PL236574B1 - Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi przez badanie mutacji genu RECQL - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej wykrywającej wysokie ryzyko raka piersi u kobiet. W przedstawianym sposobie wykrywania mutacji genu RECQL, identyfikuje się grupę kobiet, które są w grupie wysokiego ryzyka zachorowania na raka piersi.

Dotychczas nie było wiadome czy mutacje genu RECQL są związane z ryzykiem raka piersi. Nie opisano mutacji patogennych tego genu u kobiet z rakiem piersi. Tym samym potencjalna użyteczność kliniczna badania mutacji RECQL w diagnostyce wysokiej dziedzicznej predyspozycji do raka piersi nie była znana. Problem ten rozwiązuje niniejszy wynalazek precyzyjnie ustalający po raz pierwszy: częstość mutacji założycielskiej genu RECQL u kobiet z rakiem piersi i kobiet zdrowych w polskiej populacji oraz ryzyko raka piersi u zdrowych nosicielek mutacji genu RECQL w polskiej populacji.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność delecji konstytucyjnej w obrębie genu RECQL, która jest mutacją c.1667_1667+3delAGTA.

Korzystnie, bada się obecność mutacji konstytucyjnej genu RECQL u kobiety, niezależnie od historii rodzinnej zachorowań na nowotwory.

Na Fig. 1 przedstawiono fragment sekwencji genomowego DNA zawierający przykładową badaną mutację RECQL, która okazała się mutacją konstytutywną w populacji polskiej.

Szczegółowy opis wynalazku

W wynalazku po raz pierwszy oszacowano ryzyko raka piersi u Polek z mutacją genu RECQL. Nieoczekiwanie ustalono, że występowanie mutacji genu RECQL c.1667_1667+3delAGTA (p.K555delinsMYKLIHYSFR) wiąże się z około 5,5-krotnie zwiększonym ryzykiem raka piersi, co odpowiada około 33% ryzyku zachorowania na ten nowotwór w ciągu życia u pacjentek z Polski. Ryzyko to dodatkowo wzrasta w przypadku, gdy w rodzinie nosicielki mutacji występuje zachorowanie na raki piersi: 1) gdy co najmniej jedna krewna I lub II stopnia chorowała na raka piersi ryzyko jest zwiększone około 11,5 krotnie co odpowiada ryzku raka piersi u Polki wynoszącemu około 70%.

Na podstawie wynalazku szacuje się, że około 0,25% raków piersi w Polsce jest wywołanych przez mutację genu RECQL c.1667_1667+3delAGTA.

Najistotniejszym elementem wynalazku jest ustalenie, że gen RECQL jest genem wysokiej penetracji dla raka piersi. Nieoczekiwanie stwierdzono związek powtarzalnej w polskiej mutacji genu RECQL z wysokim ryzykiem nieselekcjonowanego raka piersi. Jednocześnie ustalono silny statystycznie związek obecności mutacji RECQL z przypadkami rodzinnej agregacji raków piersi. Ponadto ustalono segregację mutacji z zachorowaniami na raka piersi w rodzinnych przypadkach agregacji tego nowotworu.

Wykazano, że u nosicielek mutacji RECQL występuje wysokie ryzyko inwazyjnego raka piersi. Odkrycie to możliwe było dzięki analizie dużej grupy kobiet z inwazyjnym rakiem piersi w homogennej genetycznie populacji polskiej.

Nieoczekiwanie ustalono, że powtarzalna mutacja genu RECQL jest czynnikiem przyczynowym raka piersi u Polek. Niniejszy wynalazek dotyczy również zalecanego postępowania medycznego w przypadku wykrycia rzeczonej mutacji genu RECQL u zdrowej Polki. Identyfikacja mutacji genu RECQL powinna być wskazaniem do wykonywania regularnych badań kontrolnych za pomocą badań obrazowych takich jak USG, MMG i ewentualnie MRI, mających na celu wczesne wykrycie raka piersi optymalnie na wczesnym etapie rozwoju, co wiąże się z lepszym rokowaniem. Proponowany schemat badań obejmuje coroczne USG piersi od 25 roku życia oraz MMG (ew. poszerzone o MRI) od 35 roku życia. Przy obserwowanym wysokim ryzyku raka piersi (zwłaszcza u nosicielek mutacji RECQL, u których w rodzinie występowały przypadki zachorowania na raka piersi), jako opcję postępowania medycznego można rozważyć profilaktyczną podskórną mastektomię.

Wynalazek dotyczy również opracowania nowego markera wysokiego ryzyka raka piersi. W wyniku wykonanych badań nieoczekiwanie okryto związek pomiędzy nosicielstwem mutacji RECQL a ryzykiem raka piersi. Niniejszy wynalazek w oparciu o analizę kliniczną raków piersi w grupie nosicielek RECQL przedstawia również sposoby postępowania medycznego, które mogą uchronić nosicielki mutacji RECQL przed zachorowaniem na raka i /lub rozpoznaniem raka na zaawansowanym etapie. Warunkiem zastosowania takiego postępowania medycznego jest identyfikacja specyficznej mutacji genu RECQL za pomocą testu diagnostycznego opracowanego na podstawie niniejszego wynalazku. Tak więc, przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspo

PL 236 574 B1 zycji do raka piersi, charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność mutacji konstytucyjnej genu RECQL: mutacji c.1667_1667+3delAGTA, przy czym korzystne jest, jeżeli pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego. Jak ustalono w przykładzie 1 wynalazku w polskiej populacji mutacja c.1667_1667+3delAGTA występuje z częstością 0,04%, a więc w Polsce żyje około 10 000 nosicielek tej mutacji konstytucyjnej RECQL.

Koszt testu opartego o wykrywanie wybranych zmian RECQL, zwłaszcza mutacji charakterystycznej dla polskiej populacji, jest wielokrotnie mniejszy niż koszt pełnej analizy sekwencji genu RECQL, a czas badania nieporównywalnie krótszy. Taki test może być wykonywany w wielu laboratoriach bez konieczności stosowania skomplikowanego i kosztownego sprzętu. Obecność mutacji powtarzalnej genu RECQL w naszej populacji stwarza unikalną możliwość niezwykle efektywnej diagnostyki genetycznej (opartej o identyfikację tej zmiany DNA). Mutacja konstytucyjna genu RECQL jest obecna u nosicieli od urodzenia. Identyfikacja takich mutacji stwarza możliwość wykrycia zagrożenia rakiem piersi na wiele lat przed zachorowaniem. Tak wiec zastosowanie testu RECQL stwarza możliwość objęcia kobiet zindywidualizowanym postępowaniem medycznym. Zgodnie z wynalazkiem, taki test należy wykonać u każdej dorosłej kobiety (a zwłaszcza u kobiet, w których rodzinie występował rak piersi). Wykrycie mutacji RECQL u kobiety byłoby wówczas wskazaniem do wykonywania regularnych badań okresowych piersi od 25 roku życia. Takie zindywidualizowane postępowanie medyczne powinno przyczynić się do wczesnego rozpoznania i leczenia tego nowotworu na wczesnych etapach rozwoju, gdy całkowite wyleczenie jest możliwe. Odpowiednie postępowanie medyczne (badania okresowe lub profilaktyczna podskórna mastektomia) zastosowane dzięki niniejszemu wynalazkowi powinno doprowadzić do zmniejszenia umieralności nosicielek mutacji RECQL w Polsce.

Uzasadnione jest, aby mutacja powtarzalna genu RECQL wysokiego ryzyka raka piersi (mutacja c.1667_1667+3delAGTA) została włączona do panelu mutacji dla testu wysokiego ryzyka raka piersi, który powinien być wykonywany u każdej dorosłej Polki.

P r z y k ł a d 1.

A) Poszukiwanie mutacji genu RECQL w grupie 475 kobiet z rakiem piersi z rodzin z agregacją tego nowotworu z polskiej populacji poprzez bezpośrednie sekwecjonowanie.

Aby określić spektrum mutacji genu RECQL w polskiej populacji przeprowadzono pełne sekwencjonowanie tego genu w grupie 475 kobiet z rakiem piersi z rodzin z agregacją tego nowotworu (w wieku od 24-80 lat; średnia wieku 54 lata). Specyficznym celem sekwencjonowania było wykrycie mutacji powtarzalnych/założycielskich genu RECQL charakterystycznych dla naszej populacji, których wykrycie następnie umożliwiłoby ocenę ryzyka raka piersi u nosicieli tych mutacji w badaniu asocjacyjnym w dużej grupie przypadków i kontroli. Badanie całej sekwencji kodującej genu RECQL, przeprowadzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania metodą Sangera.

B) Analiza funkcjonalna mutacji c.1667 1667+3delAGTA genu RECQL na poziomie mRNA.

Aby zbadać wpływ mutacji RECQL c.1667_1667+3delAGTA na syntezę mRNA, fragmenty mRNA genu RECQL wyizolowane z próbek krwi 4 nosicielek mutacji c.1667_1667+3delAGTA oraz od 3 osób bez tej mutacji (kontrole) zostały zamplifikowane (po przepisaniu na cDNA) oraz przesekwencjonowane za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

C) Ustalanie korelacji pomiędzy obecnością mutacji skracającej białko RECQL (mutacja c.1667 1667+3delAGTA), a ryzykiem raka piersi oraz charakterystyka kliniczna raków piersi w polskiej populacji.

Aby ustalić ryzyko związane z występowaniem mutacji c.1667_1667+3delAGTA genu RECQL, przeprowadzono analizę występowania tej mutacji w grupie 13611 kobiet z inwazyjnym rakiem piersi, zdiagnozowanych w latach od 1996 do 2013 w 18 szpitalach w Polsce. Pacjentki nie były selekcjonowane pod względem historii rodzinnej zachorowań na nowotwory.

Kobiety, u których uprzednio wykryto jedną z trzech mutacji założycielskich genu BRCA1 (C61G, 4153delA i 5382insC), które stanowią około 90% wszystkich mutacji BRCA1 stwierdzanych w polskiej populacji, zostały wykluczone z badania (1). W 576 przypadkach stwierdzono jedną z trzech mutacji założycielskich genu BRCA1 (C61G lub 4153delA lub 5382insC) - przypadki te zostały wykluczone z dalszych analiz.

Ostatecznie oznaczanie obecności mutacji genu RECQL wykonano w grupie 13 611 kobiet z rakiem piersi, u których nie stwierdzono mutacji genu BRCA1 (wiek rozpoznania od 18 do 92 lat, średnia wieku rozpoznania 53,2 lata). 6 973 raków zdiagnozowano wieku 50 lat lub poniżej a 6638 raków zdiagnozowano w wieku powyżej 50 lat.

PL 236 574 B1

Grupę kontrolną stanowiło 4702 kobiet w wieku 18-94 lat (średnia wieku 53 lat). Celem grupy kontrolnej było ustalenie częstości badanej mutacji w populacji zdrowych kobiet w Polsce. Kontrole te pochodziły z czterech źródeł. Pierwsza grupa to 979 kobiet z regionu Szczecina (w wieku 24-84 lat), sparowanych pod względem płci z pacjentkami z rakiem piersi zdiagnozowanymi w Szczecinie w latach 1996 oraz 2004. Druga grupa to 1707 kobiet (w wieku od 32 do 72), które brały udział w badaniach okresowych (USG i mammografia) w 8 ośrodkach w Polsce w latach 2009-2011. Trzecia podgrupa kontrolna składała się z 1031 zdrowych kobiet z okolic Opola (przedział wiekowy 20-94) od których pobrano próbki krwi w latach 2012 i 2013. Czwarta seria zawierała 985 zdrowych kobiet (w wieku 50-66), które uczestniczyły w kolonoskopowym programie badań przesiewowych w latach 2007-2010. Stwierdzona częstość mutacji genu RECQL była podobna w podgrupach kontroli pochodzącej z czterech źródeł.

Aby ustalić charakterystykę kliniczną raków piersi u nosicielek mutacji RECQL, porównano raki piersi zdiagnozowane u nosicielek mutacji do raków piersi u kobiet bez mutacji RECQL. Istotność określono za pomocą testu Fishera lub testu chi-kwadrat. Zgromadzono informacje odnośnie charakterystyki klinicznej raków w tym wiek rozpoznania, rok rozpoznania, wielkość guza, obecność przerzutów w okolicznych węzłach chłonnych, obecność receptorów ER, PR i HER2 w komórkach nowotworowych oraz dane o obustronności guzów. Dane odnośnie rodzinnej historii raków dotyczyły liczby krewnych I i II stopnia z rakiem piersi lub rakiem jajnika.

Izolacja genomowego DNA

Od wszystkich pacjentek pobrano próbkę krwi obwodowej. Do probówek zawierających 1 ml 1 M wersenianu sodu pobierano 10 ml krwi obwodowej. W celu rozbicia błony komórkowej do próbek dodawano roztwór TKM (10 mM Tris-HCL, 10 mM KCL, 2 mM EDTA, 4 mM MgCb) i 1 ml Igepal (SIGMA). Następnie próbkę wirowano w temp. 20°C przez 10 minut przy 3400 obr./min. (w wirówce Eppendorf 5810R). Po odwirowaniu zlewano supernatant zostawiając osad leukocytów, który następnie zalewano roztworem TKM i rozbijano ręcznie. Powstałą mieszaninę wirowano przy 3400 obr. W temp. 20°C przez 5 minut. Supernatant zlewano a powstały osad przepłukiwano dwu krotnie roztworem TKM. Następnie dodawano 0,5 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) i całość mieszano pipetą Pasterowską. W następnym etapie w celu rozbicia kompleksów białko-DNA próbkę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez 7 minut. Białko z roztworu wytrącano dodając 1 ml 5 M NaCl. Tak przygotowaną mieszaninę wirowano w temp. 20°C, przy 9900 obr./min. przez 25 minut. Powstały supernatant przenoszono do odrębnej probówki. Z roztworu supernatantu wytrącano DNA dodając 10 ml 96% alkoholu etylowego. Wytrącony „kłaczek” DNA przenoszono do probówki i suszono w suszarce próżniowej przez 10 minut. DNA rozpuszczano w 200 gl TE (25 Mm Tris, HCL, IMm EDTA; pH 8,4) i przechowywano w 4°C.

Wykrywanie mutacji RECQL c.1667 1667+3delAGTA

Mutację wykrywano za pomocą techniki PCR czasu rzeczywistego z wykorzystaniem starterów o sekwencji 1665F: 5’- GACAACCTGA AAGAATAATG and 1665r 5’-T GG AG A AGAT TATTGCACAC) i sond o sekwencji (1665del: 5’- GT TTG TAC ATA AGA TAC TGC T and 1665wt 5’ - GT TTG TAC ATA CTT AAG ATA CTG). Reakcje PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (LightCycler® Real-Time PCR 480 System (Roche Life Science). Mieszanina reakcyjna o objętości 5 gl zawierała: 1 gl (10ng) genomowego DNA, 0,0625 gl (Assay 80x) gotowego mixu starterów i sond (Applied Biosy stems, Life Technologies), 2,5 gl mixu reakcyjnego (GoTaq Probe qPCR Master Mix 2X, Promega), uzupełnione do 5 gl wodą wolną od nukleaz. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 95 OC > 10 min (zmiana temp. 4,8 OC/s)

2. 95 OC > 10 sec. (zmiana temp. 4,8 OC/s)

OC > 30 sec.

(zmiana temp. 2,5 OC/s) cykli

OC > 1 sec. (zmiana temp. 4,8OC/s)

3. 40 OC > 30 sec. (zmiana temp. 2,5OC/s)

4. 60 OC-61 OC > 1 sec. (zmiana temp. 0,06 OC/s)

5. 40 OC > 30 sec. (zmiana temp. 2,5OC/s)

Obecność mutacji wykrytych w analizach PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego se kwencjonowania.

PL 236 574 Β1

Sekwencjonowanie

Amplifikację pełnej sekwencji kodującej genu RECQL zawierającej przeprowadzono z użyciem starterów, które są przedstawione poniżej. Do analiz wykorzystano następujące pary starterów do amplifikacji za pomocą reakcji PCR:

Nazwa startera	Sekwencja startera (z sekwencją M13)	Długość produktu (pz)
RECQLE2F	TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTGACGACTGCACAACAGTCT	586
RECQLE2R	CAGGAAACAGCTATGACCTGGATGTTTGCTGAGTGTCATTGC
RECQLE3F	TGTAAAACGACGGCCAGTCAATGTTGCTGTAACAATAACTGGAAA	531
RECQLE3R	CAGGAAACAGCTATGACCGTCTGTAATTGATATGGCGGGCAA
RECQLE4F	TGTAAAACGACGGCCAGTAAAAGGTATGATGACAAAGCACTTCT	400
RECQLE4R	CAGGAAACAGCTATGACCACTTGTTTTTGCTTTGCTTAGCTAGTG
RECQLE5F	TGTAAAACGACGGCCAGTTCAACTGCAGGTAAAGCTCCTATTTCA	598
RECQLE5R	CAGGAAACAGCTATGACCGATGGCCAGTGCCCACAAGT
RECQLE6F	TGTAAAACGACGGCCAGTGGTTCCGAACATTCTGGATAACGG	524
RECQLE6R	CAGGAAACAGC TAT GAC CCACAGC T GC CAT GAT GTT T C GT
RECQLE7F	TGTAAAACGACGGCCAGTCATGAATGAAGCCCTAATCACAGAA	499
RECQLE7R	CAGGAAACAGCTATGACCGTAATAAAGCCTGCCCATCAAAGA
RECQLE8F	TGTAAAACGACGGCCAGTAATCAGGCAATTTGACGACTCAT	520
RECQLE8R	CAGGAAACAGCTATGACCGTGCTTGCTCTTCTCTGGTAAATTA
RECQLE9E10F	TGTAAAACGACGGCCAGTATGCAAGTAAGTGTCAAACTGCTA	715
RECQLE9E10R	CAGGAAACAGCTATGACCATGGCTCAGGCTCATTTCTGCTTTA
RECQLE11F	TGTAAAACGACGGCCAGTACCCTCCAACATCTGCTTTTATGG	546
RECQLE11R	CAGGAAACAGCTATGACCTGTTCATCTTTGCCTCCTGAATTTT
RECQLE12F	TGTAAAACGACGGCCAGTACCATGTGTTACAGCTGCCTGC	568
RECQLE12R	CAGGAAACAGCTAT GAC CTT GT GT GAT GT GAGAAGAAC CT GACA
RECQLE13F	TGTAAAACGACGGCCAGTGCAAAACCGTTTATTCTGTTGCAAT	510
RECQLE13R	CAGGAAACAGC TAT GAC CC CCACAAT GC TTACAGAGAC CAT
RECQLE14F	TGTAAAACGACGGCCAGTTCTAACCACTGGAACAGCAGAAA	846
RECQLE14R	CAGGAAACAGC TAT GAC CC C T C GT GAAGAT CT GGAGAAGA
RECQLE15F	TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTAGCTCCTGTATTCTTAGAACCA	529
RECQLE15R	CAGGAAACAGCTATGACCGGAATGGGAGGACTCCGTTTG

Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΙ zawierała: 1 μΙ (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdej pary starterów, 2,5 μΙ buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCI, 500 mM KCL, 15 mM MgCb, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA.

Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 94°C^25sec.

60°C 30 sec. 35 cykli

72°C 35 sec.

2. 4°C-> oo

Oczyszczanie produktów PCR: Produkty amplifikacji przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μΙ wody destylowanej i wirowano przy

PL 236 574 B1

1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μΙ H2O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 μl.

PCR sekwencyjny: Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 10 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 0,5 pmol jednego startera, 2 μl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 4 μl BigDye Terminator Ready Reaction Kit V3.0 lub V3.1 (Applied Biosystems). W reakcjach PCR sekwencyjnego stosowano startery uniwersalne M13f (5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-3') lub M13r (5'-CAG-GAA-ACA-GCTATG-ACC-3'). W przypadkach, gdy stwierdzono zmianę w trakcje sekwencjonowania z jednym starterem, wynik został potwierdzony poprzez sekwencjonowanie z drugim starterem z danej pary. Parametry sekwencyjnego PCR: wstępna denaturacja - 96°C 30 sekund 30 cykli, każdy składający się z:

denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 55°C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund

Całość produktów sekwencjonowania (20 μl) przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μl 96% etanolu oraz dodawano 1 μl kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po odwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20-30 min, po czym rozpuszczano w 4 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μl 50mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) lub ABI prism 3500XL Genetic Analyzer (Life Technologies).

Analiza mutacji RECQL c.1667 1667+3delAGTA na poziomie mRNA

Aby zbadać wpływ mutacji RECQL c.1667_1667+3delAGTA na syntezę mRNA, całkowity mRNA został wyizolowany z 3 ml świeżo pobranej krwi od 4 nosicieli mutacji c.1667_1667+3delAGTA oraz od 3 osób bez tej mutacji (kontrole) z użyciem odczynnika RNAzol® BD (Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, USA) zgodnie z zaleceniami jego producenta. Wyizolowany RNA został natychmiastowo poddany reakcji odwrotnej transkrypcji do cDNA. Reakcję przeprowadzono z wykorzystaniem gotowego zestawu Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science, Penzberg, Germany) z użyciem startera Oligo(dT) według protokołu producenta tego zestawu. Fragment cDNA genu RECQL został następnie namnożony w reakcji PCR z wykorzystaniem starterów zaprojektowanych w ten sposób aby przyłączały się na granicy eksonów. Starter pierwszy (RECmRNAf : 5' - AAGCAAATGTCGTCGTGTGT 3') był specyficzny do końców eksonów 11 oraz 12, a drugi starter (RECmRNAr: 5' - CAGCCCTGAAAGAGTTCTGC 3) był specyficzny do końców eksonów 14 oraz 15. Reakcje PCR zostały przeprowadzone w warunkach takich jak wykonywano reakcje PCR amplifikacji eksonów genu RECQL (opisane powyżej).

Produkty PCR rozdzielano za pomocą elektroforezy na 3% żelu agarozowym (Fig. 2). Produkty PCR odpowiadające amplifikowanym fragmentom cDNA genu RECQL zostały następnie zsekwencjonowane w obie strony od końca 5' oraz 3' z wykorzystaniem starterów RECmRNAf lub RECmRNAr w warunkach eksperymentalnych opisanych szczegółowo (powyżej) w części poświęconej sekwencjonowaniu regionu kodującego genu RECQL.

Wyniki

W grupie 475 kobiet z rodzinną agregacją raków piersi, u których wykonano pełne sekwencjonowanie genu RECQL stwierdzono jedną mutację zaburzającą długość białka RECQL. Była to delecja czterech nukleotydów w obrębie genu RECQL - mutacja c.1667_1667+3delAGTA, która została wykryta u dwóch niespokrewnionych osób w grupie 475 kobiet z rodzinną agregacją raków piersi.

PL 236 574 Β1

Aby dokładniej poznać znacznie funkcjonalne wykrytej zmiany oceniliśmy jej wpływ na strukturę mRNA genu RECQL. W tym celu wykonaliśmy amplifikację fragmentu mRNA tego genu u osób z mutacją RECQL oraz u osób bez tej mutacji. Badanie to udowodniło, że u osób z mutacją c.1667_1667+3delAGTA powstaje nieprawidłowy mRNA. Mutacja ta zaburza miejsce splicingowe i doprowadza do wstawienia 27 nukleotydów do sekwencji mRNA co przekłada się na delecję aminokwasu lizyny w pozycji (kodon) 555 oraz wstawienie (insercję) dziesięciu aminokwasów (aminokwasów MYKLIHYSFR) od kodonu 555 do kodonu 564 w obrębie białka RECQL. Wpływ mutacji c.1667_1667+3delAGTA na mRNA RECQL przedstawia Fig. 2.

Przedstawiono wpływ mutacji c.1667_1667+3delAGTA na poziomie mRNA RECQL. Mutacja ta zaburza miejsce splicingowe i doprowadza do wstawienia 27 nukleotydów do sekwencji mRNA co przekłada się na delecję aminokwasu lizyny w pozycji (kodon) 555 oraz wstawienie (insercję) dziesięciu aminokwasów (aminokwasów MYKLIHYSFR) od kodonu 555 do kodonu 564 w obrębie białka RECQL.

Na Fig. 2A przedstawiono fragmenty powstające w wyniku amplifikacji mRNA genu RECQL rozdzielone na 3% żelu agarozowym. Przypadki 1-3: osoby bez mutacji; widoczny jest fragment o długości 452 pz. Przypadki 4-7: nosiciele mutacji; widoczny jest fragment o długości 452 pz oraz dodatkowy (dłuższy) fragment DNA odpowiadający zmutowanemu allelowi. Przypadek 8: kontrola ujemna (bez DNA). M - marker długości.

Na Fig. 2B przedstawiono chromatogram sekwencjonowania fragmentu mRNA genu RECQL. Przedstawiona została sekwencja prawidłowa mRNA genu RECQL (zsekwencjonowany fragment widoczny na żelu w przypadku 3), a poniżej insercja 28 pz w obrębie intronu 13 (od strony końca 5') po delecji 3 nukleotydów (GTA) tego intronu oraz delecji pojedynczego nukleotydu A na końcu 3' eksonu 13.

Związek mutacji powtarzalnej genu RECQL c.1667_1667+3delAGTA z ryzykiem raka piersi w naszej populacji oceniano w badaniu asocjacyjnym obejmującym 13611 kobiet z rakiem piersi oraz 4702 kobiet zdrowych (kontroli). Mutacja ta została wykryta u 32 z 13611 kobiet z rakiem piersi (0.23%) oraz u 2 z 4702 kontroli (0.04%) (OR = 5.5; 95%CI: 1.3 - 23; p = 005). Częstość mutacji w grupie 1840 przypadków rodzinnych (z grupy przypadków kolejnych) wynosiła 9/1840 (0,49%), a więc była około 12krotnie wyższa niż w grupie kontrolnej kobiet zdrowych (OR = 11,5 95%CI: 2,5-53,5 ; p = 0.0003). Współczynnik ryzyka OR wynosił 5,7 (p = 0,008) u kobiet z rakiem zdiagnozowanym poniżej 51 r.ż. oraz wynosił 5,3 (p = 0.013) u kobiet z rakiem zdiagnozowanym powyżej 50 r.ż. Częstości mutacji oraz wartości wskaźników ryzyka (OR), w zależności od wieku przypadków oraz nowotworowego wywiadu rodzinnego przedstawia tabela 1.

Tabela 1. Częstość mutacji RECQL c.1667_1667+3delAGTA w grupie 13611 kobietz rakiem piersi; wzależności od wieku rozpoznania oraz nowotworowego wywiadu rodzinnego.

Kategoria	Liczba nosicieli	Liczebność całej grupy	%	OR	95% Cl	P
Wszystkie przypadki	32	13611	0,23%	5,5	1,3-23,5	0,005
Wiek (lata)
<50	17	6973	0,24%	5,7	1,3-24,9	0,008
>50	15	6638	0,22%	5,3	1,2-23,3	0,013
Liczba krewnych z rakiem piersi
1+	9	1840	0,49%	11,5	2,5-23,5	0,0003
2+	3	332	0,9%	21,4	3,6-128,7	<0,0001
Grupa kontrolna kobiet zdrowych	2	4702	0,04%	1,0	-	-

Wywiad rodzinny odnosi się do występowania nowotworów u krewnych pierwszego lub drugiego stopnia. Iloraz szans (OR) i wartości liczby p obliczono względem grupy kontrolnej

PL 236 574 Β1

Stwierdzono segregację mutacji RECQL z przypadkami zachorowania na raka piersi w dwóch rodzinach, w których analiza segregacji była możliwa (Fig. 3). Charakterystykę raków piersi u kobiet z i bez mutacji RECQL przedstawiono w tabeli 2. U nosicieli mutacji rozwijały się inwazyjne raki piersi o podobnej charakterystyce jak u kobiet bez mutacji RECQL.

Tabela 2. Charakterystyka kliniczna raków piersi u nosicielek mutacji c.1667_1667+3delAGTA genu RECQL oraz u osób bez tej mutacji.

Charakterystyka	Nosicielki mutacji RECQL (n = 32)	Przypadki bez mutacji RECQL (n = 13,579)	P
Liczba/całkowita liczba	%	Liczba/całkowita liczba	%
Data rozpoznania
Średnia	54.5	53.2
18-30 lat	0/32	0.0	176/13,579	1.3	0.5
31-40 lat	1/32	3.1	1295/13,579	9.5	0.3
41-50 lat	16/32	50.0	5,485/13,579	40.4	0.3
> 50 lat	15/32	46.9	6,623/13,579	48.8	1.0
Hi stołowi a
Ductale, G3	4/29	13.8	2137/10496	20.4	0.5
Ductale, Gl-2	12/29	41.4	4423 /10496	42.1	0.9
Ductale, G nieokreślony	3/29	10.3	756/10496	7.2	0.8
Medullare	1/29	3.4	287 /10496	2.7	0.8
Lobulare	5/29	17.2	1412/10496	13 5	0.7
Tubulolobulare	1/29	3.4	149/10496	1.4	0.9
DCIS	1/29	3.4	357/10496	3.4	1.0
Inna	2/29	6.9	975 /10496	9.3	0.9
ER dodatni	22/29	75.9	6987 / 9839	71.0	0.7
PR dodatni	19/29	65.5	6913/9403	73.5	0.4
Her2 dodatni	4/24	16.7	1421/7729	18.4	0.8
Wielkość guza, cm
< 1	2/27	7.4	1153/9042	12.7	0.6
1-1.9	15/27	55.5	3578/9042	39,6	0.1
2-4.9	10/27	37.0	3898/9042	43.1	0.6
>5	0/27	0.0	413/9042	4.6	0.5
Okoliczne węzły chłonne	14/27	51.8	4060/9015	45.0	0.6
Wieloogniskowość	3/27	11.1	1237/9061	13 6	0.9
Obustronność	1/31	3.2	424/ 10990	3.8	0.8
Chemioterapia przedoperacyjna	3/29	10.3	1998 / 10253	19.5	0.3

Wartość P odnosi się do porównania grupy osób z mutacją RECQL do grupy bez mutacji RECQL. Skróty: ER, receptor estrogenowy; PR receptor progesteronowy; HER2, receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność zmiany konstytucyjnej w obrębie genu RECQL, przy czym mutacją tą jest mutacja c.1667_1667+3delAGTA.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się obecność mutacji konstytucyjnej genu RECQL u kobiety, niezależnie od historii rodzinnej zachorowań na nowotwory.