JPH10500860A

JPH10500860A - 小児脊髄性筋萎縮症の遺伝子座に連結したマーカーの検出方法およびプローブ

Info

Publication number: JPH10500860A
Application number: JP8500453A
Authority: JP
Inventors: メルキ，ジュディス; ミュニック，アルノルド
Original assignee: アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシェ・メディカル
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 1998-01-27
Also published as: WO1995033852A1; EP0763136A1; CA2191880A1; FR2720757A1; AU693562B2; US6040142A; EP0763136B1; AU2676695A; FR2720757B1; DE69506704D1; ATE174634T1; DE69506704T2

Abstract

(57)【要約】小児脊髄性筋肉萎縮症（ＳＭＡ）において関与しており、かつ、該疾患を罹患しているか、該疾患の疑いがある患者あるいは胎児から得た遺伝子を含有しているとされている染色体領域の、それが存在か、不在か、のいずれかによる試験方法。この発明方法は、該ヒトあるいは胎児からの染色体ＤＮＡサンプルを、５ｑ１３染色体領域における多形性マーカーを認識できるＤＮＡ鎖と、その鎖を伸長させ、かつ該マーカーの反復配列を超えさせる増幅条件下で接触させて、その後、その個々の長さを基礎として得られた伸長された鎖どうしを識別して該マーカーの数のそれぞれのデータを得ることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】小児脊髄性筋萎縮症の遺伝子座に連結したマーカーの検出方法およびプローブ小児脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、膵線維症の後に最も頻繁に発生する（発生率：１／６，０００）致死的常染色体性劣性遺伝子疾患群の代表的なものである（１）。ＳＭＡは、筋萎縮に付随する四肢および脳幹の進行性麻痺をひき起こす脊髄の前角の運動ニューロンの変性によって特徴づけられる。小児脊髄性筋萎縮症は、症状の開始時の年令およびその進行性に応じて、Ｉ型、II型およびIII型と呼ばれるカテゴリに分類される（２）。Ｉ型の脊髄性筋萎縮症は、新生児および乳幼児にしか見られないということを喚起しておきたい。これは最も重症のタイプであり、これらの子供の平均余命は、数年未満である。 II型の脊髄性筋萎縮症は、同様に、罹患した小児の生後１年目から発症するが、それは小児が座位姿勢を獲得してから後のことである。この場合、小児はもはやほとんど立ち上がることができず、生存は、良くても青年期に達するぐらいまでである。最後に、III型の脊髄性筋萎縮症は、歩行を始めた小児に現われ、上述の症状はこの場合より緩慢に進行する。往々にして必要とされる特異性を示さない徴候である、疾患の発症の臨床的および準臨床的徴候に基づく診断（筋電図検査および筋肉生検）を除いて、制限された数の症例においてのみであれ、同等の診断を可能としてくれるその他の方法は存在しない。当然のことながら、臨床医は、リスクありとみなされた患者また新生児医学では胎児におけるこの疾患の将来の出現を予想することに関しては、なおさら無防備である。この疾患の生化学的異常についてはまだわかっていない。それでも、３つの形態のＳＭＡの原因となる遺伝子は、遺伝子結合分析によって、染色体５ｑ１１．２−ｑ１３．３（３−６）上に位置決定されており、このためこれは対立遺伝子疾患であると思われる。最近になって、ＳＭＡの原因である遺伝子は、第５染色体上の近接した遺伝子座Ｄ５Ｓ６２９およびＤ５Ｓ６３７によって規定される２センチモルガン（cM）の間隔の中に位置付けられた（７）。この染色体由来の複数のフラグメントが、酵母人工染色体またはＹＡＣ（対応する英語表現「Yeast Artificial Chromosomes」の略）の中でクローニングされた。領域５ｑ１３のＹＡＣの複数の整列群（contig）について、記述がなされてきた。この「領域５ｑ１３の整列群」という表現は、互いに重なり合うものとみなすことのできる領域５ｑ１３のフラグメントで形成されたインサートをもつＹＡＣ全体（アセンブリ）のことを意味し、このフラグメント全体は、それでも領域５ｑ１３の全部を網羅している。これらの整列群の１つは、約３．２Mbをカバーする重なり合った７つのＹＡＣから成り（１３）、もう１方は２Mbの領域をカバーする重なり合った１０個のＹＡＣで構成されている（１４）。しかしながら、今日までに知られているマーカーのいずれも、可能なその検出と疾病の臨床的徴候の間の、たとえ部分的であろうと信頼性の高い相関関係を樹立することを可能にしてはくれなかった。本発明は、より詳細には、領域５ｑ１３が、可変的な数の反復配列を除いて、ほぼ同一のヌクレオチド配列を有する複数の遺伝子座を含んでおり、この領域に特徴的な多形性マーカーを同じ位形成したという発見事実に基づいている。このマーカーの多形性は、これらのマーカーを弁別し、時としてこれらを対象被験者の親がもつマーカーに相関関係づけし、または逆にそれらが対象となりうる突然変異または欠失の新規の性質を同定する我々の能力の源泉となるものである。同様に、或る種の症例において、特にＩ型のＳＭＡの臨床診断の適切性の確証をそこに見い出すか、または時として、例えば新生児医学においておよび兄弟姉妹に疾病の先例がある場合にそれを排除するという形で以来我々が手に入れた能力の源泉となっているのも、この多形性なのである。これらの新しいＤＮＡマーカー、より特定的には、多形性（マイクロサテライト）マーカーは、４MbのＹＡＣの中に含有され、（７）により同定された２cMの前記間隔内に含有されたフラグメントの分割によって、同定された。この分割は、フランス、パリのCentre d'Etudes du Polymorphisme Humain(CEPH)「ヒト多形性研究所」のＹＡＣバンクを使用し、しかも第１世代のＹＡＣ７５５Ｂ１２（マーカーＡＦＭ２６５ｗｆ５を含む）および７５１Ｅ３（マーカーＡＦＭ２８１ｙｈ９を含む）を利用して、以前に記述された（８）三次元方法（３ｄ）に従って各マーカーの特異的プライマーの間のＰＣＲ増幅によって、実施された。以前に記述された方法（１２）に従った染色体歩行により、先行するＹＡＣと重なり合いかつ新しい多形性ＤＮＡマーカー（マイクロサテライト）を含む新しいＹＡＣの同定が可能となった。特に、これは以下のように進めた。グループ予め実施された高解像度の遺伝子地図によって、ＳＭＡ遺伝子座と最も近接した多形性遺伝子座（Ｄ５Ｓ６２９およびＤ５Ｓ６３７）の間の組換え事象を認知することができた（７）。鍵となる組換えを有する９つのグループの遺伝分析を、新しい多形性マーカーで行った。つまり、同血統のグループ（ｎ＝５）または、複数の罹患被験者を含むグループ（ｎ＝４）である。この遺伝分析は、減数分裂組換え事象の数を最小限におさえながら樹立された、最も本当らしいハプロタイプの構築から成るものであった。ＹＡＣバンクの分割以前に記述された（８）３次元（３ｄ）方法に従って各マーカーの特異的プライマーの間でＰＣＲ増幅することによりＣＥＰＨのＹＡＣバンクを分割した。マイクロサテライトマーカーを含むＹＡＣの遺伝子型を、変性ポリアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ産物の電気泳動によって確立し、帯電したナイロンメンブラン上に移し、³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチド(ＣＡ)_nまたは(ＣＴ)_nとハイブリダイズさせた。ジヌクレオチド反復の検出を、記述された方法（９）によって実施した。パルスフィールド電気泳動の後、ＹＡＣのサイズを推定した。選択されたＹＡＣに基づくマーカーの生成「ＳＥＡＰＬＡＱＵＥＧＴＧ１％」のブランドで知られているアガロースゲルパルスフィールド電気泳動の後、酵母染色体からＹＡＣのＤＮＡを分離した。ｂアガラーゼによる処理の後、エタノール中でＤＮＡを沈降させた。制限酵素Ｓａｕ３Ａによって、合計３００ngのＹＡＣを消化し、次にこれを部分的に修復してから、バクテリオファージＭ１３内で部分的に修復されたＳａｌ１部位でこれをクローニングした。反復（ＣＡ）または（ＣＴ）を含有するクローンＭ１３は、³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチド（ＣＡ）２０または（ＣＴ）２０による分割によって検出できた。このとき、陽性クローン（matrices positires）を配列決定した（１０）。反復（ＣＡ）または（ＣＴ）に近接するオリゴヌクレオチドプライマーが選択された。第５染色体の体細胞ハイブリッドパネルのＤＮＡのＰＣＲ増幅の後、マーカーの染色体位置を決定した。このパネルは、唯一のヒト染色体として第５染色体全体を含む細胞系ＨＨＷ１０５、領域５ｑ１１−ｑ１４内に欠失した第５染色体を含む細胞系ＨＨＷ１０６４、および第５染色体ｐを含む細胞系ＨＨＷ２１３を含んでいる（１１）。多形性遺伝子座は、親戚関係にない５人のコントロール個体をテストすることによって認知された。非多形性マーカーをＳＴＳ（英語表現「Sequence tagged Site」つまり配列標識付け部位の略）として利用した。染色体歩行この歩行は、選択されたＹＡＣから、ＡＬＵタイプの中程度に反復された配列の中から選択されたオリゴヌクレオチドＡ３３の間で生成されたＰＣＲ増幅産物を利用した。これらの産物は、以前に記述された（１２）方法に従った先行のものと重なり合う新しいＹＡＣの選択を可能にした。このとき新たに、新しい多形性ＤＮＡマーカーがこれらのＹＡＣから分離された。この染色体歩行は、先行のものと重なり合う新しいＹＡＣの同定を可能にし、このとき新しいＤＮＡマーカーが分離された。同定された２８のマーカーのうち、９つは、第５染色体の短い腕の上にも存在し第５染色体ｐの上の領域５ｑ１３の部分的重複の存在を実証していたことから、除外された（表１）。重なり合う可能性のあるＹＡＣを選択するため、領域５ｑ１３の１９の特異的マーカーが選定された。そのうちの９つのマーカーは、領域５ｑ１３内で複数の遺伝子座を検出する（表１）。実際には、４つの多形性マイクロサテライトマーカー［Ｃ２１２（Ｄ５Ｆ１４９Ｓ１−Ｓ２）、Ｃ２７１（Ｄ５Ｆ１４８Ｓ１−Ｓ２）、Ｃ２７２（Ｄ５Ｆ１５０Ｓ１−Ｓ２）、Ｃ１７１（Ｄ５Ｆ１５１Ｓ１−Ｓ２）］が２つの増幅産物の存在を明らかにし、１つのマーカー［Ｃ１６１（Ｄ５Ｆ１５３Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）］が、体細胞ハイブリッドＨＨＷ１０５上の３つの増幅産物を明らかにした。そのうちのいずれも、領域５ｑ１３の外に位置決定されなかった。これらの結果は、マーカーＣ２１２、Ｃ２７２、Ｃ２７１、Ｃ１７１が領域５ｑ１３内の２つの遺伝子座を検出し、マーカーＣ１６１が３つの遺伝子座を検出することを実証している。これらの結果は、染色体５ｑ１３上の反復した要素の存在を示している（表１）。この領域の複雑なゲノム組織のため、これらの多形性遺伝子座を利用して、全ての領域が確実にカバーされるように、重なり合うＹＡＣを選択し、これらを供与体のＤＮＡとの関係において遺伝子型決定した。このゲノム組織の確認は、ＹＡＣ５９５Ｃ１１および７５９Ａ３のものと同一の遺伝子型をもつＹＡＣ（９０３Ｄ１）の同定によってもたらされた。ＹＡＣの整列群は、マーカーＡＦＭ２６５ｗｆ５からマーカーＡＦＭ２８１ｙｈ９までの約４メガ塩基をカバーする最小５つのＹＡＣを含む（図１）。ＳＭＡ遺伝子座における高解像度の遺伝子マッピングハプロタイプの従来の分析および家系によるホモ接合方法に基づいて、鍵となる１０回の組換え型減数分裂を選択した。これらの組換え型減数分裂の遺伝子分析を、ＹＡＣの整列群から分離した新しい多形性マーカーを用いて行った（図１）。最も多形性のマーカーＣ２１２およびＣ２７２はもはや、ＳＭＡ遺伝子座との組換え事象を明らかにしない。これらの結果は、これらのマーカーがＳＭＡの遺伝子の最も近い遺伝子座を検出するということを表している。本発明は、より詳細には、これらの多形性マーカーのうちの複数のものの検出、そして必要とあらばその弁別を可能にする手段（核酸および方法）に関する。特に本発明は、独自のヌクレオチド配列が、 − ＳＭＡ遺伝子座を有するとみなされておりかつ可変的な数の反復配列、特にジヌクレオチド反復配列を包含する、ヒト染色体領域の多形性マーカーの１つの鎖の核酸配列の中に含有されており、 − それ自体、前記反復配列を含む多形性マーカーの領域の外側ではあるが、このマーカー内に存在している特徴的な１つの配列を含有しており、この特徴的配列は、ヒト由来のＤＮＡ調製物の中の対応するマーカーをＰＣＲが検出するためのプライマーとして同じ配列の１フラグメントを利用することができるように充分なサイズ、すなわち特に１２以上、好ましくは１５以上のヌクレオチドというサイズを呈していること、を各々特徴とするＤＮＡ鎖に関する。本発明の好ましい鎖のうち、ここでは、それぞれＣ２１２、Ｃ２７２、ＡＦＭ１５７、Ｃ１６１およびＣ１７１という呼称で識別されている以下のＤＮＡ配列の１つの中に含まれた、反復配列を含む領域の外側にある領域の１つの全てまたは一部分によって構成されている独自の配列（またはそれに相補的である配列）をもつＤＮＡ鎖について言及する。これらのＤＮＡ鎖は、特にそれがかなり長いものである場合、例えば、対応するマーカー内の欠失の存在または不在についての直接的プローブとして利用することができる。この場合、本発明は、同様に、ヒトＤＮＡフラグメントとハイブリダイズする可能性のない非ヒト核酸と組換えを起こすこの鎖を含む組換え型ＤＮＡ（１本鎖または２本鎖）に関する。しかしながら、好ましい鎖は、特にＰＣＲ（英語表現で「Polymerase Chain Reaction」つまりポリメラーゼの存在下での連鎖反応）タイプの鎖の増幅方法の中で利用することのできる鎖である。特に、本発明は、特に以下のものに由来する配列対の中にそれぞれ含まれる配列を有する、好ましくは少なくとも１２、有利には少なくとも１５のヌクレオチドを有するプライマー対に関する：または、その逆のものまたは、その逆のものまたは、その逆のものまたは、その逆のものまたは、その逆のものただし、当然のことながら「vice versa（その逆）」という表現は、上述の配列（１）および（２）の対に由来する各々のプライマーが１つの相補的プライマーによって置換され得ることを意味している。上述のグループに対応する好ましいプライマー対の例として、以下のオリゴヌクレオチドを記す。本発明は、当然のことながら、対応するマーカーの完全な複製として考えることのできるＤＮＡ鎖にも関し、これらの鎖（このとき対応する反復配列も有する）は、また、例えば研究対象の染色体の対立遺伝子の１つの上のその特異的マーカーの存在または不在の確認を目的として、対応するマーカーの特異的プローブとして利用することができる。本発明は同様に、罹患しているかまたは罹患している可能性のある被験者（患者または胎児）に由来し、かつその存在または不在によってＳＭＡに関与している遺伝子のうちの少なくとも１つを含んでいるとみなされている染色体領域を研究するための方法において、この被験者または胎児の染色体ＤＮＡの標本と上述のようなＤＮＡ鎖のうちの少なくとも１つを、特に、この染色体ＤＮＡの対応するマーカーにそれがハイブリダイズした時点で直ちにこれらのマーカーの反復された配列とまたこれを超えてその鎖の伸長を可能にするような増幅条件の下で、接触させる工程、そして次にそのそれぞれの長さに応じて得られた伸長鎖の間での弁別を可能にする条件の下でこれらのマーカーの数を表す情報を得る工程を包含する方法にも関する。好ましくは、これはＰＣＲによって行われ、このとき染色体ＤＮＡ標本は、そのそれぞれの反復配列を含む領域のマーカーの領域にハイブリダイズする可能性のある上述のようなプライマー対と接触させられ産生された伸長鎖間の弁別は、この場合、特に適切な電気泳動ゲルの中のそれらの移動によって得られる。特に、以下で結果を詳述する実験から、かなりの割合のケースにおいて、特にＩ型のＳＭＡの存在または潜在性は、健康な被験者に由来する染色体ＤＮＡの中で見られるものよりも少ない数の多形性マーカーが検出されることによって明らかとなり、この減少は、罹患被験者において、領域５ｑ１３の不可欠部分が実際に欠失していたということを証明している。同じ家族中に他のＳＭＡ症例が現在または過去に存在していることを理由としてハイリスクをもつ被験者により特定的に適用された本発明の好ましい実施態様においては、本発明の方法はまた、比較を目的として、両親またはその他の親戚に由来する染色体調製物に対しても使用されることになる。以下に結果を報告している試験は、被験者のうち自らの両親から鎖の伸長の種となった１つのマーカーを含む対立遺伝子を受けとった被験者には、それを１つしか受けとっていない者またはその対立遺伝子の１つがこのようなマーカーのキャリヤでない被験者に比べて特にＩ型のＳＭＡによる脅威が少ないということを示す傾向をもつ。使用されるマーカーの多形性のため、実際には、特にその異なるサイズによる増幅産物の移動差によって、実際、場合によっては片親から受け継いだマーカーを有する対立遺伝子および場合によってはもう一方の親から受け継いだ対立遺伝子を識別し、さらには、本発明によって確認できるとおり、見かけ上その疾患に対する疾病素質を全く示さない両親をもつ被験者における疾病の出現リスクを結果として伴う新規の欠失の出現、を識別することが可能である。逆に、与えられた一人の被験者、特に胎児において、特に比較研究の際に対応する染色体の各々の対立遺伝子上の少なくとも１つの多形性マーカーの存在が検出された場合、その胎児がこれらのマーカーをその両親からそれぞれ受け継いでおり、その疾患に対する疾病素質を有していないと結論づけることができるだろう。このことはまた、低年令の小児についても、彼らが示す臨床的徴候のために、臨床医が彼らがその疾患を発症する可能性について自問することになる場合にはつねに言えることである。このとき、本発明者らは、少なくとも或る一定数のケースにおいて、たとえそれが、いくつかの臨床的兆候が逆のことを予測しているように思われるにもかかわらず、胎児での疾患の遺伝的潜在性の不在を新生児医学において確認するため、または、低年令児における陰性診断を確認するためだけのものであるにせよ、本発明によって得ることのできる結果の重要性を理解することができる。本発明およびそれによって得ることのできる結果については、以下で、より詳しく（ただし制限的な意味なく）さらに例示する。また、本明細書の終りに記している凡例を参照しながら解釈できる図面および表も参照するものとする。グループおよび方法グループ２０１のＳＭＡグループについて研究した。これらのグループは、ＳＭＡに関する国際コンソーシアム（１５）により決定された診断基準に従って選択された。ＳＭＡが確認された被験者を３つのサブグループ（Ｉ型、II型またはIII型）に分けた。９０人の被験者がＩ型に属し、８１人がII型に、また３０人がIII型に属していた。対照としては、ＣＥＰＨの２つの基準大グループ、２名の親と一人の子供から成る２２の健康なグループそして親戚関係のない６０の健康な個体を利用した。統計的分析上の必要性のため、研究では、１グループにつき１人の罹患した小児しか内含させなかった。方法サザンブロット法：異なる個体のＤＮＡを、白血球沈渣またはリンパ芽球系統の沈渣から抽出した。その後、さまざまな制限酵素によりこれを消化し、次に、０．８％のアガロースゲル上で泳動させてから、帯電したナイロンメンブラン上に移した。ジヌクレオチド反復の多形性検出：同じＤＮＡから、マーカーＣ２１２（Ｄ５Ｆ１４９Ｓ１およびＳ２）、Ｃ２７２（Ｄ５Ｆ１５０Ｓ１およびＳ２）およびＣ１６１（Ｄ５Ｆ１５３Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）の特異的プライマーの間で、ＰＣＲ増幅を行った。増幅条件は以下のとおりであった；すなわち、１分間９４℃での変性、１分間５５℃でのハイブリダイゼーションおよび１分間７２℃での伸長を３０サイクル。次に、変性ポリアクリルアミドゲル上で、ＰＣＲ産物を移動させ、ジヌクレオチドＣＡの反復を認識するプローブ（２０）とハイブリダイズさせる正に帯電したナイロンメンブラン上にこれを移す。ＹＡＣ５９５Ｃ１１からのファージバンクの構築酵素Ｓａｕ３Ａによる部分的消化の後、クローン５９５Ｃ１１のＤＮＡをアガロースゲル（「ＳＥＡＰＬＡＱＵＥＧＴＧ０．５％」の名称で知られている）の上に負荷し、泳動した。泳動後、１２〜２３kbのサイズのフラグメントを切断し、ｂ−アガラーゼにより消化し、エタノール中で沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部位を部分的に修復した後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸII（Stratagene）の部分的に修復されたＸｈｏ１部位にサブクローニングした。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌII、ＨｉｎｄIIIおよびａ−ＸｂａＩによる制限多形性探索用プローブ（ＲＦＬＰ）として、マーカーＣ２１２（Ｌ−５１）、Ｃ２７２（Ｌ−５１、Ｌ−１３２）およびＣ１７１（Ｌ−５、Ｌ−１３）を含むラムダクローンを利用した。遺伝子量分析用の内部コントロールとして、プローブＪＫ５３（Ｄ５Ｓ１１２）を利用した。６００nmでのデンシトメトリー(Hoefer Scientific Instrument，S an Francisco)によりオートラジオグラフィを測定した。結果反復した要素の存在が患者におけるリアレンジ(rearrangement)の突然の発生に有利に作用しうるという仮説をテストするため、同血統でない２０１のＳＭＡグループにおいて、マーカーＣ２１２およびＣ２７２により検出された遺伝子座での対立遺伝子の分離を分析した。親戚関係にない７つのグループに属する罹患した８人の小児におけるこれらの遺伝子座での親の寄与はなかった。４人の患者がＩ型の形態に罹患し、２人がII型、２人がIII型に罹患していた。親の寄与がなかった原因は、５つの症例において母方にあり（グループ３、４、５、６）、他の３つの症例において父方にあった（グループ１、２、７；図１）。Ｉ型の患者の一人は、新規に突然発生したリアレンジを示し、これはマーカーＣ２１２およびＣ２７２によって認識された２つの遺伝子座のうちの１つだけしか移動しなかった（図１、グループ７）。各々のマーカーについて異なるオリゴヌクレオチド対を利用することによって、同一の結果が得られた。ＳＭＡ遺伝子座に近接するマーカーを用いたハプロタイプの構築（２１）により、偽似父性またはサンプリングの誤りといった仮説を排除することができた。これらの結果は、これら８人の患者における異常な遺伝子座の移動を起こすリアレンジの存在を表している。その上、リアレンジを示す患者の数は、減数分裂の情報提供力の欠陥によって過小評価され得たことから、３つのタイプのＳＭＡグループならびに親戚関係のない個体から成る６０のコントロールにおいて、マーカーＣ２１２およびＣ２７２によって明らかにされた全く異なるＰＣＲ増幅産物の数を分析した（図２）。Ｉ型の患者９０名のうちの１６人において（１８％）、マーカーＣ２７２を伴うＰＣＲ増幅産物が一つだけ検出され、これは、II型（１／８１つまり１％）、III型（１／３つまり３％）およびコントロール（０／５９つまり０％、ｐ＜０．００１）で観察された結果と統計的に非常に異なる結果であった。同様に２つのＰＣＲ増幅産物を呈するＩ型患者の割合（５５／９０つまり６１％）は、親（６９／１８０つまり３８％）およびコントロール（１２／５９つまり２０％、ｐ＜００１）のものと有意な違いを示している。マーカーＣ２１２でも類似の結果が得られた（表）。Ｉ型患者における増幅されたフラグメントの数の減少が遠い血縁関係のせいであり得たという可能性は、ＳＭＡに罹患した被験者の親が共有するフラグメントの数およびコントロールの親戚でない２０のグループの親の共有フラグメント数を比較することによって、排除された。このとき、結果は、統計的に有意な差を示さなかった（データ示さず）。その後、マーカーＣ２１２またはＣ２７２を伴うＰＣＲ増幅産物を１つしか示さない罹患した小児を含むＩ型の２０のグループを、マーカーＣ１６１を用いて分析した。２０のグループのうち２つにおいて、本発明者らは、新規に突然発生したマーカーＣ１６１により検出された３つの遺伝子座のうちの２つが移動するリアレンジを観察した（図３、グループ８および９）。これらの結果は、Ｉ型ＳＭＡ患者におけるマーカーＣ２１２およびＣ２７２により検出された遺伝子座での対立遺伝子減少がこれらの遺伝子座での対立遺伝子の喪失に起因するという仮説を充分に裏づけている。これらの患者における欠失した領域５ｑ１３の伸長を特徴づけるため、本発明者らは、ＹＡＣの新しい整列群から生成されたその他の多形性マーカーでこれらのグループを分析した。これらのグループの完全なハプロタイプ化によって、本発明者らは、異なる欠失をマッピングし、マーカーＣ１６１およびＣ２１２−Ｃ２７２の間の最も小さい再配列の限界を限定することができた（図４）。これらの結果は、ＳＭＡ遺伝子座がＹＡＣ９０３Ｄ１内に含まれている１．２Mbの１つの領域の中にあるということを示唆している（２０、２３）。しかしながら、マーカーＣ２１２およびＣ２７２の反復ＣＡに近接する領域の完全な配列相同性のため、２つの遺伝子座のうちのいずれが、唯一の遺伝子座の喪失を呈する唯一の患者において欠如していたのかを決定することは不可能であった（グループ７、図１および４）。領域５ｑ１３内の欠失の存在の物理的証拠を提供するため、異常な親の寄与を示すＳＭＡグループのサザンブロット分析のためのプローブとして、マーカーＣ２７２を含むクローンＣ−１３２を利用した。この場合、ＲＦＬＰおよび遺伝子量の分析により、受け継がれたまたは新規の欠失の存在が確認されることだろう（図５）。考察および結論本研究は、親戚関係にない９つのグループに属する罹患した１０人の小児における疾病の遺伝子座を包含する欠失の存在の遺伝的および物理的証拠を提供する。その上、領域５ｑ１３の欠失の存在は、この疾病の重症形態（Ｉ型）に統計的に結びつけられる対立遺伝子の減少の観察によって、強く裏づけされている。欠失は、II型またはIII型の患者においても場合によっては見られる。したがって、全く異なる対立遺伝子の突然変異によって、疾病の可変的臨床発現の説明がつくと思われる。これらの結果はまた、３つの型のＳＭＡの原因である単数または複数の遺伝子が、まさに同じ領域の中に存在するということをも確認している。デーシェーまたはベッカーの筋ジストロフィーは同様に、欠失の結果としてひき起こされ得るが、この場合、欠失の型の間には機能的な差異が存在する（２５）。しかし一方ＳＭＡではこのような分析はまだ可能となっていない。この研究は同様に、欠失が新規に発生し得るということも明らかにしており、この特徴は、これまでよく理解されておらず、かつＳＭＡにおいて複数の著者によって以前に報告されてきた低い分離係数（２６、２７）を説明することができる。領域５ｑ１３の新規の欠失は同様に、同じグループの中で、１人の健康な小児が近接マーカーを用いて罹病した小児と同じハプロタイプを呈する場合に、ＳＭＡの見かけ上の遺伝的不均質性を説明することもできる（１８、２８）。この観察事実は、遺伝的助言のためにも同じように重要である。実際、近接マーカーを用いて決定された一定の同じグループの罹患小児と胎児の間の見かけ上のハプロタイプ同一性は、新規欠失が突然発生した場合に、出生前診断の誤りを導く可能性がある。領域５ｑ１３内の反復要素の存在は、不等な交差の事象がＳＭＡ罹患被験者における欠失の出現に寄与することになるこの領域の不安定さを説明することができる。ここで、配列Ｃ２７２が、制限フラグメントの長さの多形性の「サザンブロット」分析によって、または遺伝子量の分析（認識の可能性あるプローブによって与えられたハイブリダイゼーションシグナルの弱化による遺伝子の或る一定の劣化率の秤量）によって、受け継がれた欠失または新規の欠失の存在を明らかにすることのできるＤＮＡフラグメント（Ｌ１３２と呼称される）の中に見かけ上含まれている、ということに留意すべきである。表．Ｉ型、II型およびIII型のＳＭＡに罹患した被験者、その親およびコントロールにおいてマーカーＣ２１２およびＣ２７２を用いて観察された全く異なるＰＣＲ増幅産物の数。（ｎ）は試験対象となった固体の数を表す。図面の簡単な説明図１：ＳＭＡに罹患した患者における欠失の遺伝地図Ａ）領域５ｑ１３のゲノム地図。異なるマーカーはその遺伝子の位置の上に示されている。ブロックＣ２１２−Ｃ２７２−Ｃ１７１を囲むカッコは、そのブロック内部のマーカーの順序がわかっていないことを表している。Ｂ）欠失の遺伝地図。ダッシュは、上述のマーカーに対応する。グループ７の中では、欠失は、動原体ブロックＣ２１２−Ｃ２７２−Ｃ１７１またはテロメアブロックをもたらす可能性がある。図２：マーカーＣ２１２およびＣ２７２によって決定されるＳＭＡ罹患者における親対立遺伝子の寄与。この図は、マーカーＣ２７２（グループ１、２、５および７ｂ）またはマーカーＣ２１２（グループ３、４、６および７ａ）を用いたグループの研究を示す。患者は、Ｉ型（グループ３、５、６および７）、II型（グループ１および２）またはIII型（グループ４）の形態に罹患している。ＳＭＡに近接するマーカーを用いたハプロタイプの構築（１１）により、本発明者らは、グループ４および５の健康な小児が、その母親の突然変異を受けた対立遺伝子を受け継いだことを見極めることができた。グループ７においては、近接マーカーを用いて立証されるようなハプロタイプ同一性胎児と比較して、マーカーＣ２１２（７ａ）およびＣ２７２（７ｂ）を用いて、罹患小児に対するその父親の不完全な寄与が認められる（データ示さず）。Ｆ：father（父親）、Ｍ：mother （母親）、Ａ：affected（罹患）、ＮＡ：non-affected（未罹患）、ｆｅ：fetu s(胎児)。点は、対立遺伝子フラグメントを表す。図３：患者、その両親およびコントロールにおいてマーカーＣ２７２によって明らかにされた全く異なるＰＣＲ増幅産物の数。合計で９０人のＩ型患者、８１人のII型患者、３０人のIII型患者、その両親および５９の対照が研究対象となった。横座標には、全く異なるＰＣＲ増幅産物の数が、また縦座標には試験対象となった個体の数（％）すなわち罹患患者：親：コントロールが示されている。図４：Ｉ型に罹患した患者におけるマイクロサテライトＣ１６１によって検出された新規に突然発生した欠失の存在の証拠。４ａ．マーカーＣ２７２によって検出された対立遺伝子の分離は、グループ８、９および１０内の欠失の存在を証明もしなければ排除もしない。患者は、ＰＣＲ増幅産物を１つだけ呈することが認められる。４ｂ．マーカーＣ１６１によって検出された対立遺伝子の分離は、罹患した小児がその両親（グループ８）またはその父親（グループ９）から唯一つの遺伝子座しか受け継いでいないことから、グループ８および９における新規に突然発生した欠失の存在を明らかにしている。グループ１０では、全く異なる６つのＰＣＲ増幅産物の検出は、Ｃ１６１によって検出された３つの遺伝子座の１つを占有する欠失の可能性をことごとく排除している。Ｆ：father（父親）、Ｍ：mother（母親）、Ａ：affected（罹患）。点は、対立遺伝子フラグメントを表す。図５：Ｉ型ＳＭＡに罹患した患者におけるファージＬ−１３２により検出された遺伝子座での遺伝子量および制限フラグメントの長さの多形性（ＲＦＬＰ）の分析。遺伝子分析は、ＥｃｏＲＩ（グループ６および７）またはＸｂａＩ（グループ３および５）を用いたＤＮＡの消化後に行われた。クローンＬ−１３２５ａおよびプローブＪＫ５３５ｂを用いて、膜上でハイブリダイズさせた。遺伝子量は、グループ３、６および７についてハイブリダイゼーションシグナルのデンシトメトリー測定によって決定した。グループ６では、母親および罹患小児においてバンドの強度は５０％減少しており、このことは、それが受け継がれた欠失であることを表している。グループ７および３では、罹患した小児のバンドの強度は、両親のものよりもはるかに弱く、その欠失が新規に突然出現したものであることを示唆している。グループ５では、酵素ＸｂａＩによって検出されたＲＦＬＰの分析は、罹患小児がその母親から対立遺伝子を受けとっていなかったことを示している。

Claims

【特許請求の範囲】１．独自のヌクレオチド配列が、 − ＳＭＡ遺伝子座を有するとみなされており、かつ、可変的な数の反復配列、特にジヌクレオチド反復配列を含むヒト染色体領域の多形性マーカーの１つの鎖の核酸配列の中に含有されており、 − それ自体、前記反復配列を含む多形性マーカーの領域の外側ではあるが該マーカー内に存在している特徴的な１つの配列を含有しており、該特徴的配列は、ヒト由来のＤＮＡ調製物の中の対応するマーカーをＰＣＲが検出するためのプライマーとして、同じ配列の１フラグメントを利用することができるように充分なサイズ、すなわち、特に１２以上、好ましくは２０以上のヌクレオチドというサイズを呈していること、を特徴とする、ＤＮＡ鎖。２．独自の配列または自らに相補的な配列の少なくとも一部分が、以下の配列Ｃ２１２の内部で、そのジヌクレオチド反復を含有する領域の外部にある領域内に含有されていることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ鎖。３．独自の配列または自らに相補的な配列の少なくとも一部分が、以下の配列Ｃ２７２の内部で、そのジヌクレオチド反復を含有する領域の外部にある領域内に含有されていることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ鎖。４．独自の配列または自らに相補的な配列の少なくとも一部分が、以下の配列ＡＦＭ１５７Ｘｄ１０の内部で、そのジヌクレオチド反復を含有する領域の外部にある領域内に含有されていることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ鎖。５．独自の配列または自らに相補的な配列の少なくとも一部分が、以下の配列Ｃ１６１の内部で、そのジヌクレオチド反復を含有する領域の外部にある領域内に含有されていることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ鎖。６．独自の配列または自らに相補的な配列の少なくとも一部分が、以下の配列Ｃ１７１の内部で、そのジヌクレオチド反復を含有する領域の外部にある領域内に含有されていることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ鎖。７．独自の配列が、 −Ｃ２１２または、その逆のものという２つの配列の中に含有されていることを特徴とする、特にＰＣＲ用のプライマー対。８．２つのプライマーが、というヌクレオチド配列をそれぞれ示すことを特徴とする、請求項７に記載のプライマー対。９．独自の配列が、 −Ｃ２７２または、その逆のものという２つの配列の中に含有されていることを特徴とする、特にＰＣＲ用のプライマー対。１０．２つのプライマーが、というヌクレオチド配列をそれぞれ示すことを特徴とする、請求項９に記載のプライマー対。１１．独自の配列が、 −Ｃ１６１または、その逆のものという２つの配列の中に含有されていることを特徴とする、特にＰＣＲ用のプライマー対。１２．２つのプライマーが、というヌクレオチド配列をそれぞれ示すことを特徴とする、請求項１１に記載のプライマー対。１３．−Ｃ１７１または、その逆のものという、特にＰＣＲ用のプライマー対。１４．２つのプライマーがというヌクレオチド配列をそれぞれ示すことを特徴とする、請求項１３に記載のプライマー対。１５．独自の配列がという２つの配列の中に含有されていることを特徴とする、特にＰＣＲ用のプライマー対。１６．前記配列が、請求項２〜６のいずれか１項に記載の完全な配列または、それぞれその配列に相補的な配列の中から選択されることを特徴とする、ＤＮＡフラグメント。１７．請求項１６に記載のＤＮＡフラグメントまたは該フラグメントの一部分と、非ヒトフラグメントとの組換えフラグメント。１８．請求項１７に記載のフラグメントに対応するマーカーまたはそのフラグメントを含む領域を直接検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての、該フラグメントの使用。１９．罹患しているかまたは罹患している可能性のある被験者（患者または胎児）に由来し、かつその存在または不在によってＳＭＡに関与している遺伝子のうちの少なくとも１つを含んでいるとみなされている染色体領域を研究するための方法において、該被験者または胎児の染色体ＤＮＡの標本と上記ＤＮＡ鎖のうちの少なくとも１つを、特に、該染色体ＤＮＡの対応するマーカーにそれがハイブリダイズした時点で直ちに該マーカーの反復配列に向かって、またそれを超えてのその鎖の伸長を可能にするような増幅条件の下で接触させる工程、そして次にそのそれぞれの長さに応じて得られた伸長鎖の間での弁別を可能にする条件の下で該マーカーの数を表す情報を得る工程を包含する方法。２０．請求項７〜１５のいずれか１項に記載のプライマー対と染色体標本を接触させる工程を含み、そして伸長鎖の間の弁別は、特にゲル電気泳動によって得られることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。