TW201311908A

TW201311908A - 診斷犬之青光眼的方法及套組

Info

Publication number: TW201311908A
Application number: TW101124705A
Authority: TW
Inventors: Masaki Imayasu; Kissaou TCHEDRE; Nobuyuki Kanemaki; Masahiro Sakaguchi; Shinpei Kawarai
Original assignee: Menicon Co Ltd
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2013-03-16
Also published as: WO2013008709A1; JPWO2013008709A1; JP6053681B2; US20140141432A1

Abstract

本發明係提供犬青光眼疾病感受性基因及其之利用方法。以青光眼犬及健康犬為對象，解析．比較一鹼基多型性，從發現差異之多型部位中，發現一鹼基多型國際編號rs22018513及rs22018514之多型部位在診斷上有效。

Description

診斷犬之青光眼的方法及套組

本發明係關於診斷犬之青光眼的方法及套組。

犬之青光眼，係流入角膜與水晶體之間之房水之流動發生障礙，引起眼壓上升，壓迫網膜或視神經，而導致視野狹窄等視覺障礙之疾病。

若形成高眼壓，則會引起眼睛疲勞或頭痛、暈眩、噁心等，然而對於犬而言，此非自覺症狀，又，即使感覺此種不適，也無法向飼主投訴。即使視野開始變狹窄，仍照常跑來跑去，不會見到行動改變。因此發現晚，症狀進展後才被帶到動物醫院的情況很多。

就青光眼而言，雖無預防方法，然而若能早期發現，則有抑制疾病進展的方法。例如，點眼藥(縮瞳藥、β-腎上腺素作用遮斷藥、前列腺素相關藥等)、內服藥(浸透壓利尿藥、碳酸脫水酵素阻礙藥等)之投與；用於減少眼房水產生之手術；用於使眼房水流出増加之手術等。

迄今為止，犬青光眼之診斷係藉由眼壓測定、前房角鏡檢査法(gonioscopy)、眼底檢査而進行。

然而，就此等方法而言，尚稱不上可以早期發現青光眼，因而尋求能夠更早期、更確實診斷之方法。

另一方面，就有關人類青光眼而言，正進行疾病感受性基因之探索，例如，水木氏等以日本人群組(患者：305個檢體，健康者：355個檢體)完成使用GeneChip 500k數據集(Array Set)之GWAS，鑑定出與疾病顯著相關之2基因(SRBD1及ELOVL5)(非專利文獻1)。

先前技術文獻非專利文獻

非專利文獻1 Ophthalmology 2010 Jul; 117 (7): 1331-8.e5. Epub 2010 Apr 3.

[發明之概要]

本發明之目的為發現對犬之青光眼的診斷有效之疾病感受性基因，並提供其利用方法。

本發明人等，以青光眼犬集團及健康犬集團作為對象進行SNP解析時，發現對青光眼之診斷特別有效之2個SNP。

本發明係基於此等認識而完成。

本發明之要旨，如以下所示。

(1)一種犬青光眼之檢査方法，其包含鑑定選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群中之至少1個多型部位的鹼基。

(2)一種用於檢查犬青光眼之試藥，其包含選自下述(a)及(b)之成分所組成之族群中之至少1種成分：(a)引子，其係可將包含至少1個下述多型部位之鹼基的區域擴増之引子，該多型部位之鹼基係選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群；(b)探針，其係在包含至少1個下述多型部位之鹼基的區域中可進行雜交之探針，該多型部位之鹼基係選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群。

(3)如(2)記載之試藥，其中該探針係固定於固相。

(4)一種檢查犬青光眼之套組，其包含如(2)或(3)記載之試藥。

依照本發明，可更早期，且更正確地診斷犬之青光眼。就已經發病之個體而言，能夠確定診斷，進行積極的治療。又，就未發病之個體而言，發病之預測成為可能，可勸導經常進行檢査，以早期發現。

本說明書包含為本申請案優先權之基礎之日本專利申請案，專利申請案2011-152745之說明書及/或圖式中記載之內容。

[實施發明所用之態樣]

以下，針對本發明之實施態樣更詳細地說明。

本發明提供犬青光眼之檢査方法，其包含鑑定選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群中之至少1個多型部位的鹼基。序列識別號1之鹼基序列係與序列識別號16之鹼基序列互補之序列。一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位之鹼基係序列識別號16之核苷酸序列中之第451號鹼基，該序列識別號16之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中；一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位之鹼基係序列識別號16之核苷酸序列中之第447號鹼基，該序列識別號16之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中。

與一鹼基多型國際編號rs22018513或rs22018514之多型為連鎖不平衡之多型，可為一鹼基多型國際編號rs22018513或rs22018514之LD區塊(LD block)內之多型。與一鹼基多型國際編號rs22018513或rs22018514之多型為連鎖不平衡之多型，可能為在包含犬第10染色體之SRBD1的區域內，p值(青光眼個體與健康個體間之有意義差之指標)小於0.05之其他多型。

若SNP間之D’大，則被認為係連鎖不平衡(Barrett JC,Fry B,Maller J,Daly MJ.Haploview：analysis and visualization of LD and haplotype maps.Bioinformatics.2005；21(2)：263-265.；Gabriel SB,Schaffner SF,Nguyen H,et al.The structure of haplotype blocks in the human genome.Science.2002；296(5576)：2225-2229.)。因此，與一鹼基多型國際編號rs22018513或rs22018514之多型為連鎖不平衡之多型，可為例如此等SNP間之D’較大之多型。

LD區塊可使用Haploview軟體(Barrett JC,Fry B,Maller J,Daly MJ.Haploview：analysis and visualization of LD and haplotype maps.Bioinformatics.2005；21(2)：263-265.)，依照Gabriel氏等之方法(Gabriel SB,Schaffner SF,Nguyen H,et al.The structure of haplotype blocks in the human genome.Science.2002；296(5576)：2225-2229.)來決定。

本說明書中，一鹼基多型(SNP)係以NCBI之SNP資料庫之dbSNP中之SNP ID參考編號即rs編號來表示。又，鹼基之位置係依據NCBI之基因組資料庫build2.1。

在本說明書中，「青光眼之檢査」在概念上包含用於判定受檢個體罹患青光眼之可能性高或低之檢査，以及在受檢個體已經罹換青光眼之情況下，用於進行其之確定診斷之檢査。

rs22018513為犬第10染色體之第51049604號之鹼基中腺嘌呤(A)/鳥嘌呤(G)之多型，在該部位之鹼基為G之情況，可判定罹患青光眼之可能性高或正罹患青光眼。

rs22018514為犬第10染色體之第51049600號之鹼基中胞嘧啶(C)/鳥嘌呤(G)之多型，在該部位之鹼基為G之情況，可判定罹患青光眼之可能性高或正罹患青光眼。藉由將C置換為G，編碼之胺基酸由白胺酸置換為纈胺酸。

鑑定之SNP，可為一種，亦可將複數種組合。又，可解析基因之正意鏈(sense)，亦可解析反意鏈(antisense)。

又，多型之同型接合性或異型接合性有時亦可成為診斷之指標。

rs22018513及rs22018514係存在於基因之外顯子(exon)中，rs22018514雖係伴隨胺基酸置換之變異，但是與此等多型呈連鎖不平衡狀態之多型可存在於基因之外顯子中、控制基因表現之區域(例如，啟動子區域、增強子區域等)中、基因之內顯子(intron)中、或與此等基因呈連鎖不平衡之其前後之區域。就多型之種類而言，雖可列舉如：一鹼基多型、一至數十鹼基(有時為數千鹼基)置換、缺失、插入、轉移或逆位之多型等，但非特別限於此等。

本發明之檢査方法中，多型部位之鹼基之鑑定(亦即，鹼基種類之決定)可依照公知之一鹼基多型解析方法來進行。就一鹼基多型解析方法而言，可例示序列解析、PCR、PCR-SSCP、雜交、RFLP法、Taqman-PCR法、入侵子(invader)法、cycleave-PCR法、HRM法等，但不限於此等。

為了鑑定多型部位之鹼基，亦可從受檢個體之生物檢體中萃取基因組DNA。生物檢體例如為受檢個體之血液、皮膚、口腔黏膜、藉由手術所採取或切除之組織或細胞、於檢査等之目的中採取的體液(唾液、淋巴液、呼吸道黏膜、精液、汗、尿等)等。就生物檢體而言，以從四肢之任何一肢或頭部等之靜脈採血所得之全血為較佳。可使用市售之DNA萃取套組從生物檢體萃取基因組DNA。繼而，視需要將含有多型部位之DNA單離。該DNA之單離可藉由PCR等來進行，在該PCR中，使用可與含有多型部位之DNA雜交之引子，並以基因組DNA或RNA作為模板。

為青光眼檢査之對象的犬種，可列舉容易罹患青光眼之犬種，例如西巴犬、美國可卡獵犬(American Coker Spaniel)、吉娃娃、臘腸犬(Dachshund)、拉布拉多尋回犬(Labrador Retriever)、馬爾濟斯犬(Maltese dog)、迷你杜賓犬(Miniature Pinscher)、巴哥犬(Pug)、西施犬(Shih Tzu)、柯基犬(Corgi)等，然而並不限於此等。

又，本發明提供一種用於檢查犬青光眼之試藥，其包含選自下述(a)及(b)之成分所組成之族群中之至少1種成分：(a)可將包含至少1個下述多型部位之鹼基的區域擴増之引子，該多型部位之鹼基係選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群；(b)在包含至少1個下述多型部位之鹼基的區域中可進行雜交之探針，該多型部位之鹼基係選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之 SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群。

一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位係如上述。

再者，本發明又提供含有上述試藥之犬青光眼的檢査套組。

為本發明之試藥之成分之引子及探針，只要為具有至少15個核苷酸鏈長之寡核苷酸即可。在使用該寡核苷酸作為引子之情況，其長度通常為15bp~100bp，較佳為17bp~30bp。引子，只要為能將包含上述多型部位之DNA之至少一部分增幅者即可，無特別限制。引子所可增幅之DNA之長度通常為15~1000bp，較佳為20~500bp，更佳為20~200bp。又，使用該寡核苷酸作為探針之情況，其之長度通常為5bp~200bp，較佳為7bp~100bp，更佳為7bp~50bp。探針只要為能與包含上述多型部位之DNA雜交者即可，無特別限制。

在本發明中，可增幅包含多型部位之區域的引子，只要為能以包含多型部位之DNA作為模板，開始進行朝向多型部位之互補鏈合成者即可。

就為本發明之試藥之成分之引子而言，可列舉如以下之包含正向引子與反向引子之引子對。

正向引子：5’-GCTATTGCTGATGTTGATTTG-3’(序列識別號2)

反向引子：5’-TGCAGTGCTGGCCCTGTTGGA-3’(序列識別號3)

序列識別號2之鹼基序列為與序列識別號1之核苷酸序列中第325號~第345號之鹼基序列相同之序列。

序列識別號3之鹼基序列為與序列識別號1之核苷酸序列中第466號~第486號之鹼基序列互補之序列。

正向引子：5’-TAAAGTGGATACCGTGAAGAC-3’(序列識別號12)

反向引子：5’-GCATTTGCTGGAAACCT-3’(序列識別號13)

序列識別號12之鹼基序列為與序列識別號1之核苷酸序列中第360號~第380號之鹼基序列相同之序列。

序列識別號13之鹼基序列為與序列識別號1之核苷酸序列中第616號~第632號之鹼基序列互補之序列。

正向引子：5’-ACTCTGTGGCTATTGCTGATG-3’(序列識別號14)

反向引子：5’-GGGACTGACCAAATGTGAAG-3’(序列識別號15)

序列識別號14之鹼基序列為與序列識別號1之核苷酸序列中第317號~第337號之鹼基序列相同之序列。

序列識別號15之鹼基序列為與序列識別號1之核苷酸序列中第549號~第568號之鹼基序列互補之序列。

引子雖具有可在包含多型部位之區域中進行雜交之鹼基序列，但是亦可為與「從包含與序列識別號2~7之鹼基序列相同或互補之多型部位的區域各錯開數個鹼基之區域」相同或互補的序列。

引子中，除了與包含多型部位之區域之鹼基序列相同或互補之鹼基序列外，可附加任意之鹼基序列。例如，關於利用IIs型之限制酵素的多型解析方法所使用之引子，可利用附加有IIs型限制酵素之識別序列的引子。再者，引子可經修飾。例如，可使用藉由如螢光物質、生物素(biotin)或地高辛(digoxin)之結合親和性物質來標識之引子。

在本發明中，可在包含多型部位之區域中進行雜交之探針，只要可與具有含多型部位之區域之鹼基序列的多核苷酸雜交者即可；以可與具有含多型部位之區域之鹼基序列的DNA特異性地雜交者為較佳。其中「特異性地雜交」意指在通常之雜交條件下，較佳在嚴苛之雜交條件下(例如，Sambrook氏等，Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA，第2版1989中所記載之條件)，不會與具有含多型部位之區域之鹼基序列的DNA以外之DNA產生有意義的交叉雜交。更具體而言，以在探針之鹼基序列中包含多型部位的探針為較佳。或者，有時根據多型部位中之鹼基的解析方法，以探針之末端對應於鄰接多型部位之鹼基之方式來進行設計。因此，探針本身之鹼基序列雖然不包含多型部位，但包含與多型部位鄰接之區域互補之鹼基序列的探針，亦顯示在本發明中可作為為適宜的探針。

探針，與引子同樣，容許鹼基序列之改變、鹼基序列之附加、或修飾。例如，Invader法所使用之探針可附加與構成自由擺動端(flap)之基因組無關之鹼基序列。此種探針，只要在包含多型部位之區域中可進行雜交，將包含於本發明之探針之中。構成本發明探針之鹼基序列，可根據基因組中本發明之多型部位周邊DNA區域之鹼基序列，並視所用之解析方法來設計。

若為本技術人士，可根據有關包含多型部位之周邊DNA區域的鹼基序列資料，設計適合解析手法之引子及探針。構成引子及探針之鹼基序列，除了與基因組之鹼基序列完全互補之鹼基序列之外，亦可適宜改變。

引子及探針，可根據構成其之鹼基序列，藉由任意之方法合成。根據所賦予之鹼基序列，合成具有該鹼基序列之寡核苷酸的手法為公知。再者，在寡核苷酸之合成中，亦可利用經螢光色素、生物素等修飾之核苷酸衍生物，而將任意之修飾導入寡核苷酸中。再者，將螢光色素等結合於合成之寡核苷酸上之方法亦為公知。

探針亦可固定於固相(DNA陣列)上。DNA陣列係使樣本DNA(或RNA)與在相同平面上所配置之多個探針雜交，並掃描該平面，以檢測對各探針之可雜交性。由於可同時觀察對於多個探針之反應，例如，在同時解析多個多型部位時，DNA陣列甚為有用。就核苷酸之固定(陣列)方法而言，例如以Affymetrix公司所開發之寡核苷酸為基本之陣列。寡核苷酸之陣列中，寡核苷酸通常係在原位(in situ)合成。例如，已知有藉由微影術(lithography)方式(Affymetrix公司)、噴墨(inkjet)方式(Agilent公司)、珠粒陣列方式(Illumina公司)等之寡核苷酸之原位合成法。

寡核苷酸係由與包含待測多型部位之區域互補之鹼基序列所構成。結合於基板之核苷酸探針之長度，在將寡核苷酸固定之情況，通常為10~100bp，較佳為10~50bp，更佳為15~25bp。

藉由DNA陣列法檢測SNP用之檢體，係以從受檢個體所採取之生物檢體為基礎，並可藉由本技術人士周知之方法來調製。生物檢體無特別限定。例如可從由受檢個體之血液、皮膚、口腔黏膜等之組織或細胞、涙、唾液、尿、糞便或毛髪萃取出之基因組DNA，調製DNA檢體。使用用於增幅包含待判定多型部位之區域的引子，將基因組DNA之特定區域增幅。此時，藉由多重PCR(multiplex PCR)法，可將複數個區域同時增幅。多重PCR法意指在相同反應液中使用複數組引子對之PCR法。要解析複數個多型部位時，多重PCR法甚為有用。

一般而言在DNA陣列法中，在藉由PCR法將DNA檢體增幅之同時，將增幅產物標識。在增幅產物之標識方面，可利用附加標識之引子。例如，首先藉由PCR法將基因組DNA增幅，在該PCR法中使用對於包含多型部位之區域具特異性之引子對。繼而，藉由使用經生物素標記之引子的標記PCR法，合成經生物素標記之DNA。使如此合成之經生物素標記之DNA與晶片上之寡核苷酸探針雜交。雜交之反應液及反應條件可視固定於固相之核苷酸探針之長度或反應溫度等條件而適宜調整。本技術人士可設計適當之雜交條件。為了檢測雜交之DNA，可添加經螢光色素標識之抗生物素蛋白 (avidin)。將陣列用掃描器解析，以螢光作為指標來確認有無雜交。

現示範使用DNA陣列法實施本發明之檢査方法之順序之一例，準備固定有從受檢個體調製之包含多型部位之DNA及核苷酸探針之固相後，使該DNA與該固相接觸。繼而，藉由檢測與固定於固相之核苷酸探針雜交之DNA，而決定多型部位之鹼基種類。

在本說明書中，「固相」意指可將核苷酸固定之材料。固相只要為可將核苷酸固定者即可，無特別限制，具體而言，可例示包含微量盤孔(microplate well)、塑膠珠粒、磁性粒子、基板等之固相等。就固相而言，可適合地使用一般DNA陣列技術中所使用之基板。本說明書中「基板」意指可將核苷酸固定之板狀材料。又，本發明中核苷酸包含寡核苷酸及多核苷酸。

除上述之方法以外，為了檢測特定部位之鹼基，可利用等位基因(allele)特異性寡核苷酸(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)雜交法。等位基因特異性寡核苷酸(ASO)係由可與存在有待檢測多型部位之區域雜交的鹼基序列所構成。使ASO與檢體DNA雜交時，若因存在多型而在多型部位產生錯配(mismatched)時，雜交株形成之效率降低。錯配可藉由南方墨點(Southern blot)法，或利用「將特殊螢光試藥嵌入(intercalation)雜交株之缺口而消光之性質」之方法等來檢測。又，藉由核糖核酸酶A錯配切斷法，亦可檢測出錯配。

在本發明之試藥及套組中，可視鹼基之鑑定方法而包含各種酵素、酵素基質及緩衝液等。就酵素而言，可列舉DNA聚合酶、DNA連接酶、或IIs限制酵素等被例示作為上述鹼基鑑定方法之各種解析方法中所必需之酵素。關於緩衝液，可適當地選擇適於維持此等解析所用之酵素之活性的緩衝液。再者，就酵素受質而言，可使用例如，互補鏈合成用之基質等。

再者，本發明之試藥及套組中，可添附多型部位中之鹼基為明確的對照組。就對照組而言，可使用多型部位之鹼基種類預先即已明確之基因組DNA、或基因組DNA之片段。基因組DNA，可添附從細胞中萃取出者作為對照組；或者，可添附細胞或細胞之分劃部分作為對照組，而由使用者從其將基因組DNA萃取出。若使用細胞作為對照組，由對照組之結果可以證明基因組DNA之萃取操作係被正確地進行。或者，亦可使用由包含多型部位之鹼基序列所構成之DNA作為對照組。具體而言，可使用包含來自多型部位中鹼基種類已被確定之基因組之DNA的YAC轉染載體(vector)或BAC轉染載體，作為對照組。或者，亦可使用只將相當於多型部位之數十至數百個bp切出並插入載體者，作為對照組。

[實施例]

以下，根據實施例詳細地說明本發明，然而本發明並不限定於此等實施例。

[實施例1] 1.犬青光眼之診斷及DNA之純化

1)對於來到麻布大學附屬動物醫院之西巴犬(純系)的兩眼，點眼倍諾喜(benoxil)，施行局部麻醉。

2)以Tonopen眼壓計測定兩眼之眼壓，將眼壓24mmHg以上之個體判定為青光眼，小於24mmHg之個體判定為健康。(47隻罹患青光眼，34隻健康)

3)從頸靜脈採取1cc之血液，藉由DNA全血套組．旋轉法(FUJI FILM公司)純化DNA。

4)藉由GeneQuant Pro(GE Health Science公司)測定DNA之濃度及純度。

2. DNA鹼基序列之決定

1)使用TaKaRa Ex Taq(Takara Bio公司)實施PCR。PCR之條件，如以下所示。

<試藥>

<增幅條件>

(94℃ 5分鐘)1循環

(98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘)40循環

(72℃ 7分鐘)1循環

2)將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，藉由溴化乙錠(ethidium bromide)染色來確認PCR產物係以單一譜帶(single band)被檢測出，回收於1.5mL之試管中。

3)添加50μL之TE緩衝液，於-80℃凍結3小時以上。

4)將樣本溶解，藉由Qiagen Dye Ex 2.0旋轉套組(QIAGEN公司)純化樣本DNA。

5)依照以下之條件實施循環定序(sequencing)。

<試藥>

<定序條件>

(95℃ 2分鐘)1循環

(94℃ 1分鐘；50℃ 30秒；72℃ 4分鐘)30循環

(72℃ 7分鐘)

6)以Qiagen Dye Ex 2.0旋轉套組再度純化樣本DNA，並乾燥。

7)添加20μL之High Dye Mix(Life Technologies公司)，於90℃處理3分鐘後，冰冷5分鐘。

8)將樣本移至定序試管，藉由ABI 310定序機(ABI 310 Sequencer，Life Technologies公司)解析鹼基序列。

9)依照犬SRBD1基因之2處SNP(rs22018513及rs22018514)之鹼基序列，如以下方式判定樣本之基因型(無風險同型、異型、風險同型)。

將47隻青光眼西巴犬及34隻健康西巴犬之基因多型解析結果示於表2。

rs22018513之多型部位中，青光眼群之風險等位基因(risk allele)頻率為78.7%，健康群之風險等位基因頻率為55.9%。將兩群比較時，在保持風險等位基因之情況，青光眼之發病風險成為2.92倍，依照χ自乘檢定，認定為有意義差(P<0.01)。

rs22018514之多型部位中，青光眼群之風險等位基因(risk allele)頻率為39.4%，健康群之風險等位基因頻率為17.6%。將兩群比較時，在保持風險等位基因之情況，青光眼之發病風險成為3.03倍，依照χ自乘檢定，認定為有意義差(P<0.01)。

從以上之結果，推測在rs22018513及rs22018514二多型部位皆保持風險等位基因之情況，青光眼發病風險亦達到約9倍。

又，關於22隻青光眼西施犬及28隻健康西施犬之基因多型解析結果，亦示於表2中。

rs22018513之多型部位中，青光眼群之風險等位基因(risk allele)頻率為97.7%，健康群之風險等位基因頻率為85.7%。將兩群比較時，在保持風險等位基因之情況，青光眼之發病風險成為7.17倍，依照χ自乘檢定，認定為有意義差(P<0.05)。

關於其他之基因變異，亦以同樣方式檢測。不過，使用下列者作為正向引子及反向引子。

．rs24048794檢測用

正向引子：5’-CTCACGGCTCCCAGCTCACGG-3’(序列識別號4)

反向引子：5’-TGTGTGTGTGCTCGGGTGTAG-3’(序列識別號5)

．rs24048796檢測用

正向引子：5’-CTCACGGCTCCCAGCTCACGG-3’(序列識別號4)

反向引子：5’-TGTGTGTGTGCTCGGGTGTAG-3’(序列識別號5)

．rs24048798檢測用

正向引子：5’-CTCACGGCTCCCAGCTCACGG-3’(序列識別號4)

反向引子：5’-TGTGTGTGTGCTCGGGTGTAG-3’(序列識別號5)

．rs8571991檢測用

正向引子：5’-CCATTACGTATAATCGCTTCTTTT-3’(序列識別號6)

反向引子：5’-CGCACACAATGGTTATCCTG-3’(序列識別號7)

．rs8643563檢測用

正向引子：5’-AATTGTATGGCTGGGACCAA-3’(序列識別號8)

反向引子：5’-ACCACCAGAGGACACGGATA-3’(序列識別號9)

．rs22202438檢測用

正向引子：5’-CATGCTGAACATCTGGTGGT-3’(序列識別號10)

反向引子：5’-GCTGGTCTGGATGATTGTCA-3’(序列識別號11)

將10隻青光眼西巴犬及10隻健康西巴犬之基因多型解析結果示於表3。

關於OPTC1基因，在rs24048794之多型部位中青光眼群及健康群之最小等位基因(minor allele)頻率皆為10%，認定無統計學上之有意義差。在rs24048796之多型部位中青光眼群及健康群之最小等位基因頻率皆為0%，認定無統計學上之有意義差。在rs24048798之多型部位中青光眼群及健康群之最小等位基因頻率皆為0%，認定無統計學上之有意義差。

關於CYP1B1基因，在rs8571991之多型部位中青光眼群及健康群之最小等位基因頻率皆為0%，認定無統計學上之有意義差。

關於ELOVL5基因，rs8643563之多型部位中青光眼群及健康群之最小等位基因頻率皆為0%，認定無統計學上之有意義差。rs22202438之多型部位中青光眼群及健康群之最小等位基因頻率皆為45%，認定無統計學上之有意義差。

從以上之結果，顯示rs24048794、rs24048796、rs24048798、rs8571991、rs8643563、rs22202438之多型部位與青光眼發病風險之間無相關性。

在本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案均以其原樣納入本說明書中，作為參考。

[產業上之可利用性]

本發明可應用於獸醫學、診斷等。

[序列表之非關鍵詞文字(sequence listing free text)]

<序列識別號1>

序列識別號1表示於第450號(r=A/G)包含rs22018513之多型部位，於第454號(r=C/G)包含rs22018514之多型部位的900鹼基長鹼基序列。

<序列識別號2>

序列識別號2表示用於檢測rs22018513及rs22018514之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號3>

序列識別號3表示用於檢測rs22018513及rs22018514之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號4>

序列識別號4表示用於檢測rs24048794、rs24048796及rs24048798之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號5>

序列識別號5表示用於檢測rs24048794、rs24048796及rs24048798之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號6>

序列識別號6表示用於檢測rs8571991之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號7>

序列識別號7表示用於檢測rs8571991之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號8>

序列識別號8表示用於檢測rs8643563之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號9>

序列識別號9表示用於檢測rs8643563之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號10>

序列識別號10表示用於檢測rs22202438之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號11>

序列識別號11表示用於檢測rs22202438之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號12>

序列識別號12表示用於檢測rs22018513及rs22018514之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號13>

序列識別號13表示用於檢測rs22018513及rs22018514之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號14>

序列識別號14表示用於檢測rs22018513及rs22018514之多型部位的正向引子之鹼基序列。

<序列識別號15>

序列識別號15表示用於檢測rs22018513及rs22018514之多型部位的反向引子之鹼基序列。

<序列識別號16>

序列識別號16表示與序列識別號1之鹼基序列互補之序列。表示於第451號(y=T/C)包含rs22018513之多型部位，於第447號(s=G/C)包含rs22018514之多型部位的900鹼基長鹼基序列。

<110> 目立康股份有限公司學校法人麻布獸醫學園

<120> 診斷犬之青光眼的方法及套組

<130> FP-166PCT

<150> JP P2011-152745

<151> 2011-07-11

<160> 16

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 900

<212> DNA

<213> 犬科

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引子

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<212> DNA

<213> 人造

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<213> 人造

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<213> 人造

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<223> 引子

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<213> 人造

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<212> DNA

<213> 人造

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<223> 引子

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<211> 900

<212> DNA

<213> 犬科

<400> 16

Claims

一種犬青光眼之檢査方法，其包含鑑定選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群中之至少1個多型部位的鹼基。
一種用於檢查犬青光眼之試藥，其包含選自下述(a)及(b)之成分所組成之族群中之至少1種成分：(a)引子，可將包含至少1個下述多型部位之鹼基的區域擴増之引子，該多型部位之鹼基係選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群； (b)探針，該探針係在包含至少1個下述多型部位之鹼基的區域中可進行雜交之探針，該多型部位之鹼基係選自一鹼基多型國際編號rs22018513之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第450號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、一鹼基多型國際編號rs22018514之多型部位的鹼基(序列識別號1之核苷酸序列中之第454號鹼基，該序列識別號1之核苷酸序列係存在於包含犬第10染色體之SRBD1的區域中)、以及呈與此等多型連鎖不平衡之狀態之多型部位的鹼基所組成之族群。
如申請專利範圍第2項之試藥，其中該探針係固定於固相。
一種檢查犬青光眼之套組，其包含如申請專利範圍第2或3項之試藥。