JPH11510059A - 遺伝子診断の共優性テスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 同時に２つのプライマ対を介入させる、１つの核酸内の推測上の突然変異のホモ接合体又はヘテロ接合体の状態の検出方法。異なる２つのプライマ対は、異なるサイズの増幅フラグメントの産生を導き、増幅されたバンドの数及び質により、前記突然変異に対するホモ接合体及びヘテロ接合体の個体を区別することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子診断の共優性テスト 本発明は、共優性遺伝子診断テスト、すなわち多形性対立遺伝子についてホモ 接合体及びヘテロ接合体の個体を１つの個体群の中で区別することを可能にする テストに関する。 ゲノミックDNAレベルでの点突然変異の迅速かつ効率の良い検出方法は、多形 性に関係する病理学的危険性の予測及び遺伝子研究のみならず遺伝病の分子ベー スの研究を目的とする多形性識別、ならびに遺伝子診断テストの開発にとってき わめて重要である。 以下では、ヌクレオチドの転位、又は転換或いは欠失又は付加といった配列の 変更を包括する語である点突然変異について論述する。より一般的には、この語 には、１〜６個のヌクレオチドの転位、転換、欠失又は付加が含まれる。 このタイプの迅速で効率が良くしかも廉価な検出方法は、より一般的に言うと 、微生物又は動物又は植物のいずれであれあらゆる生物の突然変異の検出に応用 することができ、この方法は基本的に複相生物にとって有利である。このタイプ の検出の応用分野はかくして、農産物加工部門から医療又は獣医学的診断さらに は動物又は植物の選別まで広がり得る。 PCR（１）は、ゲノミックDNAの分析を大きく前進させた。その技術は、その他 の技術と組合わされた時に遺伝病の診断を可能にした（２，３，４，５，６，７ ，８，９）；それはPCRと直接的配列決定の組合せ（２，３，４，１０）でもよ いし、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）と呼ばれる技術（11，12） でもあり得る。 或る種の場合において、点突然変異の出現は、制限酵素の認識部 位を作り出すこともできるし又破壊することもできる（13）；この制限部位の存 在又は不在は、最近鎌形赤血球貧血症の診断のために実現されたように、診断の 実施のために利用することができる；同様にして、増幅後に制限多形性を分析す ることによって家族内の診断の確立を可能にする特徴づけされていない突然変異 に、この制限多形性を関連づけることが可能である。PCRをその他のタイプの反 応と組合わせることによってこれらの突然変異の検出を可能にするということを 目的として、数多くの技術が開発されてきた。すなわち、特に次のようなもので ある： −野生型対立遺伝子とハイブリッド形成するものの突然変異体対立遺伝子とはハ イブリッド形成しないオリゴヌクレオチドプライマ又はその逆のプライマの利用 による、PCR技術の修正である「特異的対立遺伝子のPCR増幅（PASA）」と呼ばれ る技術：従って、増幅産物はプライマの選択対象である対立遺伝子に特異的なも のとなり、そのとき、対応する対立遺伝子とのプライマのハイブリダイゼーショ ンが無い場合には増幅は効力のない状態となる（14）； −HEIM et al.（15）は、２つの対立遺伝子を増幅するため異なるプライマセッ トを利用した。ここでこれらの増幅の後には対立遺伝子特異的PCRが行なわれた 。 −SCHUSTER et al（16）は、apoBの遺伝子の中の点突然変異を検出するための唯 一の反応混合物の中で３つのオリゴヌクレオチドプライマのセットを利用して、 対立遺伝子特異的PCRと非対称PCRを組合わせた；しかし、この単純な技術では、 劣性疾病について、突然変異を受けている２つの対立遺伝子をもつ罹患個体と、 唯一の突然変異対立遺伝子のキャリヤである個体とを区別することができない。 特に増幅産物から１つの制限部位が突然変異により生成されたこ とを証明するために、その他の方法が利用された。これは特に、血友病Ｂ（17） 又は血友病Ａ（18）の検出のために用いられた。 そのあらゆる使用において、上述の診断テスト技術は、高レベルの技術的ノウ ハウを利用し複雑で大変でしかも高くつく段階を必要とするか又はホモ接合体及 びヘテロ接合体の個体を区別できないことから、個体群の中での広い利用には適 していない；対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドといったようなその他の技術 は、優性タイプのものであり、正常対立遺伝子及び突然変異体対立遺伝子をもつ ヘテロ接合体個体とホモ接合体個体を区別できるようにするものではない。とこ ろが、遺伝子診断特に遺伝病に対する一定の与えられた個体群における危険性の 予測に関しては、複雑で高価な技術を利用することなくこれら２つの個体群を識 別できることがきわめて重要である。 本発明は、文献中で記述されたさまざまな技術がもつ欠点を克服し、放射性元 素の利用から免れることができるようにする。本発明は核酸内の推測上のホモ接 合体又はヘテロ接合体の状態の検出方法において、２回の核酸増幅が使用され、 これら２回の増幅がそれぞれ少なくとも２つのプライマ対を要求すること、又 −第１のプライマ対は、野生型対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ）と これとは異なる第２のオリゴヌクレオチド（Ｂ）で構成されており； −第２のプライマ対は、突然変異体対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ ′）及びそれ自体（Ａ′）とも（Ｂ）とも異なる第２のオリゴヌクレオチド（Ｃ ）で構成されており、 （Ａ）と（Ｂ）、（Ａ′）と（Ｃ）の間の増幅されたフラグメントの間の長さ の差は、従来の分析方法によって検出されるのに充分なものであることを特徴と する検出方法に関する。 これら２つの増幅は同時である。 同時というのは、反応の産物が、特にポリアクリルアミドゲル又はアガロース ゲルでの電気泳動といったDNAの分析的又は準備的分離の従来の方法によって同 時に分析されるということを意味している。それでも当業者にとっては当然のこ とながら、増幅されたフラグメントのサイズのクロマトグラフィといったような 他のあらゆる分析方法も本発明の方法における同等の手段としてみなされるべき である。 ２つの増幅反応は（Ａ）と（Ａ′）が同じDNA連鎖と相補的である場合には２ つの異なる反応混合物の中で実施されてもよいし、或いは、（Ａ）及び（Ａ′） がそれぞれDNAのストランド（＋）及び（−）と相補的である場合には同じ反応 混合物内で実施されてもよい。 特に、長さの差異は、例えばアガロースゲルでの電気泳動における移動の後２ つの異なるバンドが存在することによって検出可能である；ただし、当然のこと ながら、検出方法を洗練されることになった時点で、増幅されたフラグメント間 の長さの差異を縮減することができるだろう。 より一般的には、少なくとも２つのプライマ及びこれら２つのプライマの間に 含まれた相補的配列を合成することを可能にするポリメラーゼの利用を含むDNA 配列のあらゆる増幅技術を、その完成度の如何に関わらず、この相補的配列につ いては異なる２つのプライマ対の同時利用及びPCR産物の同時視覚化から成る本 発明の実施に応用することが可能である。 一方ではプライマ対（Ａ）及び（Ｂ）、他方では（Ａ′）及び（Ｃ）は、対称 であっても逆転していてもよい。換言すると（Ａ）及び（Ａ′）が２重らせんの 同一ストランドとそして（Ｂ）及び（Ｃ ）がもう１つのストランドとハイブリッド形成できるか、又は、一方では対（Ａ ）（Ｂ）、他方では対（Ａ′）（Ｃ）が逆転している、つまり（Ａ）及び（Ａ′ ）が、（Ｂ）及び（Ｃ）と全く同様にDNA連鎖の相補的ストランドにハイブリッ ド形成することができる。 第１の変形形態においては、２つのプライマ対によって実現される２回の増幅 は別々に行なわれなくてはならず、次に反応産物を混合して従来の方法により分 析させなくてはならない。 これに対し、第２の変形形態においては、反応産物は出発時点から混合でき、 このとき（Ａ）と（Ｃ）の間の増幅は実施され得ない。しかしながらこの最後の ケースにおいては反応混合物内での（Ａ）と（Ａ′）の間の寄生的ハイブリダイ ゼーションを避けるため、プライマ（Ａ）及び（Ａ′）は充分に異なる配列を有 していなくてはならない。唯一の要求事項は、（Ａ）及び（Ａ′）が突然変異が 探究されているヌクレオチドに対応するヌクレオチドのキャリヤであるというこ とである。 要するに、この技術は、DNAを含む生体の如何に関わらず、つまりそれが微生 物、細菌、ウイルス、動物又は植物のいずれであろうと利用することができるが 、複相生物又は倍数体について確かな利点を有するものである。 この新しい技術の有用性は、肢帯筋ジストロフィタイプの常染色体性劣性遺伝 病に関与するタンパク質についてコードする遺伝子のキャリヤである南インジア ナのアミシュ個体群の中の突然変異を同定する目的で立証された。 従来のPCR方法が、特に複合ゲノムにおける標的配列を増幅するために極めて 強力であることがわかっているにせよ、増幅の後に得られたバンドのスペクトル の中には人為的な小さな寄生的バンドが現われることが多い。これは、往々にし て、標的連鎖上のプライミ ングの誤差として解釈される：又、R.H.DON(19)は、基本的にマグネシウム濃度 の調整又はDNAとプライマのハイブリダイゼーション温度の上昇であったこれま で使用されてきた技術に比べはるかに厳密な形でこれらの人為構造を除去するこ とのできるいわゆる「タッチダウン」技術を開発した。「タッチダウン」方法は 、標準的ハイブリダイゼーション温度より上で開始できるPCR反応の指数的性質 を活用するものである。すなわち反応温度は、このハイブリダイゼーション温度 （例えば65℃）よりも５〜10℃上で開始し、次に、この技術による標準ハイブリ ダイゼーション温度が得られるまで１サイクルあたり１〜２℃だけ規則的に低下 する。正しい再対合と正しくない再対合の間のTmの差は全て、その他の条件が全 て同じであるものとして、正しくない産物に比べての優位を正しい産物に対して 与えることになる。かくして５⁰の差異は、４⁵倍の優位を与えることができる（ 19）。 本発明に従った方法においては、増幅技術に固有の誤差の危険性を避けるべく 、増幅されたフラグメントは好ましくは、50〜200ヌクレオチドの間に含まれる それぞれの長さを有する；その上、一方では（Ａ）と（Ｂ）、他方では（Ａ′） と（Ｃ）の間の増幅されたセグメントの同定があいまいなものとならないように 、長さの違いは好ましくは少なくとも10％でなくてはならない。本発明の方法は 、以上で定義したような点突然変異の検出のために特に有利である。 本発明は同様に、ホモ接合体又はヘテロ接合体の推測上の点突然変異の診断用 のキットに関するものであり、ここでこのキットは、少なくとも ａ）熱安定性ポリメラーゼ、 ｂ）野生型対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ）及び（Ａ ）とは全く異なる第２の特異的オリゴヌクレオチド（Ｂ）で構成された第１のプ ライマ対、 ｃ）突然変異体対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ′）及び（Ａ）とは 全く異なる第２のオリゴヌクレオチド（Ｃ）で構成された第２のプライマ対、 を含み、一方ではプライマ（Ａ）と（Ｂ）、他方ではプライマ（Ａ′）と（Ｃ） の間の増幅されたフラグメントのサイズが好ましくは少なくとも10％の差異を有 することを特徴としている。 本発明に従ったキットは、上述の４つのプライマ（Ａ），（Ａ′），（Ｂ）， （Ｃ）の他に、PCR又は派生した改良型の全ての方法特にいわゆる「タッチダウ ン」PCRによる増幅を可能にする全ての要素を内含している。 本発明に従ったキットは、より特定的に言うと、転位又は転換のいずれであれ 点突然変異のホモ接合体又はヘテロ接合体状態を検出するか又は同定するために 利用可能である。実際、これら２つの同時増幅によって、以前のいかなる方法を 用いてもできなかった共優性診断テストの容易に解釈可能な読取りに到達するこ とができる。 本発明に従ったこのような診断用キットは、人間又は動物の健康の分野のみな らず、環境の衛生又は感染状態の検出及び追跡調査が重要でありうる環境、種子 又は農産物加工といったその他全ての応用部門において利用することができる。 同様に、診断は、動物又は種子の選別プロセスにおいても利用可能である。 以下の例ならびにそれに添付された図面は、制限的な意味なく、肢帯筋ジスト ロフィタイプに関与するタンパク質をコードする遺伝子LGMD2Eの中の点突然変異 の検出に対する本発明の性能を示すものである。 図１は、プライマ対が対称である場合の本発明のシステムを例示している。こ の図の中で、Ｎは正常な対立遺伝子に対応し、Ｍは突然変異体対立遺伝子に対応 する。矢印はプライマを表わし、方向は５′→３′の方向を反映している。 図２は、プライマ対が反対称である場合の本発明のシステムを例示する図であ る。Ｎ及びＭそして矢印は、図１の場合と同じ意味をもつ。 図３は、アミシュ個体群におけるアルギニンに向かってのトレオニン置換の分 離を例示している。この図の中で、ラインＡは、罹患した個体又は健康な個体が それぞれ黒又は白のシンボルで表わされている家族A620の血統を表わしている。 「健康」というのは、個体がヘテロ接合体の非キャリヤ又はキャリヤであり得る ことを意味している。Ｂは、それぞれ100及び158の塩基対のフラグメントの「タ ッチダウン」PCRによる増幅産物の混合物のアガロースゲルによる電気泳動にお いて得られた結果を表わしている。Ｃは、家族の内部の染色体４上のハプロタイ プの分離を表わす：突然変異を有する染色体はとり囲まれており、CA12Tは遺伝 子内微小衛星を表わしている。 実施例 図１及び２は、本発明の技術を例示している。この例において、プライマは全 て20ヌクレオチドの長さをもつ。 ａ）一方ではプライマ対（Ａ）（Ｂ）が又他方では（Ａ′）（Ｃ）が対称である 場合： このケースは、図１に表わされている。 この図において、正常対立遺伝子に特異的な第１のプライマ対（Ａ）（Ｂ）は 、180pbの増幅産物を得ることを可能にする；実際、プ ライマ（Ｂ）は、突然変異が探究されているヌクレオチドの下流140pbのところ にあり、プライマ（Ａ）はその３′末端に前記ヌクレオチドを内含している。 突然変異体遺伝子型を同定するのに役立つ第２のプライマ対（Ａ′）（Ｃ）は 、プライマ（Ａ）と同一のプライマを有するが、３′の正常なヌクレオチドの代 りに、突然変異を受けたヌクレオチドＭを有している。突然変異の下流にあるも う１つのプライマ（Ｃ）は、PCRによって得られた産物が、産物（Ａ）（Ｂ）と 著しく異なることになるような（ここでは120pb）形で選ばれるものとする。 増幅産物がPCR段階の後に混合され次にTBE1×緩衝液として臭化エチジウムを 含む４％のアガロースゲル上に被着された時点で、出発標本が正常な対立遺伝子 及び突然変異体対立遺伝子を含んでいた場合、同じトラック内に２本のバンドが 得られる。かくして、PCR反応の各々について「全か無か」タイプの応答を伴う 従来の「優性」診断システムを、容易に解釈できる共優性システムに変換した。 ホモ接合体は、それが突然変異を受けたものか又は正常なものかに応じて、12 0pb又は180pbの唯一のバンドしか生成しない。 ｂ）プライマが反対称である場合 図２はこのケースを例示している。このケースでは明らかに、一方ではプライ マ対（Ａ）（Ｂ）そして他方では（Ａ′）（Ｃ）が前述のケースと同様に、突然 変異体については120pbの、又野生型については180pbの増幅産物を導き出す、と いうことがわかる。 この図では、PCR増幅が４つのプライマを含む唯一の反応媒質内で行なわれた 時点で３つの増幅産物の混合物が得られることがわかる：すなわち、それぞれ18 0pb及び120pbの野生型対立遺伝子と突然変異体対立遺伝子に対応する２つの産物 と同様に、260pbの長さをもつプライマ（Ｂ）と（Ｃ）の間の増幅に対応する１ つの産物で ある。 ４％の臭化エチジウム内のアガロースゲル上にPCR反応産物を被着させると、 増幅されたDNAがヘテロ接合体であり２つの対立遺伝子Ｎ及びＭを支持する場合 、120，180及び260pbの産物にそれぞれ対応する３つのバンドを観察することに なる。 反対に、正常な対立遺伝子についてDNAがホモ接合体である場合、増幅産物は 、180及び260pbの２つのバンドのみを有することになる。 最後に、DNAが突然変異体ホモ接合体である場合、反応産物は120pbと260pbの ２つのバンドを有することになる。 従ってこの診断システムは、PCRを用いたその他のシステムがもつ全ての利点 すなわち感度、非放射性テスト、自動化可能といった利点を有するが、特に、さ らに優性マーカーを共優性マーカーに変換するという有利を呈している。 応用例：LGMD2Eのキャリヤであるアミシュの患者における突然変異の同定 ａ）家族の選別 すでに以前に記述され（20）、52の個体を含みそのうち13の個体が罹患してい る６家族を分析した。その後、13の罹患個体を含む全部で39の個体を伴う５つの 追加の家族も同様に含み入れた。 これらの家族に関与するタンパク質の同定を探究するにあたり、遺伝子LGMD2E の伝令RNAがそのサイズ又は産生量において影響を受けたか否かを見極めるため 、骨格筋の生検から分離された全RNAについて、ノーザンブロット分析を実施し た。ところで、4.4kbのサイズのRNAの写しの個体群は、罹患患者由来の標本にお いても健康な対照においても同様に、正常な量及びサイズで存在している。この ことはすなわち、突然変異が恐らく上述のような点突然変異に起 因するものであったということをきわめて強く示唆していた。この問題を確認す るため、６つの筋生検から調製された全RNAから逆転写の後に、遺伝子LGMD2Eのc DNAフラグメントを増幅させた。RT-PCRの産物を配列決定し、ヌクレオチド461に おけるＣからＧへの単純転換が、突然変異を受けた２つの対立遺伝子を含む２人 の患者に検出された。コドン変更はACAからAGAに向かってであり、残基151にお ける誤った方向の突然変異に対応するアルギニンによるトレオニンの置換を結果 としてもたらす。 この突然変異の分離を、この家族及びその他の肢帯筋ジストロフィのキャリヤ 家族において、前述のタッチダウンPCR技術による対応するフラグメントの配列 決定及び増幅によって検討した。 ｂ）タッチダウン PCR 50ngのDNAを、10mMのトリスHCl、pH 8.8、50mMのKCl、1.5mMのMgCl₂、0.1％の トリトンX-100、200mMの各dNTP、100ngの各プライマ及び２単位のTaqポリメラー ゼ（Perkin Elmer）を含む50μリットルの反応混合物の中でタッチダウンPCR(19 )に付した。96℃で５分間の変性の後、最初の増幅段階を次の要領で行なう：す なわち、まず94℃で40秒、次に63℃で30秒（これが１サイクルを構成する）で、 63℃から59℃まで２サイクル毎に１回１°ずつ低下させる。全体で63℃から59℃ まで（59℃を含む）の各温度で２サイクルの割合で10サイクルのPCRが行なわれ ることになる。第２段階は、94℃で40秒、58℃で30秒から成る25回の付加的な増 幅サイクルで実施する。 利用するプライマ対： 第１のプライマ対： ａ）野生型対立遺伝子の増幅を可能にするABタイプのプライマ対： T461:5′GTTTTTCAGCAAGGGACAAC-3′ m1:5′-CTTTTCACTCCACTTGGCAA-3′ 突然変異体対立遺伝子の増幅を可能にする第２のプライマ対： A461:5′-GTTTTTCAGCAAGGGACAAG-3′ m3:5′TATTTTGAGTCCTCGGGTCA-3′ T461においては、３′のＧが、cDNA配列内のＣからＧへの転換に対応する３′ のＣによって置換されたということがわかるだろう。 増幅産物を、臭化エチジウムで着色された４％のアガロースゲルでの電気泳動 により分析した。 ｃ）結果 結果は、以下に凡例を詳述する図１の部分Ｂに示されている。増幅されたセグ メントのサイズの差は、対T461／ｍｌの増幅産物が100塩基対であり対A461／ｍ ３の増幅産物が158塩基対であることから、58塩基対である。 図１を分析すると、正常な表現型をもつ親は、増幅産物が２つのタイプのフラ グメントを含んでいることから、実際、ヘテロ接合体であることがわかる。個体 の１つが正常なホモ接合体である場合、この作業全体の後に得られるプロフィー ルが158塩基対の分子量に対応するバンドしか含んでいないということは明白で ある。 従って、本発明の技術により、初めて、酵素消化又は制限部位の作成などとい ったタイプの複雑な作業を回避しながら、１つの個体群の中の突然変異のホモ接 合体又はヘテロ接合体状態をあいまいでない形で区別することが可能となる。こ れは迅速でしかも、放射性元素の利用から実験を解放する。 ヘテロ接合体の検出は、いわゆる予防医学の枠内できわめて重要性を帯びてく る：性別に関連する劣性疾患については、ハイリスク家族内の伝導女性を検出す ることができるというのは、著しい進歩 である。発現の遅い優性疾患に関しては、遺伝子特性のキャリヤは潜在的な患者 であり、このタイプの分析は、遺伝的異常の浸透度及びその発現度の如何に関わ らず危険性の検出を可能にする。この場合、本発明の方法は、症候前診断つまり 偶発的疾病の最初の症候の出現以前の診断を実現できるようにする。 最後に、当業者にとっては明白であるように、疾病又はより一般的には探究さ れる表現型が異なる点突然変異の組合せの結果である場合、各対立遺伝子につい て変動するサイズの増幅産物を提供する熱安定性ポリメラーゼと２つのプライマ による増幅の原理自体、増幅産物が各々産物によって異なる視覚化可能な規定の サイズを有するかぎりにおいて、これらの複数のプライマ対を結びつけることを 可能にするものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャンベル，ケビン，ピー アメリカ合衆国，アイオワ 52245，アイ オワ シティ，エバーグリーン コート 931

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸内の推測上のホモ接合体又はヘテロ接合体状態の検出方法において、 ２回の核酸増幅が使用され、これら２回の増幅がポリメラーゼと少なくとも２つ のプライマ対を使用すること、又 −第１のプライマ対は、野生型対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ）と 第２のオリゴヌクレオチド（Ｂ）で構成されており； −第２のプライマ対は、突然変異体対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ ′）及び第２のオリゴヌクレオチド（Ｃ）で構成されており、 それぞれ（Ａ）と（Ｂ）、（Ａ′）と（Ｃ）の間の増幅されたフラグメントの 間の長さの差は、核酸フラグメントの従来の分析方法によって検出されるのに充 分なものであることを特徴とする検出方法。 ２．第１対のプライマ（Ａ）がDNAの１ストランドとハイブリッド形成した場 合に、第２の対のプライマ（Ａ′）が相補的DNAのストランドとハイブリッド形 成することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．第１対のプライマ（Ａ）がDNAが１ストランドとハイブリッド形成する場 合、プライマ（Ａ′）はDNAの同じストランドとハイブリッド形成することを特 徴とする請求項１に記載の方法。 ４．増幅がPCRによって実施されるか又は、少なくとも２つのプライマと１つ のポリメラーゼを利用する派生的方法、特に「タッチダウン」PCRによって行な われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５．推測上の突然変異が点突然変異であることを特徴とする請求項１〜４のい ずれか１項に記載の方法。 ６．推定上の突然変異を検出しようとしている核酸が人間又は動物又はそれら の一部分に由来するものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に 記載の方法。 ７．推定上の突然変異の存在を検出しようとしている核酸が植物又はその一部 分に由来するものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の 方法。 ８．少なくとも ａ）熱安定性ポリメラーゼ、 ｂ）野生型対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ）及び第２のオリゴヌク レオチド（Ｂ）で構成された第１のプライマ対、 ｃ）突然変異体対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチド（Ａ′）及び第２のオリ ゴヌクレオチド（Ｃ）で構成された第２のプライマ対、 を含み、１方では（Ａ）と（Ｂ）、他方では（Ａ′）と（Ｃ）の間の増幅された フラグメントが従来方法によって視覚化可能な差異を有することを特徴とする、 核酸内の推定上のホモ接合体又はヘテロ接合体の突然変異の診断用キット。 ９．増幅されたフラグメントの間のサイズ差が少なくとも10％であることを特 徴とする請求項８に記載のキット。 10．PCR又は特に「タッチダウン」PCRといった派生的なあらゆる方法による増 幅を実施できるようにする要素をさらに収納することを特徴とする請求項９に記 載のキット。 11．診断される可能性のある突然変異が点突然変異であることを特徴とする請 求項９又は10のいずれか１項に記載のキット。 12．人間又は動物における遺伝子突然変異の検出に対する、請求項８〜11のい ずれか１項に記載の診断用キットの利用。 13．植物又はその一部分における遺伝子突然変異の検出に対する 、請求項８〜11のいずれか１項に記載の診断用キットの利用。 14．動物又は植物の種の選択に対する請求項８〜11のいずれか１項に記載の診 断用キットの利用。