PL236138B1 - Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do wykrywania wysokiego ryzyka raka prostaty poprzez zastosowanie wykrywania panelu siedmiu zmian genetycznych: mutacji genu NBS1, CHEK2, HOXB13 oraz zmiany polimorficznej w regionie 8q24 (rs188140481). Wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej wykrywającej wysokie genetycznie uwarunkowane ryzyko prostaty u mężczyzn w polskiej populacji.

We wcześniejszej pracy wykazano, że mutacja założycielska 657del5 genu NBS1 predysponuje do zachorowania na raka prostaty [patent USA nr 7,319,007 B2]. We wcześniejszej pracy wykazano również, że mutacje założycielskie genu CHEK2 obecne w polskiej populacji predysponują do zachorowania na różne nowotwory złośliwe, w tym również na raka prostaty [polskie zgłoszenie patentowe nr P.367319].

Silne dziedziczne predyspozycje do rozwoju nowotworów są w dalszym ciągu rozpoznawane tylko w niewielkiej części rodzin wysokiego ryzyka. Dlatego tylko niewielka liczba rodzin może być objęta ciągłą profesjonalną opieką, umożliwiającą znaczne ograniczenie skutków predyspozycji. W Polsce nie istnieje program badań przesiewowych w grupach wysokiego ryzyka genetycznego raka prostaty. Przyczyną takiego stanu rzeczy jest fakt, że grupa pacjentów wysokiego ryzyka raka prostaty (poza rzadkimi przypadkami silnej agregacji rodzinnej) jest trudna do identyfikacji. Przede wszystkim brak jest narzędzia diagnostycznego, które mogłoby wyodrębnić z populacji ogólnej grupę mężczyzn wysokiego ryzyka raka stercza, przy czym zidentyfikowana grupa wysokiego ryzyka powinna być na tyle liczna, aby objęcie jej opieką mogło przynieść wymierne korzyści medyczne na poziomie populacyjnym.

Problem ten rozwiązuje niniejszy wynalazek dostarczający test diagnostyczny, który pozwala na identyfikowanie dużej grupy Polaków (około 200 tysięcy osób) posiadających wysokie, uwarunkowane genetycznie, ryzyko do zachorowania na raka prostaty (na użytek niniejszego zgłoszenia jako osobę o wysokim ryzyku należy rozumieć osobę o ryzyku co najmniej 3 razy wyższym niż 8% ryzyko populacyjne, a wiec osobę o ryzyku raka prostaty powyżej 24%).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od mężczyzny, u którego w rodzinie występowało jedno lub więcej zachorowanie na raka prostaty u krewnych I i/lub II stopnia, bada się obecność siedmiu zmian konstytucyjnych: 1) mutacji 657del5 genu NBS1,2) mutacji IVS2+1G>A genu CHEK2, 3) mutacji del5395 genu CHEK2, 4) mutacji 1100delC genu CHEK2, 5) mutacji I157T genu CHEK2, 6) mutacji G84E genu HOXB13, 7) allel A zmiany rs188140481 w regionie 8q24, przy czym pacjent jest osobą pochodzenia polskiego, przy czym wykrycie występowania co najmniej jednej spośród wspomnianych zmian świadczy o istnieniu ryzyka raka prostaty powyżej 24%.

Korzystnie, obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), sekwencjonowanie lub innych metod pośredniego lub bezpośredniego wykrywania mutacji.

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty w populacji polskiej, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencje oligonukleotydów do badania następujących mutacji: 1) mutacja 657del5 genu NBS1, 2) mutacja IVS2+1G>A genu CHEK2, 3) mutacja del5395 genu CHEK2, 4) mutacja 1100delC genu CHEK2, 5) mutacja I157T genu CHEK2, 6) mutacja G84E genu HOXB13, 7) allel A zmiany rs188140481 w regionie 8q24 wskazane w tabeli 3, przy czym wykrycie występowania co najmniej jednej spośród wspomnianych zmian świadczy o istnieniu ryzyka raka prostaty powyżej 24%.

Najistotniejsze elementy prezentowanego wynalazku to:

a) wykrycie zależności pomiędzy specyficznymi zmianami genetycznymi a wywiadem rodzinnym dotyczącym występowania raka stercza - tj. wykorzystane w metodzie według wynalazku zmiany DNA wiążą się z wysokim ryzykiem raka prostaty u mężczyzn, u których w rodzinie stwierdzono co najmniej jedno zachorowanie na ten nowotwór (bez dodatniej historii rodzinnej w większości zmiany te nie są związane z wysokim ryzykiem raka stercza),

PL 236 138 B1

b) zastosowanie panelu zmian genetycznych, gdyż w pojedynkę każda z tych zmian odpowiada jedynie za pewien niewielki odsetek predyspozycji; nieoczekiwanie okazało się, że wykorzystane zgodnie z wynalazkiem zmiany genetyczne odpowiadają za ponad 20% rodzinnych agregacji raka prostaty w Polsce, a więc definiują dużą grupę mężczyzn wysokiego ryzyka, c) identyfikacja za pomocą wynalazku dużej grupy osób wysokiego ryzyka raka stercza stwarza możliwość objęcia tych mężczyzn programem badań skrynigowych i w ten sposób może doprowadzić do masowej zorganizowanej profilaktyki raka prostaty w polskiej populacji.

Nieoczekiwanie okazało się, że zastosowanie wykrywania specyficznej mutacji genu NBS1 (mutacja 657del5), czterech mutacji genu CHEK2 (mutacja IVS2+1G>A, mutacja del5395, mutacja 1100delC, mutacja I157T), specyficznej mutacji genu HOXB13 (mutacja G84E), oraz zmiany polimorficznej w regionie 8q24 (rs188140481), identyfikuje od 3- do 8-krotne zwiększone ryzyko zachorowania na raka prostaty u Polaków. Prawdopodobieństwo zachorowania i diagnozowania raka prostaty u mężczyzny do 85 roku w polskiej populacji wynosi około 8% (oszacowane na podstawie danych Krajowego Rejestru Nowotworów za rok 2009). Natomiast mężczyzna, u którego identyfikuje się predyspozycję genetyczną za pomocą nowego testu diagnostycznego, obarczony jest wysokim od 24% do 64% ryzykiem zachorowania na raka prostaty do 85 roku życia. Zgodnie z wynalazkiem ustalono, że zastosowanie badania powyższych zmian wykrywa przyczynę ponad 20% przypadków rodzinnych agregacji raka stercza w Polsce.

Metoda według wynalazku stanowi pierwszy znany panel diagnostyczny wysokiego ryzyka raka prostaty. Opracowanie testu było możliwe dopiero dzięki wykryciu szeregu zmian DNA związanych z predyspozycją do raka stercza w polskiej populacji w tym:

1) Mutacji genu NBS1: w polskiej populacji występuje powtarzalna mutacja 657del5 genu NBS1 z częstością około 0,6% w naszej populacji, a więc w Polsce żyje około 250 000 nosicieli tej mutacji genu NBS1. Innych, jednoznacznie patogennych mutacji genu NBS1 (skracających białko NBS1) nie stwierdzono w polskiej populacji.

2) Mutacji genu CHEK2: w polskiej populacji występują cztery częste powtarzalne mutacje w obrębie genu CHEK2 (IVS2+1G>A, del5395, 1100delC, I157T). Są to zmiany założycielskie pochodzące od wspólnych przodków w naszej homogennej genetycznie populacji. Mutacje te łącznie występują z wysoką częstością 6% w naszej populacji, a więc w Polsce żyje około 2,5 min nosicieli mutacji genu CHEK2.

3) Mutacji genu HOXB13: Stwierdziliśmy jedną patogenną mutację tego genu u mężczyzn z rakiem stercza w naszej populacji (mutację G84E). Stwierdziliśmy, że częstość mutacji G84E w polskiej populacji wynosi około 0,12%, a więc w Polsce żyje około 24 000 nosicieli tej mutacji.

4) Zmiany rs188140481: Stwierdziliśmy, że allel A zmiany rs188140481 w populacji polskiej jest obecny z częstością 0,4%, a więc w Polsce żyje około 80 000 nosicieli tego allela ryzyka rs188140481.

Opracowanie niniejszego testu było możliwe dzięki analizie dużych grup przypadków i kontroli z homogennej genetycznie populacji polskiej. Kluczowe w opracowaniu testu wysokiego ryzyka było odkrycie zależności pomiędzy występowaniem specyficznych zmian DNA u mężczyzn a historią rodzinną nowotworów.

Panel diagnostyczny wysokiego ryzyka opracowany został na podstawie wyników przedstawionych w przykładzie 1, które nieoczekiwanie dowodzą, że u mężczyzny, u którego w rodzinie występowało jedno lub więcej zachorowań na raka stercza u krewnych I lub II stopnia: a) nosicielstwo mutacji 657del5 genu NBS1 wiąże się z 4,5-krotnie zwiększonym ryzykiem raka stercza (p = 0,0015), co odpowiada około 36% ryzyku zachorowania na raka prostaty do 85 roku życia; b) nosicielstwo jednej z czterech mutacji genu CHEK2 (del5395 lub 1100delC lub IVS2+1G>A lub I157T) wiąże się z około 3-krotnie zwiększonym ryzykiem raka stercza (p < 0,0001), co odpowiada około 24% ryzyku zachorowania na raka prostaty; c) nosicielstwo mutacji G84E genu HOXB13 wiąże się 8-krotnie zwiększonym ryzykiem raka prostaty (p = 0,02), co odpowiada około 64% ryzyku zachorowania na raka prostaty; d) nosicielstwo allela A zmiany rs1881404 81 w regionie chromosomowym 8q24 wiąże się z około 5,4-krotnie zwiększonym ryzyka raka prostaty (p = 0,002), co odpowiada około 43% ryzyku zachorowania na raka stercza.

W podsumowaniu wyniki przedstawione w przykładzie 1 dowodzą, że ryzyko raka prostaty u nosicieli jednej siedmiu zmian DNA (657del5, IVS2+1G>A, del5395, 1100delC, I157T, G84E, rs188140481) jest wysokie, gdy w ich rodzinie występowało co najmniej jedno zachorowanie na raka

PL 236 138 B1 prostaty u krewnych I i/lub II stopnia. Wówczas ryzyko zachorowania jest zwiększone od 3 do 8-krotnie, co odpowiada wysokiemu prawdopodobieństwu, od 24% do 64%, zachorowania na raka prostaty do 85 roku życia w naszej populacji. Łącznie częstość populacyjna tych zmian DNA (składowych panelu wysokiego ryzyka) w polskiej populacji wynosi 7%, a w przypadkach rodzinnych agregacji tego nowotworu wynosi około 20%.

Sposób według wynalazku identyfikuje wysokie genetycznie uwarunkowane ryzyko raka gruczołu krokowego u Polaka, u którego w rodzinie stwierdzono jedno lub więcej zachorowań na ten nowotwór. Ogromną zaletą testu jest to, iż określa on nową grupę wysokiego ryzyka - mężczyzn z pojedynczymi zachorowaniami na raka prostaty w rodzinie, u których wykrywa się specyficzne zmiany genetyczne (mężczyźni z pojedynczymi zachorowaniami na raka prostaty w rodzinie, u których nie stwierdza się zaburzeń DNA z panelu diagnostycznego według wynalazku nie spełniają kryterium wysokiego ryzyka raka prostaty). Szacujemy, że za pomocą testu u około 20% zdrowych mężczyzn z dodatnim wywiadem rodzinnym zostanie wykryte wysokie genetycznie uwarunkowane ryzyko raka prostaty. W Polsce żyje około 200 tysięcy mężczyzn z tak zdefiniowanym wysokim ryzykiem raka starcza. Wskazania do wykonywania testu są określone - odbiorcą testu są zdrowi mężczyźni, u których w rodzinie występował rak stercza u co najmniej jednego krewnego I lub II stopnia.

Opracowanie panelu zmian DNA związanych z wysokim ryzykiem raka stercza stwarza unikalną możliwość szybkiej diagnostyki genetycznej opartej o identyfikację tych zmian DNA. Koszt testu opartego o wykrywanie wybranych mutacji charakterystycznych dla polskiej populacji jest wielokrotnie mniejszy niż koszt pełnej analizy sekwencji genów, a czas badania nieporównywalnie krótszy. Taki test może być wykonywany w wielu laboratoriach bez konieczności stosowania skomplikowanego i kosztownego sprzętu. Test genetyczny oparty o wykrywanie panelu zmian genetycznych opracowany na modelu populacji polskiej, ma zastosowanie w tej populacji.

Identyfikacja wysokiego ryzyka genetycznego ma znaczenie praktyczne, gdyż umożliwia indywidualizację postępowania medycznego, opracowanie skutecznych metod prewencji, diagnostyki i leczenia nowotworów u osób z grupy ryzyka. Najprawdopodobniej raki stercza u mężczyzn z grupy wysokiego ryzyka genetycznego powinny być wykrywane wcześnie oraz leczone radykalnie już na wczesnych etapach rozwoju, co może przyczynić się do poprawy rokowania. Zmiany DNA wchodzące w skład panelu testowego są dziedziczne, a więc obecne u nosicieli od urodzenia, a ich identyfikacja stwarza możliwość wykrycia zagrożenia rakiem stercza na wiele lat przed zachorowaniem. Tak więc zastosowanie testu stwarza możliwość objęcia mężczyzn zindywidualizowanym postępowaniem medycznym. Taki test powinien być zalecany od około 40-45 roku życia. Wykrycie zaburzenia DNA u mężczyzny byłoby wówczas wskazaniem do wykonywania regularnych badań przesiewowych raka stercza (PSA i badanie urologiczne). Zindywidualizowane postępowanie medyczne może przyczynić się do rozpoznania i leczenia tego nowotworu na wczesnych etapach rozwoju w grupie wysokiego ryzyka genetycznego, gdy wyleczenie jest możliwe.

Najistotniejszą zaletą testu jest fakt, że identyfikuje on dużą grupę mężczyzn wysokiego ryzyka raka stercza i stwarza możliwość objęcia tych mężczyzn programem badań skrynigowych. Tak więc zastosowanie testu może doprowadzić do masowej zorganizowanej profilaktyki raka prostaty w polskiej populacji (obecnie nie ma w Polsce zorganizowanej profilaktyki raka stercza). Przeprowadzenie takiego programu profilaktycznego opartego o wykrywanie mutacji założycielskich, które są obecne w homogennej genetycznie populacji polskiej nie jest możliwe w innych krajach. Dzięki realizacji programu Polska mogłaby zostać liderem wyznaczającym nowe standardy badań profilaktycznych mężczyzn wysokiego ryzyka raka stercza na świecie.

P r z y k ł a d 1. Ustalanie korelacji pomiędzy obecnością zmian konstytucyjnych genu NBS1 (mutacja 657del5), genu CHEK2 (mutacja IVS2+1G>A, mutacja del5395, mutacja 1100delC, mutacja I157T), genu HOXB13 (mutacja G84E), zmiany polimorficznej w regionie 8q24 (rs188140481), nowotworowym wywiadem rodzinnym, a ryzykiem raka prostaty w polskiej populacji.

Zasady testu, wybór grupy pacjentów

Aby ustalić ryzyko związane z występowaniem siedmiu zmian DNA (657del5, IVS2+1G>A, del5395, 1100delC, I157T, G84E, rs188140481), przeprowadzono analizę występowania tych zmian w 412 grupie mężczyzn z rakiem prostaty, u których co najmniej jeden krewny I lub II stopnia chorował na ten nowotwór (ta grupa przypadków rodzinnych pochodziła z serii 3750 mężczyzn z nieselekcjonowanym rakiem stercza w wieku od 41 do 96 lat (średnia 68.8 lat), zdiagnozowanych w latach od 1999 do 2012 w 14 szpitalach w Polsce).

PL 236 138 B1

W grupie badanej 412 przypadków rodzinnych zdecydowanie dominowali mężczyźni z rakiem stercza, których tylko jeden krewny chorował na ten nowotwór (87%; 358 mężczyzn), a mniejszość stanowili mężczyźni, których dwóch krewnych chorowało na ten nowotwór (12% - 49 mężczyzn); jedynie 5 mężczyzn (1%) podawało zachorowanie na raka stercza u 3 lub więcej krewnych I i/lub II stopnia. Średnia wieku mężczyzn z grupy badanej wynosiła 66.3 lat (od 41 do 90 lat). Od 412 mężczyzn z rakiem prostaty z dodatnim wywiadem rodzinnym wyizolowano genomowy DNA z próbek krwi obwodowej oraz wykonano analizę siedmiu zmian DNA. Informatywny wynik badania wszystkich siedmiu zmian DNA uzyskano w 392 z 412 (95,1%) badanych próbek DNA.

Grupę kontrolną stanowiło 1648 zdrowych mężczyzn (bez raka stercza) z polskiej populacji w wieku od 40 do 92 lat (średnia wieku 64.1 lat). Grupa kontrolna była sparowana co do wieku (+/- 3 lata) z grupą badaną 412 mężczyzn z rakiem stercza (w ten sposób dla każdego mężczyzny z rakiem stercza dobrano 4 zdrowe kontrole). Od osób z grupy kontrolnej również wyizolowano genomowy DNA z próbek krwi obwodowej. Informatywny wynik badania wszystkich siedmiu zmian DNA uzyskano w 1570 z 1648 (95,3%) osób z grupy kontrolnej.

Izolacja genomowego DNA

Od wszystkich pacjentów pobrano próbkę krwi obwodowej. Do probówek zawierających 1 ml 1 M wersenianu sodu pobierano 10 ml krwi obwodowej. W celu rozbicia błony komórkowej do próbek dodawano roztwór TKM (10 mM Tris-HCL, 10 mM KCL, 2 mM EDTA, 4 mM MgCh) i 1 ml Igepal (SIGMA). Następnie próbkę wirowano w temp. 20°C przez 10 minut przy 3400 obr./min. (w wirówce Eppendorf 5810R). Po odwirowaniu zlewano supernatant zostawiając osad leukocytów, który następnie zalewano roztworem TKM i rozbijano ręcznie. Powstałą mieszaninę wirowano przy 3400 obr. w temp. 20°C przez 5 minut. Supernatant zlewano a powstały osad przepłukiwano dwukrotnie roztworem TKM. Następnie dodawano 0,5 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) i całość mieszano pipetą Pasterowską. W następnym etapie w celu rozbicia kompleksów białko-DNA próbkę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez 7 minut. Białko z roztworu wytrącano dodając 1 ml 5 M NaCl. Tak przygotowaną mieszaninę wirowano w temp. 20°C, przy 9900 obr./min. przez 25 minut. Powstały supernatant przenoszono do odrębnej probówki. Z roztworu supernatantu wytrącano DNA dodając 10 ml 96% alkoholu etylowego. Wytrącony „kłaczek” DNA przenoszono do probówki i suszono w suszarce próżniowej przez 10 minut. DNA rozpuszczano w 200 gl TE (25 Mm Tris, HCL, 1 Mm EDTA; pH 8,4) i przechowywano w 4°C.

Wykrywanie mutacji 657del5 genu NBS1

Mutację 657del5 wykrywano za pomocą ASO-PCR z wykorzystaniem primerów: Nbsex6f 5'CACCTCTTGATGAACCATCT; Nbsex6r 5'CGTTAACAACTACTGATAAGAG; Nbsdel5 5'GGCCGGCAGGAAAGAAATCTT. Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 gl zawierała: 1 gl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 gl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCL, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 gM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 94°C ^ 10 min.

2. 94°C ^ 25 sek. 9 cykli

68°C do 56°C > 25 sek. (obniżana temp. o 1,4°C w każdym cyklu) 72°C ^ 35 sek.

3. 94°C ^ 25 sek.

56°C ^ 30 sek. 31 cykli

72°C ^ 35 sek.

4. 4°C ^ »

Następnie, 15 gl produktu PCR rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 gg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. W przypadkach z mutacją uwidaczniał się dodatkowy produkt PCR zawierający delecję 5 nukleotydów. Obecność mutacji wykrytych w analizach ASO-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji IVS2+1G>A genu CHEK2

Mutację IVS2+1G>A wykrywano za pomocą techniki RFLP-PCR z użyciem enzymu Hpy 188III (New England Biolabs). Reakcję PCR przeprowadzono z parą starterów Ch2/3f 5’-TT TAT GAG CAA

PL 236 138 B1

TTT TTA AAC G i Ch2/3r 5’-CC AGT AAC CAT AAG ATA ATA ATA TTA C w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΙ zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100 mM TrisHCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCL, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 μM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 94°C ^ 5 min.

2. 94°C ^ 30 sek. 35 cykli

58°C ^ 45 sek.

72°C ^ 60 sek.

3. 4°C ^ »

Trawienie produktów PCR przeprowadzono w 37°C przez 16 godzin w objętości 20 μl zawierającej: 5 μl produktu PCR, 1 x NE Buffer 4 (New England Biolabs) oraz 2U enzymu Hpy188III. Następnie, 15 μl strawionego produktu rozdzielano na 2% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 30 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Produkt PCR był trawiony w przypadkach z mutacją. Obecność mutacji w próbkach dodatnich w analizach RFLP-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji 1157T genu CHEK2

Mutacja I157T była analizowana za pomocą RFLP-PCR z użyciem enzymu Pstl (New England Biolabs). Reakcję PCR przeprowadzono z parą starterów Ch157F (5’- A CCC ATG TAT CTA GGA GAG CTG) oraz Ch157R (5’-CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT GCA). Za pomocą startera Ch157R wprowadzono sztuczne miejsce restrykcyjne dla enzymu Pstl. Zastosowano warunki eksperymentalne amplifikacji PCR takie jak powyżej dla amplifikacji mutacji IVS2+1G>A.

Trawienie produktów PCR przeprowadzono w 37°C przez 16 godzin w objętości 20 μl zawierającej: 5 μl produktu PCR, 1 x NE Buffer 3 (New England Biolabs) and 2U enzymu Pstl. Następnie, 15 μl strawionego produktu rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Produkt PCR był trawiony w przypadkach z mutacją. Obecność mutacji w próbkach dodatnich w analizach RFLP-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji 1100delC genu CHEK2

Mutację 1100delC wykrywano za pomocą ASO-PCR z wykorzystaniem primerów Chk2ex10f (5'-TTAATTTAAGCAAAATTAAATGTC), Chk2ex10r (5'-GGCATGGTGGTGTGCATC) i Chk2delC (5'-TGGAGTGCCCAAAATCATA). Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCL, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 μM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 94°C ^ 10 min.

2. 94°C ^ 25 sek. 9 cykli

68°C do 55°C > 5 sek. (obniżana temp. o 1,4°C w każdym cyklu)

72°C ^ 35 sek.

3. 94°C ^ 25 sek.

55°C ^ 30 sek. 31 cykli

72°C ^ 35 sek.

4. 4°C ^ »

Następnie, 15 μl produktu PCR rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. W przypadkach z mutacją uwidaczniał się dodatkowy produkt PCR zawierający delecję nukleotydu C. Obecność mutacji wykrytych w analizach ASO-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

PL 236 138 B1

Wykrywanie mutacji del5395 genu CHEK2

Mutację del5395 wykrywano za pomocą metody muliplex-PCR z wykorzystaniem primerów (CHLdel2F TGT AAT GAG CTG AGA TTG TGC; CHLc2R CAG AAA TGA GAC AGG AAG TT, CHLdelR GTC TCA AAC TTG GCT GCG; CHLcF CTC TGT TGT GTA CAA GTG AC). Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 gl zawierała: 1 gl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 gl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 gM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

1. 94°C ^ 10 min.

2. 94°C ^ 25 sek. 9 cykli

68°C > do 55°C > 25 sek. (obniżana temp. o 1,4°C w każdym kolejnym cyklu) 72°C ^ 35 sek.

3. 94°C ^ 25 sek.

55°C ^ 30 sek. 31 cykli

7°C ^ 35 sek.

4. 4°C ^ »

Następnie, 15 gl produktu PCR rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 gg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. W przypadkach z mutacją uwidaczniał się dodatkowy produkt PCR zawierający delecję 5395 pz. Obecność mutacji w próbkach dodatnich w analizach multiplex-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.

Wykrywanie mutacji G84E genu HOXB13

Mutację G84E wykrywano za pomocą PCR czasu rzeczywistego z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych typu TaqMan: HOX_VIC [VIC]CCGCCTTCAAAGTA[NFQ]; HOX_FAM [FAM]CCGCCTCCAAAGTA[NFQ]; HOX_F 5’GCTCCCGTGCCTTATGGT; HOX_R 5’[FAM]CCGCCTCCAAAGTA[NFQ]. Reakcję PCR przeprowadzano w urządzeniu LightCycler® 480 II ( Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Mieszanina reakcyjna o objętości 5 gl zawierała: 1 gl (10 ng) genomowego DNA, po 2,5 gl Probe Master (x2) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 0,0625 gl Genotyping Assay (80x) (Applied Biosystems/Life Technologies), 1,4375 gl H2O PCR Grade (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Analogicznie przygotowano kontrole ujemne, które nie zawierały DNA. Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

Format detekcji: Dual Color Hydrolysis Probe / UPL Probe

1. 95°C ^ 10 min.

2. 95°C ^ 10 sek. 40 cykli

60°C ^ 30 sek.

72°C ^ 1 sek.

3. 40°C ^ 30 sek.

4. 60°C ^ 1 sek.

60°C do 61 °C > 16.7 sek. (temp. podwyższana o 0,06°C na sek.) - odczyt fluorescencji.

Wyniki były analizowane przy użyciu programu LightCycler® 480 II Instrument Software version 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).

Wykrywanie zmiany polimorficznej rs188140481 w regionie 8q24

Polimorfizm rs188140481wykrywano za pomocą PCR czasu rzeczywistego z wykorzystaniem metody iFRET-HRMA z wykorzystaniem oligonukleotydów: rs188_ROX - GCATATATAAAATATA CGAAACAAAA[ROX], rs188_F: 5’ ATTAAGCAAATTTACAGCAAAGA; rs188_R: 5’ ACTTTCCACTGCTCTTCAAT. Reakcję PCR przeprowadzano w urządzeniu LightCycler® 480 II ( Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Mieszanina reakcyjna o objętości 5 gl zawierała: 1 gl (10 ng) genomowego DNA, 0,5 gl LightCycler Genotyping Master (x2) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 0,25 gM startera rs188_R, 0,025 gM startera rs188_F, 0,15 gM sondy fluorescencyjnej rs188_ROX, 0,3 gM barwnika fluorescencyjnego SYTO9, 3 mM MgCl2 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 2.975 gl H2O PCR Grade (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.

PL 236 138 B1

Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

Format detekcji: Syto9 / ROX

1. 95°C ^ 5 min.

2. 95°C ^ 10 sek. 10 cykli

72°C > 62°C > 2 sek. (obniżana temp. o 1°C w każdym kolejnym cyklu)

72°C ^ 3 sek.

3. 95°C ^ 10 sek. 40 cykli

62°C ^ 2 sek.

72°C ^ 3 sek.

4. Analiza krzywych topnienia

95°C > 1 min.

35°C ^ 40 sek.

35°C do 73°C > 272 sek. (wzrost temp. o 0,14°C na sek.) - odczyt fluorescencji.

Wyniki były analizowane przy użyciu programu LightCycler® 480 II Instrument Software version 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).

Potwierdzenie obecności mutacji przez sekwencjonowanie

Amplifikację sekwencji zawierającej badane zmiany DNA przeprowadzono z użyciem starterów wykorzystanych do wykrywania poszczególnych mutacji, które są przedstawione powyżej. Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdej pary starterów, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA. Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:

a) wstępna denaturacja - 95°C 5 minut

b) 35 cykli składających się z:

denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 53-58°C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund

Oczyszczanie produktów PCR: Produkty amplifikacji przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μl wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μl H2O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 μΕ

PCR sekwencyjny: Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol jednego startera, 4 μl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 μl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W przypadkach gdy stwierdzono zmianę w trakcje sekwencjonowania z jednym starterem, wynik został potwierdzony poprzez sekwencjonowanie z drugim starterem z danej pary.

Parametry sekwencyjnego PCR: wstępna denaturacja - 96°C 30 sekund 30 cykli, każdy składający się z:

denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 55°C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund

Całość produktów sekwencjonowania (20 μθ przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μl 96% etanolu oraz dodawano 1 μl kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po odwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20-30 min, po czym rozpuszczano w 4 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μl 50 mM EDTA, 0,05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty

PL 236 138 B1 denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems).

Wyniki

Wyniki asocjacji mutacji genów NBS1, CHEK2, HOXB13 oraz zmiany polimorficznej w regionie 8q24 (rs188140481) z ryzykiem raka prostaty przedstawiono w tabeli 1 i opisano poniżej:

Mutacja genu NBS1

Mutację skracającą białko genu NBS1 (mutację 657del5) wykryto w 10 z 392 mężczyzn z rakiem stercza w porównaniu do 9 z 1570 osób z grupy kontrolnej (OR = 4,5, p = 0,001). Tak więc ryzyko zachorowania na raka gruczołu krokowego u nosiciela mutacji 657del5 u którego w rodzinie stwierdzono co najmniej zachorowanie na ten nowotwór jest zwiększone około 4,5 krotnie (w porównaniu do ryzyka populacyjnego). Na tej podstawie można oszacować, że u takiego nosiciela mutacji NBS1 ryzyko zachorowania do 85 roku życia wynosi około 36%.

Mutacja genu CHEK2

Jedną z mutacji genu CHEK2 (IVS2 +1G> A lub 1100delC lub del5395 lub I157T) wykryto w 59 z 392 mężczyzn z rakiem stercza w porównaniu do 88 z 1570 osób z grupy kontrolnej (OR = 3,0, p = 0,001). Wartości ryzyk dla poszczególnych mutacji wahała się w granicach od 2.6 do 5.4. Asocjacja dla każdej mutacji była istotna statystycznie. Tak więc, ryzyko zachorowania na raka gruczołu krokowego u nosiciela jednaj z czterech mutacji CHEK2, u którego w rodzinie stwierdzono co najmniej zachorowanie na ten nowotwór średnio jest zwiększone około 3 krotnie. Na tej podstawie można oszacować, że u takiego nosiciela mutacji CHEK2 w populacji polskiej ryzyko zachorowania do 85 roku życia wynosi około 24%.

Mutacja genu HOXB13

Mutację genu HOXB13 (mutację G84E) wykryto w 4 z 392 mężczyzn z rakiem stercza w porównaniu do 2 z 1570 osób z grupy kontrolnej (OR = 8,1, p = 0,02). Tak więc ryzyko zachorowania na raka gruczołu krokowego u nosiciela mutacji G84E u którego w rodzinie stwierdzono co najmniej zachorowanie na ten nowotwór jest zwiększone około 8 krotnie (w porównaniu do ryzyka populacyjnego). Na tej podstawie można oszacować, że u takiego nosiciela mutacji genu HOXB13 ryzyko zachorowania do 85 roku życia wynosi około 64%.

Allel A zmiany rs188140481

Allel A (allele ryzyka) zmiany rs188140481 w regionie 8q24 wykryto u 8 z 392 mężczyzn z rakiem stercza w porównaniu do 6 z 1570 osób z grupy kontrolnej (OR = 5,4, p = 0,002). Tak więc ryzyko zachorowania na raka gruczołu krokowego u tego allela u którego w rodzinie stwierdzono co najmniej zachorowanie na raka stercza jest zwiększone około 5,4 krotnie (w porównaniu do ryzyka populacyjnego). Na tej podstawie można oszacować, że u takiego nosiciela allela A zmiany r188140481 ryzyko zachorowania do 85 roku życia wynosi około 43%.

Łącznie predysponujące zmiany DNA (jedną z 7 zmian) wykryto aż u 20,4% z 392 mężczyzn z rodzinnym rakiem prostaty. Wszystkie stwierdzone wartości OR dla poszczególnych genów oraz zmiany w regionie 8q24 znajdują się w granicach od 3 do 8 i wszystkie były statystycznie istotne. Powyższe wartości OR odpowiadają ryzyku zdiagnozowania raka stercza do 85 roku życia od 24% do 64% u mężczyzn w Polsce (istotnie więcej niż 8% ryzyko populacyjne). Obecność wszystkich zmian DNA w grupie badanej i kontrolnej została potwierdzona za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania metodą Sangera.

W podsumowaniu można oszacować, że ryzyko zdiagnozowania raka stercza do 85 roku życia u mężczyzny z dodatnim wywiadem rodzinnym (co najmniej jeden krewny I lub II stopnia z rakiem prostaty) u którego stwierdzi się predysponującą zmianę DNA (z rzeczonego panelu 7 zmian) jest wysokie i wynosi od 24% do 64% w zależności od rodzaju predysponującego zaburzenia DNA.

PL236 138 Β1

Tabela 1. Asocjacja mutacji genów NBS1, CHEK2, ΗΟΧΒ13 oraz zmiany polimorficznej rs188140481 w regionie 8q24 z ryzykiem raka prostaty

Zmiana DNA	Grupa badana* (n = 392)	Grupa kontrolna** (n= 1570)	OR	95% CI	Liczba p
	Liczba nosicieli	%	Liczba nosicieli	%
Mutacja NBS1 657del5	10	2,6%	9	0,6%	4.5	1.8-11,3	0.0015
Mutacja CHEK2***	59	15,1%	88	5,6%	3.0	2.1-4.2	<0.0001
HOOdelC	4	1,0%	3	0,2%	5.4	1.2-24.2	0.03
IVS2+1G>A	7	1,8%	8	0,5%	3.6	1.3-9.8	0.02
De15395	5	1,3%	6	0,4%	3.4	1.02-11.1	0.05
I157T	43	11,0%	71	4,5%	2.6	1.8-3.9	<0.0001
Mutacja ΗΟΧΒ13 G84E	4	1,0%	2	0,1%	8.1	1.5-44.3	0.02
rsl88140481 Allel A	8	2,0%	6	0,4%	5.4	1.9-15.7	0.002
Predysponująca zmiana DNA****	80	20,4%	105	6,7%	3,6	2.6-4.9	<0.0001

Legenda:

* Grupa badana - grupa mężczyzn z rakiem prostaty, u których co najmniej jeden krewny I lub II stopnia chorował na ten nowotwór * * Grupa kontrolna - zdrowi mężczyźni z polskiej populacji sparowani co do wieku (+/- 3 lata) do wieku diagnozy mężczyzn z grupy badanej; w^r stosunku 4 kontrole na 1 chorego z rakiem.

* ** Mutacja CHEK2 - HOOdelC lub IVS2+1G>A lub del5395 lub I157T * *** Predysponująca zmiana DNA - obecność jednej z siedmiu badanych zmian DNA

Częstość zmian DNA w gmpie kontrolnej jest stosowana do obliczenia wartości OR za pomocą testu Fiszera (Fishcr cxact test)

PL236 138 Β1

Tabela 2. Fragmenty sekwencji ludzkiego DNA zawierające:

a) mutację 657del5 genu NBS1 (sekwencja ulegająca delecji jest podkreślona):

AAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAAACAAA.TCTTCAAAGGG

AAAACATTTATATTTTTGAATGCCAAACAGGTAATTATGTTATAAGCTAA

b) mutację IVS2+1G>A genu CHEK2 (miejsce substytucji G>A jest zaznaczone)

AAATACCGAACATACAGCAAGAAACACTTTCGGATTTTCAGGATAGGTAA

TGAATACCCATGTATCTAGGAGAGCTGGTAATTTGGTCATTGTTTTTAGA

c) mutację II57T genu CHEK2 (miejsce substytucji T>C jest zaznaczone)

TCTATTTTAGGAAGTGGGTCCTAAAAACTCTTACACTGCATACATAGAAG

ATCACAGTGGCAATGGAACCTTTGTAAATACAGAGCTTGTAGGGAAAGGA

d) mutację 1 lOOdelC genu CHEK2 (nuklcotyd C ulegający delecji jest podkreślony)

TATGTTAATCTTTTTATTTTATGGCAAGTTCAACATTATTCCCTTTTGTA

CTGAATTTTAGATTACTGATTTTGGGCACTCCAAGATTTTGGGAGAGACC

TCTCTCATGAGAACCTTATGTGGAACCCCCACCTACTTGGCGCCTGAAGT

e) mutację del5395 genu CHEK2 (w zaznaczonym miejscu brakuje fragmentu o długości 5395 nukleotydów)

GGCTGTAATGAGCTGAGATTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGACAATGGG

AGTGAGACTCTGCCTCAAACCTGGCCAACATGGCAAAAAATACAAAAATT

TAGCTGGGCATGGTGGTGGGTGTCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGAC

f) mutację G84E genu Η0ΧΒ13 (miejsce substytucji C>T jest zaznaczone)

GGCCAGGGTGGCTGCCTGGGCACAGGGTTTCAGCGAGCTCCGGGACACTCGGCA GGAGTAGTACCCGCCTTCAAAGTAACCATAAGGCACGGGAGCTGGGGACGTCCC CTGGGGCACCCCAGGGCATGGGTGGCATTGCTTTGGCGGCTCCGCCGAGCCTGGC

g) allel ryzyka zmiany rs 188140481 (allel A jest zaznaczony)

CAAGGAAAGATAATTTTCCTATTTAAAATTAAGCAAATTTACAGCAAAGATCAAT ATAAAATCCAAGCATATATAAAATAAACGAAACAAAAAAATGCCATCAGCGTCT ATCCTTCAGTAATGAAAAATTACTCTTTCCGTTATTGAAGAGCAGTGGAAAGTAA

PL236 138 Β1

Tabela 3. Oligonukleotydy wykorzystane w teście

nazwa	Sekwencja 5’-> 3’
Nbsex6f	CACCTCTTGATGAACCATCT
Nbsex6r	CGTTAACAACTACTGATAAGAG
Nbsdel5	GGCCGGCAGGAAAGAAATCTT
Ch2/3f	TT TAT GAG CAA TTT TTA AAC G
Ch2/3r	CC AGT AAC CAT AAG ΑΤΑ ΑΤΑ ATA TTA C
Chl57F	A CCC ATG TAT CTA GGA GAG CTG
Chl57R	CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT GCA
Chk2exl0f	TTAATTTAAGCAAAATTAAATGTC
Chk2cxl0r	GGCATGGTGGTGTGCATC
Chk2delC	TGGAGTGCCCAAAATCATA
CHLdel2F	TGT AAT GAG CTG AGA TTG TGC
CHLc2R	CAG AAA TGA GAC AGG AAG TT
CHLcF	CTC TGT TGT GTA CAA GTG AC
HOX_VIC	[VIC]CCGCCTTCAAAGTA[NFQ]
HOX_FAM	[FAM] CCGCCTCC A A AGTA [NFQ]
HOX_F	GCTCCCGTGCCTTATGGT
HOX_R	[FAM]CCGCCTCCAAAGTA[NFQ]
rsl88_ROX	GCATATATAAAATATA CGAAACAAAA[ROXJ
rsl88_F	ATTAAGCAAATTTACAGCAAAGA
rsl88_R	ACTTTCCACTGCTCTTCAAT

PL 236 138 B1

Claims (3)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od mężczyzny, u którego w rodzinie występowało jedno lub więcej zachorowań na raka prostaty u krewnych I i/lub II stopnia, bada się obecność siedmiu zmian konstytucyjnych: 1) mutacji 657del5 genu NBS1, 2) mutacji IVS2+1G>A genu CHEK2, 3) mutacji del5395 genu CHEK2, 4) mutacji 1100delC genu CHEK2, 5) mutacji I157T genu CHEK2, 6) mutacji G84E genu HOXB13, 7) allel A zmiany rs188140481 w regionie 8q24, przy czym pacjent jest osobą pochodzenia polskiego, a wykrycie występowania co najmniej jednej spośród wspomnianych zmian świadczy o istnieniu ryzyka raka prostaty powyżej 24%.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), sekwencjonowanie lub innych metod pośredniego lub bezpośredniego wykrywania mutacji.

3. Zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty w populacji polskiej, znamienny tym, że zawiera posiadające sekwencje wskazane w tabeli 3 oligonukleotydy do badania następujących mutacji: 1) mutacja 657del5 genu NBS1,2) mutacja IVS2+1G>A genu CHEK2, 3) mutacja del5395 genu CHEK2, 4) mutacja 1100delC genu CHEK2, 5) mutacja I157T genu CHEK2, 6) mutacja G84E genu HOXB13, 7) allel A zmiany rs188140481 w regionie 8q24, przy czym wykrycie występowania co najmniej jednej spośród wspomnianych zmian świadczy o istnieniu ryzyka raka prostaty powyżej 24%.