JPH095323A - 酸化低比重リポ蛋白質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アテローム動脈硬化症等の冠状動脈疾患或は
その疾患予備群を早期に発見するための指標として有用
な、酸化的に処理した血漿又は血清中の酸化的に化学修
飾された低比重リポ蛋白質量を、簡便に且つ迅速に測定
し得る方法を提供。 【構成】 血漿又は血清を酸化的に処理し、該血漿（又
は血清）中に存在する酸化的に修飾された低比重リポ蛋
白質（以下、酸化ＬＤＬと略記する。）を、酸化ＬＤＬ
に対して特異性を有する抗体を用いる免疫学的測定法に
より測定することを特徴とする、酸化ＬＤＬの測定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、冠状動脈硬化性疾患等
の動脈硬化性疾患患者並びにその疾患予備群を早期に発
見するための指標として有用な、酸化的に処理した血漿
（又は血清）中の酸化低比重リポ蛋白質の測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】動脈硬化性疾患の一つであるアテローム
性動脈硬化症では、動脈内膜へのコレステロールの沈
着、或はコレステロールや老廃物からなる所謂粥状物の
形成がみられる。

【０００３】動脈内膜へのコレステロールの取り込みに
は、例えば単球由来マクロファージ、上皮細胞および収
縮型から合成型へと変化した血管平滑筋細胞上等に見い
だされるスカベンジャー受容体が関与している。該スカ
ベンジャー受容体は、酸化（酸化的に化学修飾）された
低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）（以下、これを酸化ＬＤＬ
と略記する。）、例えばアセチル化ＬＤＬ，マロンジア
ルデヒド化ＬＤＬ等の化学的に修飾されたＬＤＬ、並び
に培養上皮細胞、単球及び平滑筋細胞によって酸化的に
化学修飾されたＬＤＬを認識し、取り込むことが知られ
ている。

【０００４】アテローム動脈硬化症に於いて蓄積するコ
レステロールは、主としてスカベンジャー受容体を介し
て取り込まれた酸化ＬＤＬに由来するものと考えられる
ため、血漿或は血清中の酸化ＬＤＬを測定することはア
テローム動脈硬化症に由来する冠状動脈疾患或はその疾
患予備群を早期に発見するための指標として有用と推測
される。

【０００５】しかしながら、酸化ＬＤＬは、スカベンジ
ャー受容体に補足される性質、非常に代謝され易い性質
等を有している。しかも通常血流中にはトコフェロール
（ビタミンＥ）、アスコルビン酸、β−カロチン等の外
来性の抗酸化剤が存在している場合が多くＬＤＬが酸化
的化学修飾から保護されている。従って、血流中（或は
血漿中や血清中）の酸化ＬＤＬ量は極めて少なく殆ど検
出することができないのが現状である。

【０００６】一方、血流中（或は血漿中や血清中）の酸
化ＬＤＬ量を求める代りに、血漿や血清からＬＤＬを超
遠心分離法等の方法により一旦分離し、得られた精製Ｌ
ＤＬに第二銅イオンや2,2'ーアゾビス(2-アミジノプロパ
ン)２塩酸塩等を添加し、一定温度でインキュベイトし
ながら生じた共役ジエン量を吸光度（OD_234nm）変化と
して測定することにより、ＬＤＬの易被酸化性を調べる
方法がエスターバナー等によって提唱されている（Meth
ods in Enzymology ,Vol.233,pp425-441:1994）。即
ち、ＬＤＬの易被酸化性は血流中に生じうる酸化ＬＤＬ
量に反映すると考えられるため、これをアテローム動脈
硬化症等の冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発
見するための指標として用いることが検討されている。

【０００７】しかしながら、これらのＬＤＬの易被酸化
性を調べる方法は操作が煩雑な上、大量の検体を処理す
ることが難しく、また、得られた値は精製されたＬＤＬ
の易被酸化性を推測する値にはなり得ても、血流中（或
は血漿中や血清中）でのＬＤＬの易被酸化性を反映して
いるとは必ずしも言い切れないという問題があった。

【０００８】また、冠状動脈疾患或はその疾患予備群を
早期に発見するための指標として、ヒトアテローム関連
抗原に対するモノクローナル抗体と反応する、血清中の
抗原量を測定する方法（特開平４−１５９３００号公
報）や酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体と反応す
る、血清中の抗原量を測定する方法（ＷＯ 94/23302号
公報）も開発されている。しかしながら、これらの方法
により測定し得る抗原量は、正常者と冠状動脈疾患患者
との間で有為な差が認められないため、該抗原測定値が
冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発見するため
の指標としてどの程度の有用性を有しているのかについ
ては疑問である。

【０００９】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、アテローム動脈硬化症等の冠状動脈疾患或
はその疾患予備群を早期に発見するための指標として有
用な、酸化的に処理した血漿又は血清中の酸化ＬＤＬ量
を、簡便に且つ迅速に測定し得る方法を提供することを
その目的とする。

【００１０】

【発明の構成】本発明は、血漿又は血清を酸化的に処理
し、該血漿（又は血清）中の酸化ＬＤＬを、酸化ＬＤＬ
に対して特異性を有する抗体を用いる免疫学的測定法に
より測定することを特徴とする、酸化ＬＤＬの測定方法
の発明である。

【００１１】また、本発明は、酸化ＬＤＬに対して特異
性を有するモノクローナル抗体と、酸化剤とを含んでな
る、酸化ＬＤＬ測定用キットの発明である。

【００１２】更にまた、本発明は、酸化ＬＤＬに対して
特異性を有するモノクローナル抗体の発明である。

【００１３】即ち、本発明者らは、冠状動脈疾患或はそ
の疾患予備群を早期に発見するための指標として有用と
考えられている血漿又は血清中の酸化ＬＤＬ量を測定す
べく鋭意研究の途上、血漿（又は血清）中に実際に存在
する酸化ＬＤＬ量は、正常者と冠状動脈疾患患者との間
で殆ど差がないこと、言い換えれば、これを指標にした
としても冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発見
することは難しいことを見出した。そこで、本発明者ら
は、更に鋭意研究を行った結果、測定対象の血漿又は血
清を、予め酸化剤、水溶性アゾ系重合開始剤等で酸化的
に処理し、その後に該血漿（又は血清）中の酸化ＬＤＬ
を、酸化ＬＤＬに対する抗体を用いる免疫学的測定法に
より測定すれば酸化ＬＤＬ量（即ち、易被酸化性のＬＤ
Ｌ由来の酸化ＬＤＬを含む酸化ＬＤＬ量）を簡便に且つ
高精度に測定し得ることを見出した。更に、このように
して測定された、該血漿又は血清中の酸化ＬＤＬ量を、
正常者と冠状動脈疾患患者との間で比較すると有為な差
が生ずること、言い換えれば、このようにして求められ
た酸化ＬＤＬ量が冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早
期に発見するための指標として有用であることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１４】本発明に於いて、血漿（又は血清）を酸化
的に処理するために用いられる試薬としては、血漿や血
清中の易被酸化性ＬＤＬを酸化ＬＤＬとし得る能力を有
し、且つ処理後の測定系（免疫学的測定系）に影響を与
えないものであれば特に限定されないが、例えば第二銅
イオン、第二鉄イオン等の金属イオンを含んでなる酸化
剤や水溶性アゾ系重合開始剤等が好ましく挙げられる。
尚、上記金属イオンを含んでなる酸化剤としては特に限
定されないが、例えば硫酸銅，塩化第二銅等の第二銅
塩、例えば塩化第二鉄，硫酸第二鉄，硝酸第二鉄等の第
二鉄塩等が好ましく挙げられる。これらの使用濃度とし
ては、易被酸化性ＬＤＬを酸化し得る濃度であれば特に
限定されず、酸化剤の種類により若干異なるが、酸化処
理を行う際の溶液中の濃度として通常触媒量〜2,000μ
モル／ｌ、好ましくは100〜500μモル／ｌの範囲から適
宜選択される。

【００１５】本発明に於いて用いられる水溶性アゾ系重
合開始剤としては、水溶性であって血漿や血清中の易被
酸化性ＬＤＬを酸化ＬＤＬとし得る能力を有し、且つ処
理後の測定系（免疫学的測定系）に影響を与えないもの
であれば特に限定されないが、例えば2,2'ーアゾビス(2-
アミジノプロパン)２塩酸塩，2,2'-アゾビス[2-(2-イミ
ダゾリン-2-イル)プロパン]２塩酸塩等のアゾアミジン
塩類や、例えば2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオンアミ
ド)２水和物等のアゾアミド類、4,4'-アゾビス(4-シア
ノ吉草酸)、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオンアミド
オキシム)等の市販の水溶性アゾ系重合開始剤が好まし
く挙げられる。これらの使用濃度としては、易被酸化性
ＬＤＬを酸化ＬＤＬとし得る濃度であれば特に限定され
ず、アゾ系重合開始剤の種類により若干異なるが、当該
処理を行う際の溶液中の濃度として通常0.1〜20mM、好
ましくは0.5〜10mMの範囲から適宜選択される。

【００１６】本発明に於いて用いられる酸化ＬＤＬに対
して特異性を有する抗体としては、本発明に於いて血清
等を酸化的に処理するために用いられる試薬により酸化
的に化学修飾されたＬＤＬに対して特異的に結合し得る
性質を有するものであればポリクローナル抗体でもモノ
クローナル抗体でもよく特に限定することなく挙げられ
る。尚、当然のことながら、本発明の測定法に於いて
は、酸化ＬＤＬに対して特異性を有し且つ正常なＬＤＬ
とは反応しない（正常なＬＤＬには結合しない）性質を
有する抗体を少なくとも一種使用しなければその目的を
達成することはできないことは言うまでもない。即ち、
例えば非競合法の原理を利用したサンドイッチ酵素免疫
測定法により酸化ＬＤＬ量を測定する場合、例えばマイ
クロプレート、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、ラ
テックス粒子等の担体の表面に固定化する抗体若しくは
酵素標識抗体の何れかが酸化ＬＤＬに対して特異性を有
し且つ正常なＬＤＬとは反応しない性質を有する抗体で
なければ酸化ＬＤＬ量を精度良く測定できないのであ
る。

【００１７】また、本発明に係る酸化ＬＤＬに対して特
異性を有する抗体は、常法、例えば「免疫実験学入門、
第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981」等
に記載の方法に準じて、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、
ラット、マウス等の動物に酸化ＬＤＬを免疫することに
より作製するか、或はまた常法、即ちケラーとミルスタ
イン（Nature,256巻,495頁,1975）により確立された細
胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と酸化
ＬＤＬで予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて
得られる酸化ＬＤＬに対して特異性を有する抗体を産生
するハイブリドーマから得ることができる。これらポリ
クローナル抗体やモノクローナル抗体は単独で用いてい
も良いし、適宜組み合わせて用いてもよい。

【００１８】本発明に係る酸化ＬＤＬに対して特異性を
有する抗体として特に好ましいものは、酸化ＬＤＬ、ア
セチル化ＬＤＬ及びマロンジアルデヒド化ＬＤＬに対し
て特異的に結合する性質を有するモノクローナル抗体で
ある。この抗体を使用して、酸化ＬＤＬ（上記した如き
酸化剤で処理した血漿又は血清中の酸化ＬＤＬ）の測定
を行えば、正常者と冠状動脈疾患患者との間での酸化Ｌ
ＤＬ量の差をより精度良く区別し得るからである。

【００１９】即ち、アテローム動脈硬化症に於いて病変
部に蓄積するコレステロールが、マクロファージのスカ
ベンジャー受容体に結合して取り込まれる、何らかの形
で修飾されたＬＤＬ（例えば酸化ＬＤＬ、アセチル化Ｌ
ＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ、或は培養上皮細
胞、単球及び平滑筋細胞によって酸化的に化学修飾され
たＬＤＬ）に由来することを考慮すると、これら修飾さ
れたＬＤＬに共通した特有の構造を認識する抗体を使用
して、酸化ＬＤＬを測定すれば、正常者と冠状動脈疾患
患者との間での酸化処理の結果生じる酸化ＬＤＬ量の差
（即ち、易被酸化性ＬＤＬ量の差）をより精度良く区別
し得るのである。

【００２０】本発明の酸化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ及
びマロンジアルデヒド化ＬＤＬに対して特異的に結合す
る性質を有するモノクローナル抗体は、例えば以下の如
くして容易に得ることができる。

【００２１】即ちケラーとミルスタイン（Nature,256
巻,495頁,1975）により確立された細胞融合法に従い、
マウスの腫瘍ラインからの細胞と、酸化ＬＤＬ、アセチ
ル化ＬＤＬ及びマロンジアルデヒド化ＬＤＬの混合物で
予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させてハイブリ
ドーマを得、次いで該ハイブリドーマが産生する、酸化
ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ及びマロンジアルデヒド化Ｌ
ＤＬに対して特異性を有する抗体を情報に従い採取すれ
ば良い。

【００２２】本発明の測定方法を実施するには、例えば
以下の如く行えば良い。即ち、血漿又は血清と、適当濃
度の酸化剤等を含有する例えば生理食塩水や緩衝液等と
を、酸化剤等が上記した如き濃度となるように混合し、
直ちに攪拌した後、通常20〜50℃、好ましくは25〜40℃
で、通常10分間〜24時間、好ましくは６〜16時間インキ
ュベートして、これを検体とし、上記した如き性質を有
する抗体を使用する免疫学的測定方法、例えば酵素免疫
測定法（ＥＩＡ、文献：酵素免疫測定法（第３版），石
川榮治等編，31-54，(1987)，（株）医学書院発行
等）、放射免疫測定法（ＲＩＡ、文献：S.A.Berson,R.
S.Yallow,J.Clin.Inves.,vol.38,1996(1959)等）、免疫
比濁法（ＴＩＡ、文献：桜林ら，日本臨床42巻，1214-1
220頁(1984)等）、免疫比ろう法（文献：K.Hoffken,C.
G.Schmidt,"Methods in Enzymology",vol.74,628頁(198
1)等）等の常法により、該血漿や血清中の酸化性ＬＤＬ
量を測定すれば良い。

【００２３】尚、易被酸化性ＬＤＬの酸化の程度は、酸
化剤やアゾ系重合開始剤の種類、酸化処理の際の濃度、
インキュベーション温度や時間等によっても若干変化す
るので、得られた易被酸化性ＬＤＬ量を冠状動脈疾患或
はその疾患予備群を早期に発見するための指標として利
用するのであれば、上記した如き条件を一定としておか
なければならないことは言うまでもない。例えば、イン
キュベート時間（酸化処理時間）を一定とするため、一
定時間インキュベートした後の反応液に、例えばエチレ
ンジアミン四酢酸、アスコルビン酸等の抗酸化剤を、後
の測定系に影響を及ぼさない程度に過剰量加える等の処
置を行っても良い。

【００２４】本発明の易酸化性ＬＤＬ測定用キットは、
上述の易酸化ＬＤＬ量を測定するために使用されるもの
で、酸化ＬＤＬに対して特異性を有するモノクローナル
抗体と、酸化剤とを含んでなるものであり、夫々の構成
要件の好ましい態様、具体例については上で述べたとお
りである。以下に参考例、実施例を示し、本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらにより何等限定され
るものではない。

【００２５】

【実施例】

参考例１．修飾ＬＤＬの調製法 ヒト新鮮血清から超遠心分離法（続生化学実験講座３，
日本生化学会編，595頁，1986年，（株）東京化学同人
発行）によりＬＤＬ分画を得、これを原料としてアセチル化
ＬＤＬ、マロンシ゛アルテ゛ヒト゛化ＬＤＬ、酸化ＬＤＬをそれぞれ
下記の方法により調製した。 a）アセチル化ＬＤＬ バス等の方法（Basu et.al., Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A, Vol.73, pp3178-3182,1976）を一部改良して以下の
ようにして調製した。即ち、氷上で0.5mlのＬＤＬ(5mg/
ml)に0.5mlの飽和酢酸ナトリウム溶液を加え、スターラ
ーで攪拌しながら７μｌの無水酢酸を15分ごとに４回加
え、その後３０分攪拌した後、0.15M ＮａＣｌ、２mM Ｅ
ＤＴＡ-３Ｎａ溶液に対し２日間透析して得られたＬＤ
Ｌをアセチル化ＬＤＬとした。 b）マロンシ゛アルテ゛ヒト゛化ＬＤＬ フォーゲルマンらの方法（Fogelman et.al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA, Vol.77, pp2214-2218, 1980）に準じて
以下のようにして調製した。即ち、マロンアルテ゛ヒト゛ ヒ゛ス(シ゛メ
チルアセタール) 88μｌと精製水400μｌとを混合し37℃に保温
し、更にこれに４Ｎ塩酸溶液12μｌを加えて37℃で10分
間インキュヘ゛ート後直ちに２Ｎ水酸化ナトリウム溶液130μｌ、精製
水350μｌを添加、混合し、0.5Mマロンシ゛アルテ゛ヒト゛溶液(pH7.
0)を得た。この0.5mlとＬＤＬ(5mg/ml)0.5mlとを混合
し、37℃で3時間インキュヘ゛ートして得たものをマロンジアル
デヒド化ＬＤＬとした。 c）酸化ＬＤＬ 200μg/mlのＬＤＬ溶液１ｍｌに、硫酸銅を１０μＭと
なるように添加し、これを３７℃で４時間インキュヘ゛ートし、
次いでこれに２２mM ＥＤＴＡ-３Ｎａ溶液100μｌを添
加して反応を停止させて得たものを酸化ＬＤＬとした。 実施例１．モノクローナル抗体の調製 参考例１で調製したアセチル化ＬＤＬ、マロンシ゛アルテ゛ヒト゛化ＬＤ
Ｌ及び酸化ＬＤＬの等量モル混合溶液を免疫原とし、公
知の細胞融合の手法に準じて以下のようにして抗酸化Ｌ
ＤＬモノクローナル抗体を調製した。即ち、アセチル化ＬＤＬ、マロン
シ゛アルテ゛ヒト゛化ＬＤＬ及び酸化ＬＤＬの等量モル混合溶液
を抗原溶液とし、リヒ゛ アシ゛ュハ゛ント システム（リビ・イムノケ
ム・リサーチ社製）の標準操作法に従って調製した溶液
を免疫源として、アセチル化ＬＤＬ、マロンシ゛アルテ゛ヒト゛化ＬＤＬ
及び酸化ＬＤＬの総量が３０μg／匹となるように、Bal
b/cマウスの腹腔内に２週間間隔で３回投与した。最終
免疫から１週間後に、アセチル化ＬＤＬ、マロンシ゛アルテ゛ヒト゛化Ｌ
ＤＬ及び酸化ＬＤＬの等量モル混合溶液を生理食塩水で
希釈したものを、３０μg／匹と成るようにマウスの腹
腔内に注射した。この注射を行って３日後にマウスの脾
臓を摘出し、滅菌したすりカ゛ラスを用いて該脾臓を良くほ
ぐした後、ダイゴＴ培地（日本製薬（株）製）に懸濁、
遠心分離処理を数回繰り返して、良く洗浄した。この洗
浄した脾細胞1.5x10⁸個と、同様にダイゴＴ培地で良く
洗浄したマウスのミエローマ細胞(P3-NS-1-Ag4(NS-1))
1.5x10⁷とを試験管に取り、混合した後該試験管の底に
広げる。これに、ダイゴＴ培地で５０w/v％としたポリ
エチレングリコール6000（和光純薬工業（株）製）溶液
１ｍｌを静かに流し込み良く混和して、１分間細胞融合
反応を行った後、ダイゴＴ培地１１ｍｌを徐々に加えて
ＰＥＧを希釈し、細胞融合反応を停止させた。得られた
細胞懸濁液を1500回転で５分間遠心処理して上清を除
き、細胞を10%ウシ胎児血清を含んだダイゴＴ培地１０
０ｍｌに懸濁した。これを９６穴マイクロプレートの各
ウェルに0.1mlずつ分注し、５％ＣＯ₂の存在下、37℃でイ
ンキュベートした。２４時間インキュベート後通常の２
倍濃度のＨＡＴ培地を各ウェルに0.1mlずつ分注し、およそ
４８時間インキュベート後には、通常のＨＡＴ培地で各
ウェルの培養上清の培地交換をおこなった。融合より１週
間後、各ウェルの培養上清0.1mlを除去し、ＨＴ培地0.1ml
を添加した。この操作をその翌日もおこなった。細胞融
合反応より１０日後、培養上清について抗体価を調べ、
抗体活性の強いウェルの細胞を限界希釈法によりクローニ
ングを行い、下記表１に示す如き性質を有する抗体を産
生するクローンを得た。尚、表１に於いて、+++、++、+
及びーは各種抗体の各種ＬＤＬとの反応性を示し、+++は
非常に強く反応することを、++は強く反応することを、
+は弱く反応することを、−は反応しないことを夫々示
す。

【００２６】

【表１】 ＊Nomal；正常ＬＤＬ、Acetyl；アセチル化ＬＤＬ、MDA；マロンジアルデヒド 化ＬＤＬ、Oxidized；酸化ＬＤＬ。 上記のクローンの内、ＬＤ１−Ａ２とＬＤ３−Ｂ５は、
通商産業省工業技術院生命工業技術研究所に寄託されて
おり、その寄託番号及び寄託日は以下の通りである。 クロ−ンＬＤ１−Ａ２：寄託番号；ＦＥＲＭ Ｐ−１４
９１０。寄託日；平成７年４月２８日。 クロ−ンＬＤ３−Ｂ５：寄託番号；ＦＥＲＭ Ｐ−１４
９１１。寄託日；平成７年４月２８日。

【００２７】実施例２．各種リポ蛋白質との反応性の検
討 本発明のモノクローナル抗体を使用した酸化ＬＤＬ測定
法が、各種リポ蛋白質とどのような反応性を有するかに
ついて、固相抗体にはアセチル化ＬＤＬ、マロンシ゛アルテ゛ヒト゛化Ｌ
ＤＬ及び酸化ＬＤＬに特異性を有するが正常ＬＤＬとは
反応しない、クロ−ンＬＤ１−Ａ２が産生するモノクロ
ーナル抗体を、また、二次抗体には各種修飾ＬＤＬと広
く反応する、クロ−ンＬＤ３−Ｂ５が産生するモノクロ
ーナル抗体を常法（Ishikawa,E. et.al.,J.Immunoassa
y,vol.4,209-327頁,1983等）によりペルオキシダーゼ
（東洋紡績（株）製）で標識したものを使用して以下の
ように検討を行った。即ち、クロ−ンＬＤ１−Ａ２モノ
クローナル抗体の２０μgAb/ml溶液５０μｌを分注し、
３７℃で３０時間固定化処理した後、２５（V/V）％ブ
ロックエース（雪印乳業（株）製）溶液でブロッキング
処理した９６穴マイクロプレートの各ウェルに、一次反
応用緩衝液［ブロックエースを２５（V/V）％、エチレ
ンジアミン四酢酸・２ナトリウム塩を０．１（W/V）％
含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、）］１
００μｌを入れ、更に２５０μＭ硫酸銅存在下に37℃で
６時間インキュベートして酸化処理した各種リポ蛋白質
溶液１０μｌを添加した。これを３７℃で２時間インキ
ュベートした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（アルドリ
ッチ）含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）−生理食塩水
（以下ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）３００μｌで三回洗浄し
た。更に、ペルオキシダーゼ標識したクロ−ンＬＤ３−
Ｂ５産生モノクローナル抗体を、OD₄₀₃が1.5×10^ー3とな
るように含有させた二次反応用緩衝液（ブロックエース
を２５（W/V）％含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）５０μ
ｌを各ウェルに入れ、３７℃で２時間インキュベートし
た。次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ３００μｌで三回洗浄した
後、オルトフェニレンジアミン１４．４ｍＭを含有する
マックルバイン緩衝液（ｐＨ４．８）を各ウェルに５０
μｌずつ入れ、室温で３０分酵素反応を行わせた後、３
Ｎ硫酸を各ウェルに５０μｌずつ入れその反応を停止さ
せた。各ウェルの吸光度（ＯＤ490-650）を、ＳＯＦＴm
ax-J（Ver．2.2、和光純薬工業（株）製）によりλ1=４
９０ｎｍ、λ2=６５０ｎｍ、二波長エンドポイント測定
に条件設定したマイクロプレートリーダーＵＶmax（モ
レキュラーデバイス社製）で測定し、酸化処理済み各種
リポ蛋白質との反応性を検討した。 （結果）結果を表２に示す。尚、表２に於いて、+++は
得られた吸光度が０．５以上であることを、++は得られ
た吸光度が０．２５〜０．５であることを、+は得られ
た吸光度が０．１〜０．２５であることを、−は得られ
た吸光度が０．１未満であることを夫々示す。

【００２８】

【表２】 表２の結果から、本発明のモノクローナル抗体を使用し
た測定法を利用することにより、正常ＬＤＬや各種ＨＤ
Ｌに由来する測定誤差を生じさせることなく目的の酸化
ＬＤＬ量、即ち易被酸化性ＬＤＬに由来する酸化ＬＤＬ
量を測定し得ることが判る。

【００２９】実施例３．ＬＤＬの酸化の程度と、クロー
ンＬＤ１−Ａ２由来のモノクローナル抗体の反応性の検
討 ＬＤＬの酸化の程度と、クローンＬＤ１−Ａ２由来のモ
ノクローナル抗体の反応性について、ＬＤＬの酸化の程
度を、酸化の程度を表すチオバルビツール酸反応物質
（ＴＢＡＲＳ）量及び過酸化脂質（ＬＰＯ）量を指標と
して検討を行った。 （試料の調製）新鮮人血清を原料とし超遠心分離法（続
生化学実験講座３，日本生化学会編，595頁，1986年，
（株）東京化学同人発行）により調製したＬＤＬの200
μg/ml溶液に硫酸銅が１０μＭとなるように添加し、３
７℃で所定時間インキュベートを行った後、反応液の1/
10容の22mM EDTAー3Na溶液を添加して反応を停止させた
ものを試料とした。 （ＴＢＡＲＳ量の測定）所定の試料200μｌに２０w/v％
トリクロロ酢酸１ｍｌを加え攪拌した後、０.６７％チ
オバルビツール酸溶液２ｍｌを加え、沸騰水浴中２０分
間加熱した後冷却した。反応液を3000rpmで１５分間遠
心処理し、得られた上清の吸光度（５３５ｎｍ）を測定
した。尚、吸光度は、試料として生理食塩水を用いたも
のを対照として測定した。得られた吸光度は、マロンシ゛アルテ
゛ヒト゛の分子吸光係数を1.56x10⁵M^-1cm^-1としてマロンシ゛アルテ゛
ヒト゛量（nmol/mg蛋白質）に換算した。 （ＬＰＯ量の測定）ＬＰＯの測定は、市販の過酸化脂質
測定試薬「デタミナーＬＰＯ」（協和メディクス（株）
製）を使用して行った。尚、測定操作は該キットに添付
の現品説明書に記載の標準操作法により行った。 （クローンＬＤ１−Ａ２由来のモノクローナル抗体の反
応性の検討）酸化処理済み各種リポ蛋白質溶液１０μｌ
の代りに、上で得た試料１０μｌを用いた以外は、実施
例２と同じ試薬を用い、同様の操作を行って所定の試料
中の酸化ＬＤＬ量を吸光度（ＯＤ490-650）として求め
た。 （結果）結果を図１に示す。尚、図１に於いて、△は所
定の試料について得られた吸光度（酸化処理済検体中の
酸化ＬＤＬ量）を、また、○は所定の試料について得ら
れたＴＢＡＲＳ量（nmol/mg蛋白質）を、また、□は所
定の試料について得られたＬＰＯ量（μmol/mg蛋白質）
を夫々示す。図１から、試料のインキュベート時間が15
0分を越えると吸光度（ＯＤ490-650）が上昇を始めるこ
とから、本発明の方法では、このような条件下の酸化Ｌ
ＤＬを検出することができることが判る。また、ＴＢＡ
ＲＳ量及びＬＰＯ量は、ＬＤＬの酸化の程度の指標とな
るが、これらの変化がインキュベート時間が180分を越
えたあたりでほぼ横ばいとなることから、この付近でＬ
ＤＬの酸化的化学修飾はほぼ終了することも判る。以上
の結果から、クローンＬＤ１−Ａ２に由来するモノクロ
ーナル抗体は、十分に酸化的に化学修飾されたＬＤＬと
反応し、酸化的化学修飾がそれほど進んでいないＬＤＬ
（酸化反応の初期段階のＬＤＬ）とは反応しないことが
判った。尚、ブモル等が開発したヒトアテローム関連抗
原と反応するモノクローナル抗体（特開平４−１５９３
００号公報）は、酸化反応の初期段階のＬＤＬと反応す
る性質を有するものであるから、本発明のモノクローナ
ル抗体とは異なった性質を有するものである。

【００３０】実施例４．酸化処理時の銅イオン濃度の検
討 （１）酸化処理済み血清検体の調製 所定の新鮮血清５０μｌをチューブに分取し、所定濃度
の硫酸銅を含む０．９％NaCl溶液５０μｌと混合した。
これを、３７℃に設定した恒温槽に入れて遮光し、１６
時間放置した。その後、反応液に2.2ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸・３ナトリウム塩１０μｌ添加し、酸化反応
を停止させて酸化処理済み血清検体とした。 （２）酸化処理済検体中の酸化ＬＤＬ量の測定 酸化処理済み各種リポ蛋白質溶液１０μｌの代りに、上
記（１）で得た酸化処理済み血清検体１０μｌを用いた
以外は、実施例２と同じ試薬を用い、同様の操作を行っ
て各種酸化処理済み血清検体中の酸化ＬＤＬ量を吸光度
として求めた。結果を図２に示す。尚、図２に於いて、
△は正常者由来の血清を用いた場合の結果を、また、○
及び□は冠状動脈疾患集中治療病棟入院患者由来の血清
（以下、ＣＣＵ血清と略記する。）を用いた場合の結果
を夫々示す。また、図２の横軸の銅イオン濃度は、酸化
処理反応時の銅イオン濃度（μＭ）を示す。図２から、
ＣＣＵ血清は酸化処理用の銅イオン濃度の上昇に伴って
吸光度の上昇が見られるのに対し、正常者血清では酸化
処理反応時の銅イオン濃度が２６０μＭまでは吸光度の
上昇は見られないこと、言い換えれば、酸化処理反応時
の銅イオン濃度は１６０〜２６０μＭが好ましいことが
判る。

【００３１】実施例５ ＣＣＵ血清１７検体、正常者血清５検体の夫々を、２５
０μＭ硫酸銅存在下に37℃で６時間インキュベートして
酸化処理を行ったものの１０μｌを、酸化処理済み各種
リポ蛋白質溶液１０μｌの代りに用いた以外は、実施例
２と同じ試薬を用い、同様の操作を行って各種酸化処理
済み血清検体中の酸化ＬＤＬ量を吸光度として求めた。
この吸光度を、予め所定濃度のマロンジアルデヒド化Ｌ
ＤＬ溶液を酸化ＬＤＬ標準液とし、上記と同じ試薬を用
い、同様の操作を行って作製した、酸化ＬＤＬ量と吸光
度との関係を表す検量線に当てはめて、酸化処理済の各
検体中の酸化ＬＤＬ量（μg/ml）を求めた。結果を図３
及び表３に示す。

【００３２】比較例１ 実施例５で用いたＣＣＵ血清１７検体及び正常者血清５
検体の１０μｌを、酸化処理済み各種リポ蛋白質溶液１
０μｌの代りに用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用
い、同様の操作を行って各種血清検体中の酸化ＬＤＬ量
を吸光度として求めた。この吸光度を、予め所定濃度の
マロンジアルデヒド化ＬＤＬ溶液を酸化ＬＤＬ標準液と
し、上記と同じ試薬を用い、同様の操作を行って作製し
た、酸化ＬＤＬ量と吸光度との関係を表す検量線に当て
はめて、酸化処理済の各検体中の酸化ＬＤＬ量（μg/m
l）を求めた。結果を図３及び表３に併せて示す。

【００３３】 図３及び表３から明らかな如く、ＣＣＵ血清中の天然型
の酸化ＬＤＬ量と正常者血清中のそれは殆ど差がないこ
と、言い換えれば天然型の酸化性ＬＤＬ量は、アテロー
ム動脈硬化症等の冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早
期に発見するための指標として利用できないものである
ことが判る。これに対して、酸化処理により生ずる酸化
ＬＤＬ量（即ち、易被酸化性ＬＤＬ量；酸化処理後の酸
化ＬＤＬ量から天然形酸化ＬＤＬ量を差し引いた量）を
比較すると、ＣＣＵ血清中の易被酸化性ＬＤＬ量は、正
常者血清中のそれに比較して有意に高値を示すこと、言
い換えれば易被酸化性ＬＤＬ量は、アテローム動脈硬化
症等の冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発見す
るための指標として有用であることが図３及び表３の結
果から判る。また、図３及び表３の結果から、酸化処理
後の血清中の酸化ＬＤＬ量でもアテローム動脈硬化症等
の冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発見するた
めの指標として有用であることが判る。

【００３４】実施例６ ＣＣＵ血清４０検体、正常者血清１０検体の夫々を、２
５０μＭ硫酸銅存在下に37℃で６時間インキュベートし
て酸化処理を行ったものの１０μｌを、酸化処理済み各
種リポ蛋白質溶液１０μｌの代りに用いた以外は、実施
例２と同じ試薬を用い、同様の操作を行って各種酸化処
理済み血清検体中の酸化ＬＤＬ量を吸光度として求め
た。この吸光度を、予め所定濃度のマロンジアルデヒド
化ＬＤＬ溶液を酸化ＬＤＬ標準液とし、上記と同じ試薬
を用い、同様の操作を行って作製した、酸化ＬＤＬ量と
吸光度との関係を表す検量線に当てはめて、酸化処理済
の各検体中の酸化ＬＤＬ量（μg/ml）を求めた。結果を
図４に示す。図４から明らかな如く、酸化処理済のＣＣ
Ｕ血清中の酸化ＬＤＬ量は、酸化処理済正常者血清中の
それに比較して有意に高値を示すこと、言い換えればこ
のような方法により測定される酸化ＬＤＬ量は、アテロ
ーム動脈硬化症等の冠状動脈疾患或はその疾患予備群を
早期に発見するための指標として有用であることが判
る。

【００３５】実施例７ ＣＣＵ血清２０検体、正常者血清５検体の夫々を、１０
mMの2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)・２塩酸塩
（商品名；Ｖ−５０、和光純薬工業（株）製）を含有す
る0.9%塩化ナトリウム溶液と１：１で混合した後、３７
℃、６時間インキュベートして処理を行ったものの１０
μｌを、酸化処理済み各種リポ蛋白質溶液１０μｌの代
りに用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、同様の
操作を行ってＶ−５０処理済血清検体中の酸化ＬＤＬ量
を吸光度として求めた。この吸光度を、予め所定濃度の
マロンジアルデヒド化ＬＤＬ溶液を酸化ＬＤＬ標準液と
し、上記と同じ試薬を用い、同様の操作を行って作製し
た、酸化ＬＤＬ量と吸光度との関係を表す検量線に当て
はめて、Ｖ−５０処理済の各検体中の酸化ＬＤＬ量（μ
g/ml）を求めた。結果を図５に示す。図５から明らかな
如く、水溶性のアゾ系重合開始剤であるＶ−５０で処理
を行った場合でも、ＣＣＵ血清中の酸化ＬＤＬ量は、正
常者血清中のそれに比較して有意に高値を示すこと、言
い換えれば酸化ＬＤＬ量は、アテローム動脈硬化症等の
冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発見するため
の指標として有用であることが判る。また、同じ血清検
体を、５００μＭの硫酸銅を含有する0.9%塩化ナトリウ
ム溶液と１：１で混合した後、３７℃、６時間インキュ
ベートして酸化処理を行ったものの１０μｌを、酸化処
理済み各種リポ蛋白質溶液１０μｌの代りに用いた以外
は、実施例２と同じ試薬を用い、同様の操作を行って血
清検体中の酸化ＬＤＬ量を吸光度として求めた。この吸
光度を、予め所定濃度のマロンジアルデヒド化ＬＤＬ溶
液を酸化ＬＤＬ標準液とし、上記と同じ試薬を用い、同
様の操作を行って作製した、酸化ＬＤＬ量と吸光度との
関係を表す検量線に当てはめて、酸化処理済の各検体中
の酸化ＬＤＬ量（μg/ml）を求めた。得られた酸化ＬＤ
Ｌ量と、Ｖ−５０で処理した場合に得られた酸化ＬＤＬ
量との相関関係を図６に示す（相関係数；0.861）。図
６から明らかな如く、硫酸銅により処理した場合でも、
Ｖ−５０で処理した場合でも、血清中の酸化ＬＤＬ量は
同程度に測定し得ることが判る。

【００３６】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、酸化的に処
理された血漿や血清中の酸化ＬＤＬ量を迅速且つ簡便に
測定し得る方法を提供するものであり、本発明の方法に
より求められる酸化ＬＤＬ量は、アテローム動脈硬化症
等の冠状動脈疾患或はその疾患予備群を早期に発見する
ための指標として有用である、という効果を奏する発明
であるので、斯業に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で得られた、所定時間酸化処理を行っ
た場合の低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）の酸化の程度と、本
発明の方法による検出の程度の関係を示すグラフであ
る。

【図２】実施例４で得られた、銅イオン濃度と、検出さ
れる酸化的に化学修飾されたＬＤＬ（以下、酸化ＬＤＬ
と略記する。）との関係を示すグラフである。

【図３】実施例５で得られた、酸化処理を行った、冠状
動脈疾患集中治療病棟入院患者由来の血清（以下、ＣＣ
Ｕ血清と略記する。）と正常者血清中の酸化ＬＤＬ量、
及び比較例１で得られた、酸化処理を行っていない、Ｃ
ＣＵ血清と正常者血清中の酸化ＬＤＬ量を示すグラフで
ある。

【図４】実施例６で得られた、酸化処理を行った、ＣＣ
Ｕ血清と正常者血清中の酸化ＬＤＬ量を示すグラフであ
る。

【図５】実施例７で得られた、2,2'-アゾビス(2-アミジ
ノプロパン)・２塩酸塩（Ｖ−５０）で処理を行った、
ＣＣＵ血清と正常者血清中のＶ−５０処理済検体中の酸
化ＬＤＬ量を示すグラフである。

【図６】実施例７で得られた、硫酸銅により処理した場
合に得られる酸化処理済検体中の酸化ＬＤＬ量と、Ｖ−
５０で処理した場合に得られる酸化処理済検体中の酸化
ＬＤＬ量との相関を表すグラフである。

【図面の記号の説明】

第１図に於いて、△は所定の試料について得られた酸化
ＬＤＬに由来する吸光度を、また、○は所定の試料につ
いて得られたチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲ
Ｓ）量を、また、□は所定の試料について得られた過酸
化脂質（ＬＰＯ）量を夫々示す。第２図に於いて、△は
正常者由来の血清を用いた場合の結果を、また、○及び
□はＣＣＵ血清を用いた場合の結果を夫々示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血漿又は血清を酸化的に処理し、該血漿
   （又は血清）中の酸化的に化学修飾された低比重リポ蛋
   白質（以下、酸化ＬＤＬと略記する。）を、酸化ＬＤＬ
   に対して特異性を有する抗体を用いる免疫学的測定法に
   より測定することを特徴とする、酸化ＬＤＬの測定方
   法。
2. 【請求項２】 酸化ＬＤＬに対して特異性を有するモノ
   クローナル抗体と、酸化剤とを含んでなる、酸化ＬＤＬ
   測定用試薬キット。
3. 【請求項３】 酸化ＬＤＬに対して特異性を有するモノ
   クローナル抗体。
4. 【請求項４】 酸化ＬＤＬに対して特異性を有する抗体
   が、正常な低比重リポ蛋白質には結合しない性質を有す
   るモノクローナル抗体である、請求項３に記載のモノク
   ローナル抗体。
5. 【請求項５】 酸化ＬＤＬに対して特異性を有する抗体
   が、アセチル化低比重リポ蛋白質及びマロンジアルデヒ
   ド化低比重リポ蛋白質に対しても特異的に結合する性質
   を有するモノクローナル抗体である、請求項３又は４に
   記載のモノクローナル抗体。