JP4781169B2 - 再狭窄の発症リスクを判定する方法 - Google Patents
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Description
再狭窄の検査方法としては次の(1)〜(3)のような検査方法があるが、それぞれ問題点を有している。
(1)冠動脈造影検査: 通常、PCI後に2回行って再狭窄を検査するが、侵襲的検査であり、特に糖尿病(DM)患者では腎症による腎機能障害が多いため、造影剤の腎毒性が問題となる。
(2)運動負荷心電図検査: 再狭窄の検出感度が低く、これだけでは十分ではない。また、本検査は運動負荷によって狭心症などの心事故を引き起こす危険があり、高齢者、および運動障害者等ではこの検査はできない。
(3)心臓CT(マルチスライスCT)検査: 近年、普及してきたものの、ステント挿入部位における再狭窄の観察は困難である。
いずれの検査も患者への負担が大きく、また再狭窄形成後の状態を確認するためのもので、再狭窄の発症リスクを判定することはできない。
再狭窄の発症リスクを判定する方法としては、冠動脈再建術治療施行後の動脈壁損傷部位における単球/マクロファージの異常蓄積や活性化につながる因子を測定する方法(特許文献1)や、冠動脈再建術治療施行後の体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素を測定する方法(特許文献2)が報告されているものの、これらも冠動脈再建術治療施行後に測定するものであり、再狭窄発症リスクの予測あるいは早期判定という観点では実用的でなかった。
(a)被験者由来の生体サンプル中の変性低比重リポ蛋白(変性LDL)を測定する工程と、
(b)当該変性LDLの測定値を予め定めた基準値と比較する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供するものである。
一方、変性LDL値が予め定めた基準値より高値の場合は、積極的に検査を行うことで再狭窄の見落としを防ぐことができる。また食事療法、再狭窄予防のエビデンスが整いつつあるスタチンなどによる薬剤治療を積極的に行うことで、再狭窄を防止することができる可能性がある。
変性LDLとしては酸化LDLが好ましい。酸化LDLとしては、マロンジアルデヒド修飾LDL(MDA-LDL)、酸化リン脂質を含有する酸化LDLや前記酸化LDLと蛋白との複合体が挙げられる。これらのうち、さらに好ましいのはマロンジアルデヒド修飾LDL(MDA-LDL)である。
ここで、基準値は、例えば予め変性LDL値を確認した複数の被験者について、再狭窄を発症したか否かの追跡調査をした結果を、統計学的解析手法を用いて解析することにより設定することができる。例えば該基準値は、PCI治療前の変性LDL値、あるいはPCI治療後から一定期間経過後の変性LDL値のいずれの場合においても、それぞれ同様の統計学的解析手法を用いて設定することができる。被験者のPCI治療前の変性LDL値が、PCI治療前の変性LDL値から定めた基準値より高くなっている場合、及び/またはPCI治療後の変性LDL値が、PCI治療後の変性LDL値から定めた基準値より高くなっている場合には、再狭窄の発症リスクがあると判定できるが、早期に再狭窄の発症リスクを判定するという観点からは、PCI治療前の変性LDL値により再狭窄の発症リスクを判定することが好ましい。
一般的には冠動脈再建術の施術後3〜6ヶ月後に再狭窄が形成されるため、3ヶ月後と6ヶ月後に確認造影検査を行い再狭窄の有無を診断している。それ故、PCI治療前から確認造影を行う治療後6ヶ月後まで変性LDL値をモニターすることにより、より高い精度で再狭窄の発症リスクを判定できる。
このようにして、PCI施行患者の再狭窄の発症リスクが、高精度で判定できるので、PCI治療後の治療プロトコルの決定が容易になる。すなわち再狭窄の発症リスクが高い患者に対しては、1.食事療法など、生活習慣改善指導をより積極的に行う、2.再狭窄予防のエビデンスが整いつつあるスタチン系薬剤の投与を行う、などにより、再狭窄を防止することができる。また、適宜冠動脈造影検査などを行うことにより、無症候性の再狭窄を見逃す危険を低下させることができる。
実施例1(MDA-LDLの基準値の設定-1)
CADに対するPCI治療のうち、ステント植え込み術を行ったDM患者についてPCI治療直前に採血してMDA-LDLを測定した。(計44例)尚、MDA-LDL測定のための血清検体の採取、保存、および測定操作は次の如く実施した。
(1)抗体結合プレート:抗MDA-LDLマウスモノクローナル抗体(ML25)結合ウエル
(2)酵素標識抗体液 :β-ガラクトシダーゼ標識抗アポBマウスモノクローナル抗体2.86μg/mL
(3)洗浄液 :20mMリン酸緩衝液(pH7.2)
(4)基質液 :10 mM o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド
(5)停止液 :200mM炭酸ナトリウム
(6)検体希釈液 :25mM HEPES緩衝液(pH7.8)
(7)標準液 :MDA-LDL濃度既知血清*
*:ヒトLDLを人工的にMDA修飾してMDA-LDLを調製して、そのタンパク濃度を求め、上記測定系において、該調製したMDA-LDL 1mg/mLと同じ吸光度を示す血清中のMDA-LDL濃度を1U/Lと定義し、値付けを行った(文献 Kotani K. et al., Biochim Biophys Acta, 1994, 1215, 121-5)。
<試料の調製方法>
検体は新鮮な血清を用い、最終希釈率2000倍になるように検体を検体希釈液で希釈し、15〜30℃で1時間静置し、試料とした。具体的には、検体20μLに検体希釈液980μLを加え、50倍希釈した液20μLに検体希釈液780μLを加え、更に40倍希釈した。この液を15〜30℃で1時間静置後、試料とした。
(1)全ての試薬を室温(15〜30℃)に戻した。
(2)抗体結合プレートの各ウエルに洗浄液を300μLずつ分注後、除去。この操作を3回行い、ウエルを洗浄した。ウェル内が乾燥する前に次の操作を行った。
(3)各ウェルに、試料または標準液を各100μL分注し、15〜30℃で2時間静置した。尚、試料と標準液は二重測定を行った。
(4)ウェル内の液を除去し、各ウェルに洗浄液を300μLずつ分注後、(2)と同様に3回洗浄した。
(5)洗浄液を除去し、各ウエルに酵素標識抗体液を100μL分注し、15〜30℃で1時間静置した。
(6)ウェル内の液を除去し、各ウェルに洗浄液を300μLずつ分注後、 (2)と同様に3回洗浄した。
(7)洗浄液を除去し、各ウェルに基質液を各100μL分注し、15〜30℃で2時間静置した。
(8)さらに各ウェルに停止液を100μL分注し、反応を停止した。
マイクロプレートリーダーで、試薬ブランクを対照に主波長415nm 副波長600nmにおける吸光度を測定した。なお、試薬ブランクには、試料の代わりに検体希釈液を用いて同様に操作した液を用いた。
(1)標準液について縦軸に吸光度、横軸にMDA-LDL濃度をプロットし、検量線を作成した。
(2)試料の吸光度に対応する濃度を検量線より読み取り、MDA-LDL濃度を求めた。
また、総コレステロール(TC)、LDLコレステロール(LDL-C)、HDLコレステロール(HDL-C)、および中性脂肪(TG)は、酵素法を測定原理とする体外診断用医薬品を用いて測定した。
再狭窄の判定は、冠動脈造影検査により標的病変に50%以上の狭窄が認められた場合を再狭窄とした。
PCI治療前にMDA-LDLを測定した44例中、2〜9ヶ月後に再狭窄を発症した例は14例(44例中32%))、発症しなかった例は30例(44例中68%)であった。狭窄群と非狭窄群における年齢の平均±SDはそれぞれ、63.2±8.1歳、68.1±9.1歳で2群間に有意差は認められなかった(表1)。PCI治療前のMDA-LDLの測定平均値±SDは、狭窄群では138.4±46U/L、非狭窄群では102±47.4U/Lと非狭窄群に比べ再狭窄群が有意に高値であった(p<0.05、t検定)。また、同時に測定したTCは、再狭窄群では176.4±35.2、非狭窄群では187.4±41mg/dLであり、LDL-Cは再狭窄群で110.7±28.2mg/dL、非狭窄群では115±28.5mg/dLであり、TC、LDL-Cとも2群間に有意差は認められなかった(図1、表1参照)。
実施例1と同様、PCI治療から2〜9ヶ月後再狭窄の有無を判断する確認造影検査施行直前に採血し、MDA-LDLを測定した(計67例)。
PCI治療施行後に2〜9ヶ月間追跡した確認造影時にMDA-LDLを測定した67例中、確認造影により再狭窄が認められた例は26例、狭窄が認められなかった例は41例であった。狭窄群と非狭窄群における年齢の平均±SDはそれぞれ、66.1±9.6歳、66.3±10.3歳で2群間に有意差は認められなかった(表3)。確認造影時のMDA-LDLの測定平均値±SDは、狭窄群では114.9±37.5U/L、非狭窄群では92.2±29.4U/Lと非狭窄群に比べ再狭窄群が有意に高値であった(p<0.01、t検定)。一方、同時に測定したTCは、再狭窄群では181.0±30.3、非狭窄群では172.8±29.7mg/dLであり、LDL-Cは再狭窄群で110.9±21.6mg/dL、非狭窄群では102.1±22.5mg/dLであり、TC、LDL-Cとも2群間に有意差が認められなかった(図3、表3)。
再狭窄群と非再狭窄群とを識別する基準値は、PCI治療前では110U/Lであるのに対し、確認造影時では100U/Lと、PCI治療前に比べ確認造影時では低い傾向が認められた。これは、PCI治療後には冠危険因子低減を図るための治療を受けたため、MDA-LDL値が低下したものと思われる。
本検討においても、CADの危険因子である年齢、TC、LDL-Cは、PCI治療前、確認造影時いずれも、再狭窄群と非再狭窄群との間に有意差を認めず、MDA-LDLのみ有意差を認めた。これらの成績からも、本発明の再狭窄の発症リスクを判定する方法は有用であることが確認された。
Claims (7)
- 冠動脈再建術治療を施行された被験者における再狭窄の発症リスクを判定する方法であって、
(a)被験者由来の生体サンプル中の酸化低比重リポ蛋白(酸化LDL)を測定する工程と、
(b)当該酸化LDLの測定値を予め定めた基準値と比較する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 生体サンプルが冠動脈再建術治療の前及び/または後に採取されたものである請求項1記載の方法。
- 被験者が糖尿病患者である請求項1または2に記載の方法。
- 冠動脈再建術が経皮的冠動脈再建術(PCI)である請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 酸化LDLがマロンジアルデヒド修飾LDL(MDA-LDL)である請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 生体サンプルが、血液、血漿および血清より選ばれるものである請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
- 予め定めた基準値が、再狭窄群と非再狭窄群の2群における変性LDL値より統計学的解析手法を用いて求めた値である請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
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