下所述：由该患者体内制备之周边血液单核细胞培养于完整RPMI(Sigma)培养液(内含10％经过加热去活化的人类血清、25单位/毫升的介白素-2(IL-2)，以及25微克/毫升的卡马西平)之中，并将其置于37℃、含有5％二氧化碳的恒温培养箱中培养七天。在卡马西平存在的状态下，加入经放射线照射(50Gy)后之自体B细胞共同培养10天，以增殖该T细胞。经过2轮上述之共同培养步骤之后，收集该经卡马西平活化之T细胞，进行酶联免疫点渍试验(ELISPOT)(eBioscience)。
测试该卡马西平活化之T细胞对于下列化合物的交叉反应性：10，11-环氧卡马西平、奥卡西平(商品名：除癫达(Trileptal))、利卡西平，以及苏林酸(sunlindac)。简言之，5 x 103颗T淋巴球与5 x 104颗自体B细胞于200微升的RPMI培养液中(内含10％胎牛血清)相互混合，并加入或不加入一待测化合物。之后将上述之细胞置于一酶联免疫点渍试验(ELISPOT)试验盘的培养孔中培养24小时，该试验盘上涂有抗γ干扰素抗体(Millipore)。经过培养后，收集培养细胞之上清液。使用一抗体试验方式检测上清液所含的抗γ干扰素，该抗体试验方式为本领域公知方法。
本研究之实验结果显示，对卡马西平有反应之T细胞对于10，11-环氧卡马西平、奥卡西平、利卡西平亦具有交叉反应性，但对于苏林酸(sunlindac)则不具交叉反应性。
其他实例
于本说明书中所揭露之特征可以任何方式加以组合，且各个特征可被一具有相同、等效，或相似功效之特征所取代。因此，除非额外加以说明，所揭露之特征仅为由等效或相似之特征组成之系列其中之一例。
以上所述仅为本创作之较佳实施例而已，并非用以限定本发明之申请专利权利；同时以上的描述，对于熟知本技术领域之专门人士应可明了及实施，因此其它未脱离本创作所揭示之精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在下述之申请专利范围中。

Claims (20)

1.一种用来判定患者是否带有HLA-B*1502的方法，该方法包含下列步骤：
检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第一区域；
检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第二区域；以及
判定该患者是否带有HLA-B*1502，该第一区域与第二区域两者均存在，则表示该患者带有HLA-B*1502。
2.依据权利要求1所述的方法，其中检测该区域1的方法是通过鉴别其中位置1与3的核苷酸来达成。
3.依据权利要求1所述的方法，其中检测该区域2的方法是通过鉴别其中位置1与6的核苷酸来达成。
4.依据权利要求1所述的方法，其中检测该区域3的方法是通过鉴别其中位置1与3的核苷酸来达成。
5.依据权利要求1所述的方法，其中该第一区域及第二区域任一的检测是通过CSSO-ELISA或Real-Time PCR。
6.一种用来判定患者是否带有HLA-B*1502的方法，该方法主要包括下列步骤：
检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第一区域；
检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第二区域；以及
判定该患者是否带有HLA-B*1502，该第一区域与第二区域两者均存在，则表示该患者带有HLA-B*1502。
7.依据权利要求6所述的方法，其中该第一区域的检测是通过鉴别其中位置1与3的核苷酸来达成。
8.依据权利要求6所述的方法，其中该区域2的检测是通过鉴别其中位置1与6的核苷酸来达成。
9.依据权利要求6所述的方法，其中该区域3的检测是通过鉴别其中位置1与3的核苷酸来达成。
10.依据权利要求6所述的方法，其中该区域是通过CSSO-ELISA或Real-Time PCR检测。
11.一种用来判定患者是否带有HLA-B*1502的试剂盒，该试剂盒包括：
一第一探针，用以检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第一区域；以及
一第二探针，用以检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第二区域。
12.依据权利要求11所述的试剂盒，其中该试剂盒更进一步包括有一第三探针，用以检测一内部对照的等位基因。
13.依据权利要求11所述的试剂盒，其中该第一探针与第二探针为寡核苷酸。
14.依据权利要求13所述的试剂盒，其中该寡核苷酸为一对引物。
15.一种用来判定患者是否带有HLA-B*1502的三探针试剂盒，该试剂盒包括：
一第一探针，用以检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第一区域；
一第二探针，用以检测选自HLA-B*1502的区域1-6的第二区域；以及
一第三探针，用以检测一内部对照的等位基因。
16.一种用来判定患者是否带有HLA-B*5801的方法，该方法包含下列步骤：
检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第一区域；
检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第二区域；以及
判定该患者是否带有HLA-B*5801，该第一区域与第二区域两者均存在，则表示该患者带有HLA-B*5801。
17.一种用来判定患者是否带有HLA-B*5801的方法，该方法主要包括：
检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第一区域；
检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第二区域；以及
判定该患者是否带有HLA-B*5801，该第一区域和第二区域的存在，则表示该患者带有HLA-B*5801。
18.一种用来判定患者是否带有HLA-B*5801的试剂盒，该试剂盒包括：
一第一探针，用以检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第一区域；以及
一第二探针，用以检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第二区域。
19.一种用来判定患者是否带有HLA-B*5801的三探针试剂盒，该试剂盒包括：
一第一探针，用以检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第一区域；
一第二探针，用以检测选自HLA-B*5801的区域1-6的第二区域；以及
一第三探针，用以检测一内部对照的等位基因。
20.一种确定一化合物是否成为诱导带有药物不良反应相关的HLA等位基因的患者发生药物不良反应的候选物的方法，该方法包含以下步骤：
从带有药物不良反应相关的HLA等位基因的患者体内分离出T细胞；
培养增殖对该药物有反应的T细胞；
从患者体内分离抗原呈递细胞；
在抗原呈递细胞存在下将该增殖T细胞与一化合物进行接触；以及
检测该化合物是否会活化该增殖后的T细胞，其中会活化该增殖T细胞的该化合物，则为可诱发带有药物不良反应相关的HLA等位基因的患者发生药物不良反应的候选物。
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