PL226331B1 - Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi oraz zastosowanie mutacji skracających białko CHEK2 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotami wynalazku są sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi oraz zastosowanie mutacji genu CHEK2 do wykrywania takiej predyspozycji. Wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej wykrywającej wysokie ryzyko raka piersi u kobiet w polskiej populacji.

W polskiej populacji wykryto cztery częste powtarzalne mutacje w obrębie genu CHEK2 (IVS2+1G>A, del5395, 1100delC, I157T) [1-3]. Są to zmiany założycielskie pochodzące od wspólnych przodków w naszej homogennej genetycznie populacji, co udowodniono i opublikowano w roku 2004 [2]. Mutacje te łącznie występują z wysoką częstością 6% w naszej populacji, a więc w Polsce żyje około 2,5 min nosicieli mutacji genu CHEK2. Odkrycie mutacji założycielskich genu CHEK2 stwarza unikalną możliwość szybkiej diagnostyki genetycznej opartej o identyfikację tych zmian DNA. Koszt testu opartego o wykrywanie wybranych mutacji charakterystycznych dla polskiej populacji jest wielokrotnie mniejszy niż koszt pełnej analizy sekwencji genu, a czas badania nieporównywalnie krótszy. Taki test może być wykonywany w wielu laboratoriach bez konieczności stosowania skomplikowanego i kosztownego sprzętu. Dotychczas wykazano, że mutacje założycielskie genu CHEK2 obecnie w polskiej populacji predysponują do zachorowania na różne nowotwory złośliwe, w tym na raka piersi [zgłoszenie patentowe P.367319, publikacje 1-7]. Wykazano, że nosicielstwo mutacji genu CHEK2 wiąże się z umiarkowanie zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka piersi - ryzyko jest zwiększone około 1,5- do 3-krotnie w zależności od rodzaju mutacji, jednak nie jest to wysokie ryzyko zachorowania.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu CHEK2, przy czym wykrycie takiej zmiany u pacjentki w której rodzinie występował rak piersi u co najmniej jednego krewnego I i/lub n stopnia oznacza ryzyko raka piersi wynoszące powyżej 25%, przy czym bada się obecność co najmniej jednej mutacji skracających białko CHEK2 wybranej spośród: IVS2+1G>A, del5395, 1100delC, natomiast pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego.

Korzystnie, obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), innych metod pośredniego lub metod bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutacji skracającej białko CHEK2 wybranej spośród: IVS2+1G>A, del5395, 1100delC do wykrywania ryzyka raka piersi wynoszącego powyżej 25% u pacjentki, w której rodzinie występował rak piersi u co najmniej jednego krewnego I i/lub II stopnia, przy czym pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego, a wykrywanie obejmuje prowadzone in vitro badanie obecności mutacji w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki.

W sposobie według wynalazku zastosowanie wykrywania specyficznych mutacji genu CHEK2, trzech mutacji skracających białko CHEK2 (mutacja IVS2+1G>A, mutacja del5395, mutacja 1100delC) identyfikuje od 4- do 7-krotne zwiększone ryzyko zachorowania na raka piersi u Polek. Prawdopodobieństwo zachorowania na raka piersi u kobiety w polskiej populacji w ciągu życia wynosi około 6%. Natomiast kobieta, u której identyfikuje się predyspozycję za pomocą nowego testu diagnostycznego, obarczona jest wysokim genetycznie uwarunkowanym ryzykiem zachorowania - 25% do 44% prawdopodobieństwem zachorowania na raka piersi w ciągu życia.

Identyfikacja wysokiego ryzyka genetycznego ma znaczenie praktyczne, gdyż umożliwia indywidualizację postępowania medycznego, opracowanie skutecznych metod prewencji, diagnostyki i leczenia nowotworów u osób z grupy ryzyka. Zgodnie z wynalazkiem ujawniono sposób, w którym zastosowanie badania specyficznych mutacji genu CHEK2 (mutacji skracających białko CHEK2 mutacji IVS2+1G>A, mutacji del5395 i mutacji 1100delC) identyfikuje wysokie ryzyko raka piersi. Kluczowe w opracowaniu niniejszego testu było odkrycie zależności pomiędzy występowaniem specyficznych mutacji skracających białko CHEK2 u kobiet a historią rodzinną nowotworów. Odkrycie to możliwe było dzięki analizie dużych grup przypadków i kontroli w homogennej genetycznie populacji polskiej. Odkryliśmy, że ryzyko raka piersi u nosicielek mutacji skracających białko CHEK2 jest wysokie, gdy w ich rodzinie występowało co najmniej jedno zachorowanie na raka piersi u krewnych I i/lub II stopnia. Wówczas ryzyko zachorowania jest zwiększone od 4,1 do 7,3 krotnie, co odpowiada wysokiemu prawdopodobieństwu, od 25% do 44%, zachorowania na raka piesi w ciągu życia kobiety w naszej

PL 226 331 B1 populacji. Dla porównania ryzyko raka piersi wynosi jedynie 6% u Polki, u której nie stwierdza się mutacji genu CHEK2. Tak więc, nowy test identyfikuje w polskiej populacji kobiety obarczone wysokim dziedzicznie uwarunkowanym ryzykiem raka piersi. Działanie mutacji zależy od genetycznego i środowiskowego podłoża populacyjnego, tj. zmiany DNA związane z ryzykiem choroby w jednej populacji mogą nie predysponować do choroby w innych populacjach. Tak więc, test genetyczny oparty o wykrywanie specyficznych mutacji genu CHEK2 opracowany na modelu homogennej genetycznie populacji polskiej, ma zastosowanie w tej populacji. Dotychczasowe badania w innych grupach etnicznych opisują mutacje CHEK2, jako zmiany niskiej penetracji dla raka piersi [8-17]. Prace są ograniczone w zasadzie do mutacji 1100delC i podają, że mutacja ta jest zmianą o niskiej penetracji dla raka piersi. Inne mutacje skracające białko CHEK2 - mutacje IVS2 +1G>A i del5393, są rzadkie w innych populacjach i również nie były dotychczas opisywane, jako zmiany wysokiego ryzyka raka piersi [4, 18, 19]. Tak więc opracowanie niniejszego testu diagnostycznego opartego o wykrywanie mutacji skracających białko CHEK2 (IVS2+1G>A, del5395, 1100delC) jest nowatorskie i było możliwe dzięki badaniu dużych grup pacjentów, częstym występowaniu mutacji założycielskich genu CHEK2 w populacji polskiej, homogenności genetycznej tej populacji.

Dotychczas nikt na świecie nie przedstawił analiz precyzyjnie określających, w jakim stopniu ryzyko u nosicielek mutacji CHEK2 zależy od występowania raka piersi u poszczególnych krewnych w rodzinie, co obecnie umożliwia zastosowanie nowego testu CHEK2 (przykład 1). Wyniki przedstawione w przykładzie 1 dowodzą, że jeżeli Polka jest nosicielką jednej z trzech mutacji skracających białko CHEK2 (IVS2+1G>A, del5395, 1100delC) i dodatkowo:

a) jej matka chorowała na raka piersi, to ryzyko zachorowania jest zwiększone 6, 1 -krotnie, co odpowiada 37% prawdopodobieństwu zachorowania na raka piersi w ciągu jej życia;

b) jej siostra chorowała na raka piersi, wówczas ryzyko jest zwiększone 5,9-krotnie, co odpowiada 35% prawdopodobieństwu zachorowania na raka piersi w ciągu życia;

c) raka piersi zdiagnozowano u jej ciotki lub babci od strony matki, wówczas ryzyko jest zwiększone 5-krotnie, co odpowiada 30% prawdopodobieństwu zachorowania na raka piersi;

d) raka piersi zdiagnozowano u jej ciotki lub babci od strony ojca, to ryzyko jest zwiększone 4,1-krotnie, co odpowiada 25% prawdopodobieństwu zachorowania na raka piersi w ciągu życia;

e) raka piersi stwierdzono u krewnych I i II stopnia, ryzyko wówczas jest zwiększone 7,3-krotnie, co odpowiada 44% ryzyku zachorowania na raka piersi u kobiety w naszej populacji.

Tak więc prezentowany sposób identyfikuje wysokie genetycznie uwarunkowane ryzyko raka piersi u Polki, w której rodzinie stwierdzono jedno lub więcej zachorowań na ten nowotwór.

Ogromną zaletą tego testu jest to, iż określa on nową grupę wysokiego ryzyka - kobiety z pojedynczymi zachorowaniami na raka piersi w rodzinie, u których wykrywa się specyficzne mutacje genu CHEK2 (gdy nie stwierdza się mutacji genu CHEK2, kobiety z pojedynczymi zachorowaniami na raka piersi nie są w grupie wysokiego ryzyka). Wskazania do wykonywania testu są określone - odbiorcą opisywanego testu są kobiety, u których w rodzinie występował rak piersi u co najmniej jednego krewnego I i/lub II stopnia.

Zastosowanie testu CHEK2 stwarza możliwość objęcia pacjentek zindywidualizowanym postępowaniem medycznym. Wykazano wysoką skuteczność rezonansu magnetycznego (MRI) piersi w wykrywaniu wczesnego raka piersi w grupie wysokiego ryzyka genetycznego. Według zaleceń American Cancer Society u kobiet z grupy ryzyka raka piersi powyżej 20% wskazane jest wykonywanie MRI piersi [20]. Opisywany sposób i zestaw diagnostyczny wykrywa ryzyko raka piersi wynoszące powyżej 25%. Dlatego kobiety zidentyfikowane za pomocą tego zestawu diagnostycznego są kandydatkami do badań MRI piersi, które nie są rutynowo stosowane w badaniach przesiewowych ze względu na wysoki koszt MRI (w porównaniu do mammografu i USG). W większości przypadków raka piersi u nosicielek mutacji genu CHEK2 stwierdza się ekspresję receptora estrogenowego [21-25]. Dlatego kobiety z grupy wysokiego ryzyka wykrytego za pomocą testu opisywanego w niniejszym wniosku są kandydatkami do chemoprewencji tamoxifenem [24].

P r z y k ł a d 1.

A) Ustalanie korelacji pomiędzy mutacjami skracającymi białko CHEK2 ( IVS2+1 G>A1100delC, del5395), nowotworowym wywiadem rodzinnym, a predyspozycją do raka piersi w polskiej populacji

Zasady testu, wybór grupy pacjentów

Aby ustalić ryzyko związane z występowaniem mutacji genu CHEK2, przeprowadzono analizę występowania zmian IVS2+1G>A, 1100delC, del5395 i I157T w grupie 7931 kobiet z inwazyjnym rakiem piersi, zdiagnozowanych w latach od 1996 do 2006 w 18 szpitalach w Polsce. Pacjentki nie

PL 226 331 B1 były selekcjonowane pod względem historii rodzinnej zachorowań na nowotwory. Łącznie zaproszono 10545 kobiet z rakiem piersi, od 7931 (75,2%) z nich uzyskano próbki krwi, z których wyizolowano genomowe DNA.

Wszystkie kobiety (n = 7931) zostały przebadane na obecność trzech mutacji założycielskich genu BRCA1 (C61G, 4153delA i 5382insC), które stanowią około 90% wszystkich mutacji BRCA1 stwierdzanych w polskiej populacji [26, 27]. U 435 kobiet z rakiem piersi stwierdzono jedną z trzech mutacji założycielskich genu BRCA1 (C61G lub 4153delA lub 5382insC) - przypadki te zostały wykluczone z dalszych analiz.

Ostatecznie do analiz genu CHEK2 włączono 7496 kobiet z rakiem piersi, u których nie stwierdzono mutacji genu BRCA1 (w wieku od 21 do 92 lat, średnia 49,7 lat): u 5152 z nich raka piersi zdiagnozowano w wieku poniżej 51 roku życia, u 2344 z nich raka piersi zdiagnozowano w wieku powyżej 50 roku życia. Od wszystkich pacjentek zebrano dane rodowodowe odnoście zachorowań na nowotwory u krewnych I i II stopnia. U 1451 kobiet występowały zachorowania na ten nowotwór u krewnych I i/lub II stopnia (przypadki rodzinne). Ponadto zgromadzono informacje odnośnie charakterystyki klinicznej raków piersi.

Grupę kontrolną stanowiło 4346 kobiet w wieku 19-91 lat (średnia wieku 52,2 lat). Kontrole te pochodziły z czterech źródeł. Pierwsza grupa to 705 młodych kobiet (w wieku 18-34 lat, średnia 22,0) z regionu Szczecina, od których pobrano próbki krwi do badań spornego ojcostwa w latach 1994-2001. Druga grupa to 1079 kobiet (w wieku 15-91, średnia 58,3), które zostały wybrane losowo z list komputerowych pacjentów lekarzy rodzinnych z rejonu Szczecina. Trzecia podgrupa kontrolna składała się z 1141 zdrowych kobiety z okolic Szczecina (przedział wiekowy 24-84, średnia 54,0), które wypełniły ankiety w ramach badanie populacyjnego 1,5 min mieszkańców Pomorza Zachodniego przeprowadzonego w celu identyfikacji rodzinnych agregacji nowotworów. Do tej podgrupy zaproszono kobiety, u których w rodzinie nie stwierdzono nowotworów. Czwarta seria zawierała 1421 zdrowych kobiet (w wieku 56-66, średnia 59,7), które uczestniczyły w kolonoskopowym programie badań przesiewowych w latach 2005-2010. Stwierdzone częstości mutacji genu CHEK2 były podobne w podgrupach kontroli pochodzącej z czterech źródeł (tabela 1).

T a b e l a 1. Częstość mutacji CHEK2 w grapie kontrolnej

Grupa kontrolna zdrowych kobiet	Mutacje skracające białko*	Mutacja missense I157T
Grupa kontrolna 1	5	32
n = 705	0.71%	4.5%
Wiek 18-34 (średnia 22.0)
Grupa kontrolna 2	10	59
n = 1079	0.93%	5.5%
Wiek 15-91 (średnia 58.3)
Grupa kontrolna 3
n= 1141	8	60
Wiek 24-84 (średnia 54.0)	0.70%	5.3%
Grupa kontrolna 4
n= 1421	14	64
Wiek 56-66 (średnia 59.7)	0.98%	4.5%
Wszystkie kontrole	37	215
n = 4346	0.85%	4.9%
Wiek 19-91 (średnia 52.2)

- del5395 lub IVS2+1G>A lub 1100delC

PL 226 331 B1

Izolacja genomowego DNA

Od wszystkich pacjentów pobrano próbkę krwi obwodowej. Do probówek zawierających 1 ml 1 M wersenianu sodu pobierano 10 ml krwi obwodowej. W celu rozbicia błony komórkowej do próbek dodawano roztwór TKM (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 2 mM EDTA, 4 mM MgCl2) i 1 ml Igepal (SIGMA). Następnie próbkę wirowano w temp. 20°C przez 10 minut przy 3400 obr./min. (w wirówce Eppendorf 581 OR). Po odwirowaniu zlewano supernatant zostawiając osad leukocytów, który następnie zalewano roztworem TKM i rozbijano ręcznie. Powstałą mieszaninę wirowano przy 3400 obr. w temp. 20°C przez 5 minut. Supernatant zlewano a powstały osad przepłukiwano dwukrotnie roztworem TKM. Następnie dodawano 0,5 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) i całość mieszano pipetą Pasterowską. W następnym etapie w celu rozbicia kompleksów białko-DNA próbkę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez 7 minut. Białko z roztworu wytrącano dodając 1 ml 5 M NaCl. Tak przygotowaną mieszaninę wirowano w temp. 20°C, przy 9900 obr./min. przez 25 minut. Powstały supernatant przenoszono do odrębnej probówki. Z roztworu supernatantu wytrącano DNA dodając 10 ml 96% alkoholu etylowego. Wytrącony „kłaczek” DNA przenoszono do probówki i suszono w suszarce próżniowej przez 10 minut. DNA rozpuszczano w 200 μΐ TE (25 Mm Tris, HCL, 1 Mm EDTA; pH 8,4) i przechowywano w 4°C.

Wykrywanie mutacji IVS2+1G>A

Mutację IVS2+1G>A wykrywano za pomocą techniki RFLP-PCR z użyciem enzymu Hpy 188III (New England Biolabs). Reakcję PCR przeprowadzono z parą starterów Ch2/3f 5'-TT TAT GAG CAA TTT TTA AAC G i Ch2/3r 5'-CC AGT AAC CAT AAG ATA ATA ATA TTA C w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΐ zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100 mM TrisHCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCl₂, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i d lTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 94°C 5 min

2. 94°C 30 sek. 35 cykli

58°C 45 sek.

72°C 60 sek.

3. 4°C χ

Trawienie produktów PCR przeprowadzono w 37°C przez 16 godzin w objętości 20 μl zawierającej: 5 μl produktu PCR, 1 x NE Buffer 4 (New England Biolabs) oraz 2U enzymu Hpy188III. Następnie, 15 μl strawionego produktu rozdzielano na 2% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 30 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Produkt PCR był trawiony w przypadkach z mutacją. Obecność mutacji w próbkach dodatnich w analizach RFLP-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji 1157T

Mutacja I157T była analizowana za pomocą RFLP-PCR z użyciem enzymu Pstl (New England Biolabs). Reakcję PCR przeprowadzono z parą starterów Chl57F (5'- A CCC ATG TAT CTA GGA GAG CTG) oraz Ch157R (5'-CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT GCA). Za pomocą startera Ch157R wprowadzono sztuczne miejsce restrykcyjne dla enzymu Pstl. Zastosowano warunki eksperymentalne amplifikacji PCR takie jak powyżej dla amplifikacji mutacji IVS2+1G>A.

Trawienie produktów PCR przeprowadzono w 37°C przez 16 godzin w objętości 20 μl zawierającej: 5 μl produktu PCR, 1 x NE Buffer 3 (New England Biolabs) and 2U enzymu Pstl. Następnie, 15 μl strawionego produktu rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Produkt PCR był trawiony w przypadkach z mutacją. Obecność mutacji w próbkach dodatnich w analizach RFLP-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji 1100delC

Mutację 1100delC wykrywano za pomocą ASO-PCR z wykorzystaniem primerów Chk2ex10f (5'-TTAATTTAAGCAAAATTAAATGTC), Chk2ex10r (5'-GGCATGGTGGTGTGCATC) i Chk2delC (5'-TGGAGTGCCCAAAATCATA). Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA Thermaleycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl

PL 226 331 B1 (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 μΐ buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1.	94°C 10 min
2.	94°C 25 sek.	9 cykli
	68°C do 55°C 72°C 35 sek.	25 sek. (obniżana temp. o 1,4°C w każdym cyklu)
3.	94°C 25 sek. 55°C 30 sek. 72°C 35 sek.	31 cykli
4.	4°C χ

Następnie, 15 μΐ produktu PCR rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. W przypadkach z mutacją uwidaczniał się dodatkowy produkt PCR zawierający delecję nukleotydu C. Obecność mutacji wykrytych w analizach ASO-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji del5395

Mutację del5395 wykrywano za pomocą metody muliplex-PCR z wykorzystaniem primerów (CHLdel2F TGT AAT GAG CTG AGA TTG TGC; CHLc2R CAG AAA TGA GAC AGG AAG TT, CHLdelR GTC TCA AAC TTG GCT GCG; CHLcF CTC TGT TGT GTA CAA GTG AC).

Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1.	94°C 10 min
2.	94°C 25 sek.	9 cykli
	68°C do 55°C 72°C 35 sek.	25 sek. (obniżana temp. o 1,4°C w każdym cyklu)
3.	94°C 25 sek. 55°C 30 sek. 72°C 35 sek.	31 cykli
4.	4°C χ

Następnie, 15 μl produktu PCR rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. W przypadkach z mutacją uwidaczniał się dodatkowy produkt PCR zawierający delecję 5395 pz. Obecność mutacji w próbkach dodatnich w analizach multiplexPCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Potwierdzenie obecności mutacji przez sekwencjonowanie

Amplifikację sekwencji kodującej genu CHEK2 zawierającej badane mutacje DNA przeprowadzono z użyciem starterów wykorzystanych do wykrywania poszczególnych mutacji, które są przedstawione powyżej. Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdej pary starterów, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCl₂, 1 mg/ml żelatyny, pH 8.6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA. Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

a) wstępna denaturacja - 95°C 5 minut

b) 35 cykli składających się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 53-58°C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund

PL 226 331 B1

Oczyszczanie produktów PCR: Produkty amplifikacji przenoszono na kolumienkę Microcon100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μΐ wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μΐ H₂O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 μ|.

PCR sekwencyjny: Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol jednego startera, 4 μl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 μl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W przypadkach gdy stwierdzono zmianę w trakcje sekwencjonowania z jednym starterem, wynik został potwierdzony poprzez sekwencjonowanie z drugim starterem z danej pary. Parametry sekwencyjnego PCR: wstępna denaturacja - 96°C 30sekund 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 55°C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund Całość produktów sekwencjonowania (20 μθ przenoszono do próbówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μl 96% etanolu oraz dodawano 1 μl kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po odwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20-30 min, po czym rozpuszczano w 4 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μΕ 50 mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems).

Wyniki

Mutacje skracające białko i mutację typu missense I157T rozpatrywano oddzielnie ze względu na ich odmienny wpływ na strukturę i funkcję białka.

Mutacje skracające białko CHEK2

Mutacje skracające białko CHEK2 (IVS2 +1G> A lub 1100delC lub del5395) stwierdzono u 227 z 7496 kobiet z rakiem piersi (3,0%) i 37 z 4346 kontroli (0,8%) (OR = 3,6; 95% CI = 2,6-5,1). Wartość OR wynosiła 3,1 (95% CI = 2,3 - 4,1) dla przypadków zdiagnozowanych poniżej 51 roku życia oraz 3,4 (95% CI = 2,4-4,7) dla przypadków zdiagnozowanych powyżej 50 roku życia.

Częstość mutacji skracających białko CHEK2 u kobiet z rakiem piersi, w zależności od występowania raka piersi w ich rodzinach u krewnych pierwszego i drugiego stopnia przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2. Wartości ryzyka (wyrażone jako OR) związane z mutacjami skracającymi białko CHEK2 w zależności od wywiadu rodzinnego.

Przypadki	IVS2+1G>A N (%)	1100delC N(%)	del5395 N (%)	Mutacja Skracająca białko N (%)	OR (95% CI)
Wszystkie przypadki raka	93 (1.2%)	49 (0.6%)	86 (1.1%)	227 (3.0%)	3.6 (2.6-5.1)
piersi n = 7496
Zdiagnozowane w wieku < 50 n = 5152	58 (1.1%)	35 (0.7%)	60 (1.2%)	152 (2.9%)	3.5 (2.5-5.1)
Zdiagnozowane w wieku > 50 n = 2344	35(1.5%)	14 (0.6%)	26 (1.1%)	75 (3.2%)	3.8 (2.6-5.7)

PL 226 331 B1

Wywiad raka piersi u krewnych I i/lub II stopnia Negatywny n = 6045	73 (1.2%)	32 (0.5%)	62 (1.0%)	167 (2.8%)	3.3 (2.3-4.7)
Pozytywny n = 1451	20 (1.4%)	17 (1.2%)	24 (1.6%)	60 (4.1%)	5.0 (3.3-7.6)
Krewny I stopnia z rakiem piersi n = 746	14 (1.9%)	9 (1.2%)	12 (1.6%)	35 (4.7%)	5.7 (3.6-9.2)
Matka z rakiem piersi n = 400	8 (2%)	4 (1%)	8 (2%)	20 (5%)	6.1 (3.5-10.7)
Siostra z rakiem piersi n = 334	6 (1.8%)	5 (1.5%)	5 (1.5%)	16 (4.8%)	5.9 (3.2-10.6)
Matka i siostra z rakiem piersi n = 23	0 (0%)	0 (0%)	1 (4.3%)	1 (4.3%)	5.3 (0.7-40.3)
Krewny II stopnia z rakiem piersi n = 823	8 (1%)	9 (1.1%)	16 (1.9%)	32 (3.9%)	4.7 (2.9-7.6)
Od strony ojca n = 378	6 (1.6%)	2 (0.5%)	5 (1.3%)	13 (3.4%)	4.1 (2.2-7.9)
Od strony matki n = 459	2 (0.4%)	7(1.5%)	11 (2.4%)	19 (4.1%)	5.0 (2.9-8.8)
Krewny I i II stopnia z rakiem piersi n = 118	2 (1.7%)	1 (0.8%)	4 (3.4%)	7 (5.9%)	7.3 (3.2-16.8)
Zdrowe kobiety - kontrole n = 4346				37 (0.8%)	ref.

Objaśnienie do tabeli 2:

Mutacja skracająca białko -del5395 lub IVS2+1G>A lub 1100delC

Częstość mutacji skracających w grupie kontrolnej jest stosowana do obliczenia wartości OR za pomocą testu

Fiszera (Fisher exact test)

Mutacje skracające białko CHEK2 stwierdzono w 60 z 1451 (4,1%) przypadków rodzinnych (OR = 5,0, 95% CI = 3,3-7,6), w 167 z 6045 (2,8%) przypadków sporadycznych (u których w rodzinie nie stwierdzono raka piersi) (OR = 3,3, 95% CI = 2,3-4,7) i 37 z 4346 osób z grupy kontrolnej (0,8%).

Następnie rozpatrzono, w jaki sposób ryzyko zachorowania zależy od występowania raka piersi u poszczególnych krewnych I i II stopnia. Dla nosicielek mutacji skracających białko CHEK2, których krewna I stopnia chorowała na raka piersi, wartość OR wynosiła 5,7 (95% CI = 3,6-9,2). Wartość OR była podobna dla kobiet, których matka chorowała na raka piersi (OR = 6,1, 95% CI = 3,5-10,7), jak dla kobiet, których siostra chorowała na raka piersi (OR = 5,9,95% CI = 3,2-10,6).

Dla nosicielek mutacji skracających białko CHEK2, w których rodzinie stwierdzono występowanie raka piersi u krewnych drugiego stopnia, wartość OR wynosiła 4,7 (95% CI = 2,9-7,6). Wartość OR wynosiła 5,0 (95% CI = 2,9-8,8) dla przypadków, w których zachorowania wystąpiły u krewnych II stopnia od strony matki (siostra matki lub babcia od strony matki). Wartość OR wynosiła 4,1 (95% CI = 2,2-7,9) dla przypadków, gdy w rodzinie zachorowania występowały u krewnych II stopnia od strony ojca (siostra ojca, babcia od strony ojca).

Najwyższe ryzyka obserwowano dla nosicielek mutacji skracających białko, w których rodzinie rak piersi wystąpił u krewnych pierwszego i drugiego stopnia (OR = 7,3, 95% CI 3,2-16,8).

Mutacja missense I157T

Mutację I157T stwierdzono u 535 (7,1%) kobiet z rakiem piersi i 215 z 4346 kontroli (4,9%) (OR = 1,5; 95% CI = 1,2-1,7). Wartość OR wynosiła 1,4 (95% CI = 1,2-1,7) dla przypadków zdiagnozowanych poniżej 51 roku życia i wynosiła 1,6 (95% CI = 1,3-2,0) dla kobiet zdiagnozowanych w wieku powyżej 50 roku życia. Częstość mutacji I157T genu CHEK2 u kobiet z rakiem piersi, w zależności od wywiadu rodzinnego tego nowotworu u krewnych pierwszego i drugiego stopnia przedstawiono w tabeli 3.

PL 226 331 B1

T a b e l a 3 Wartości ryzyka (wyrażone jako OR) związane z mutacją II 57T w zależności od wywiadu rodzinnego.

Przypadki	I157T N (%)	OR (95% CI)
Wszystkie przypadki raka piersi n = 7496	535 (7.1%)	1.5 (1.2-1.7)
Zdiagnozowane w wieku <1 50 n = 5152	349 (6.8%)	1.4 (1.2-1.7)
Zdiagnozowane w wieku > 50 n = 2344	186 (7.9%)	1.6 (1.3-2.0)
Wywiad raka piersi u krewnych I i/lub II stopnia Negatywny n = 6045	420 (6.9%)	1.4 (1.2-1.7)
Pozytywny n = 1451	115 (7.9%)	1.6 (1.3-2.1)
Krewny I stopnia z rakiem piersi n = 746	67 (9%)	1.9 (14-2.5)
Matka z rakiem piersi n = 400	37 (9.2%)	1.9 (1.3-2.8)
Siostra z rakiem piersi n = 334	29 (8.7%)	1.8 (1.2-2.7)
Matka i siostra z rakiem piersi n = 23	2 (8.6%)	1.8 (0.4-7.8)
Krewny II stopnia z rakiem piersi n = 823	59 (7.2%)	1.5 (1.1-2.0)
Od strony ojca n = 378	37 (9.8%)	2.1 (1.4-3.0)
Od strony matki n = 459	23 (5%)	1.0 (0.6-1.6)
Krewny I i II stopnia z rakiem	11 (9.3%)	2.0 (1.05-3.7)
piersi n = 118
Zdrowe kobiety - kontrole n = 4346	215 (4.9%)	ref

Objaśnienie do tabeli 3:

Częstość mutacji II 57T w grupie kontrolnej jest stosowana do obliczenia wartości OR za pomocą testu

Fiszera (Fisher exact test)

Mutacja missense I157T była obecna w 115 z 1451 (7,9%) przypadków rodzinnych (OR = 1,6, 95% CI = 1,3 - 2,1), w 420 z 6045 (6,9%) przypadków sporadycznych (OR = 1,4, 95% CI = 1,2 - 1,7) i u 215 z 4346 osób z grupy kontrolnej (4,9%).

Dla nosicielek mutacji missense I157T, w których rodzinie stwierdzono raka piersi u krewnych I stopnia, wartość OR wynosiła 1,9 (95% CI = 1,4-2,5). Wartości OR były podobne dla kobiet, których matka chorowała na raka piersi (OR =1,9; 95% CI = 1,3-2,8) i dla kobiet, których siostra chorowała na raka piersi (OR =1,8; 95% CI = 1,2-2,7).

Dla nosicieli mutacji missense I157T z dodatnim wywiadem odnośnie raka piersi u krewnych drugiego stopnia, wartość OR wynosiła 1,5 (95% CI = 1,1-2,0) i była wyższa w przypadku, gdy zachorowania występowały u krewnych II stopnia od strony ojca (OR = 2,1, 95% CI = 1,4 do 3,0), niż w przypadku, w którym zachorowania wystąpiły od strony matki (OR = 1,0,95% CI = 0,6 do 1,6).

Najwyższe ryzyka obserwowano dla nosicieli mutacji I157T, w których rodzinie rak piersi wystąpił u krewnych pierwszego i drugiego stopnia (OR = 2,0; 95% CI = 1,05-3,7). W podsumowaniu, niniejsze wyniki dowodzą, że wykrycie mutacji skracającej białko genu CHEK2, u kobiety z dodatnim

PL 226 331 B1 wywiadem rodzinnym identyfikuje wysokie ryzyko zachorowania na raka piersi. Ryzyko jest wówczas zwiększone od 4,1 do 7,3-krotnie w zależności od wywiadu rodzinnego raka piersi u krewnych I i II stopnia, co odpowiada od 25% do 44% ryzyku zachorowania na raka piersi w polskiej populacji.

Stwierdzone ryzyka związane z nosicielstwem mutacji I157T były niższe niż dla zmian skracających białko CHEK2, dlatego badanie tej zmiany nie jest przedmiotem niniejszego wniosku patentowego (jednak dla kompletności danych wyniki dotyczące I157T zostały przedstawione).

Literatura

1. Cybulski C, Huzarski T, Górski B, et al A novel founder CHEK2 mutation is associated with increased prostate cancer risk. Cancer Res. 2004 Apr 15; 64(8): 2677-9.

2. Cybulski C, Górski B, Huzarski T, et al. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene. Am J Hum Genet. 2004 Dec; 75(6): 1131-5.

3. Cybulski C, Wokołorczyk D, Huzarski T, et al. A large germline deletion in the Chek2 kinase gene is associated with an increased risk of prostate cancer. J Med Genet. 2006 Nov; 43(11): 863-6.

4. Cybulski C, Wokołorczyk D, Huzarski T et al. A deletion in CHEK2 of 5,395 bp predisposes to breast cancer in Poland. Breast Cancer Res Treat. 2007; 102: 119-22.

5. Cybulski C, Górski B, Huzarski T, et al. CHEK2-positive breast cancers in young Polish women. Clin Cancer Res. 2006; 12: 4832-5.

6. Suchy J, Cybulski C, Wokołorczyk D, et al. CHEK2 mutations and HNPCC-related colorectal cancer. Int J Cancer. 2010 Jun 15; 126(12): 3005-9.

7. Cybulski C, Wokołorczyk D, Kladny J, et al. Germline CHEK2 mutations and colorectal cancer risk: different effects of a missense and truncating mutations? Eut J Hum Genet 2007 Feb; 15(2):

237-41.

8. Meijers-Heijboer H, van den Ouweland A, Klijn J, et al. Low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2(*) 11 OOdelC in noncarriers of BRC A1 or BRCA2 mutations. Nat Genet 2002; 31:55-9.

9. Weischer M, Bojesen SE, Tybjaerg-Hansen A, et al. Increased Risk of Breast Cancer Associated With CHEK2*11 OOdelC. J Clin Oncol. 2007; 25: 57-63.

10. De Jong MM, van der Graaf WTA, Nolte IM et al. Increased CHEK2 1100delC genotype frequency in unselected breast cancer patients. J Clin Oncol 22; 844s 2004 (suppl).

11. Kleibl Z, Novotny J, Bezdickova D et al. The CHEK2 1 lOdelC mutation rarely contributes to breast cancer development in the Czech Republic. Breast Cancer Res Treat 2005; 90: 165-167.

12. Rashid MU, Jakubowska A, Justenhoven C et al.. German populations with infrequent

CHEK2*1100delC and minor associations with early-onset and familial breast cancer. Eur J

Cancer. 2005; 18: 2896-903.

13. Offit K, Pierce H, KirchoffT et al. Frequency of CHEK2* 1100delC in New York breast cancer cases and controls. BMC Med Genet. 2003; 4:1.

14. CHEK2 Breast Cancer Case-Control Consortium. CHEK2*1100delC and susceptibility to breast cancer: a collaborative analysis involving 10,860 breast cancer cases and 9,065 controls from 10 studies. Am J Hum Genet 2004; 74: 1175-82.

15. Zhang S, Phelan CM, Zhang P et al. Frequency of the CHEK2 11 OOdelC mutation among women with breast cancer: an international study. Cancer Res. 2008; 68: 2154-7.

16. Osorio A, Rodriguez-Lopez R, Diez O et al.. The breast cancer low-penetrance allele 1100delC in the CHEK2 gene is not present in Spanish familial breast cancer population. Int J Cancer. 2004; 108: 54-6.

17. Caligo MA, Agata S, Aceto G et al. The CHEK2 c.1100delC mutation plays an irrelevant role in breast cancer predisposition in Italy. Hum Mutat. 2004; 24: 100-1.

18. Bogdanova N, Enssen-Dubrowinskaja N, Feshchenko S, et al. Association of two mutations in the CHEK2 gene with breast cancer. Int J Cancer. 2005; 116: 263-6.

19. Walsh T, Casadei S, Coats KH, et al. Spectrum of mutations in BRCAI, BRCA2, CHEK2, and TP53 in families at high risk of breast cancer. JAMA 2006; 295: 1379-1388.

20. Saslow D, Bretes C, Burke W et al. American Cancer Society guidelines for breast screening with MRI as an adjunct to mammography. CA: A cancer journal for clinicians. 2007; 57: 75-89.

21. de Bock GH, Schutte M, Krol-Warmerdam EM, et al. Tumour characteristics and prognosis of breast cancer patients carrying the germline CHEK2* 1100delC variant. J Med Genet 2004; 41: 731-5.

PL 226 331 B1

22. Schmidt MK, Tollenaar RAEM, de Kemp, SR et al. Breast cancer survival and tumor characteristics in premenopausal women carrying the CHEK2*11 OOdelC germline mutation. J Clin Oncol 2007; 25: 64-69.

23. de Bock GH, Mounts MJ, Schutte M et al. Association between the CHEK2* 1100delC germ line mutation and estrogen receptor status, Int J Gynecol Cancer. 2006; 16 Suppl 2:552-5.

24. Cybulski C, Huzarski T, Byrski T et al. Estrogen receptor status in CHEK2-positive breast cancers: implications for chemoprevention.Clin Genet. 2009 75: 72-8.

25. Kilpivaara O, Bartkova J, Eerola J et al. Correlation of CHEK2 protein expression and 1100delC mutation status with tumor characteristics among unselected breast cancer patients. Int J Cancer. 2005 113: 575-80.

26. Górski B, Jakubowska A, Huzarski T, et al. A high proportion of founder BRCAI mutations in Polish breast cancer families. Int J Cancer. 2004 Jul 10; 110(5): 683-6.

27. Lubiński J, Górski B, Huzarski T, et al. BRCAI-positive breast cancers in young women from Poland. Breast Cancer Res Treat. 2006 Sep; 99(1): 71-6.

Claims (3)

1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu CHEK2, przy czym wykrycie takiej zmiany u pacjentki w której rodzime występował rak piersi u co najmniej jednego krewnego I i/lub II stopnia oznacza ryzyko raka piersi wynoszące powyżej 25%, przy czym bada się obecność co najmniej jednej mutacji skracających-białko CHEK2 wybranej spośród: IVS2+1G>A, del5395, 1100delC, natomiast pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), innych metod pośredniego lub metod bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.

3. Zastosowanie mutacji skracającej białko CHEK2 wybranej spośród: IVS2+1G>A, del5395, 1100delC do wykrywania ryzyka raka piersi wynoszącego powyżej 25% u pacjentki, w której rodzinie występował rak piersi u co najmniej jednego krewnego I i/lub II stopnia, przy czym pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego, a wykrywanie obejmuje prowadzone in vitro badanie obecności mutacji w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki.