CN113621704A

CN113621704A - 肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN113621704A
Application number: CN202110829039.4A
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 张玮; 董兰兰; 吴志诚; 李国强; 万康康; 李婷婷
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113621704B

Abstract

本申请提供一种肝癌检测和诊断的试剂及试剂盒，通过对TCF24基因CpG岛DNA甲基化水平的检测，实现肝癌诊断或辅助诊断，具有良好的灵敏度和特异性，该试剂在血液样本中仍具有优异检测效果，可应用于肝癌的无创检测以及早期筛查。

Description

肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因。原发性肝癌主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌-肝内胆管癌混合型3种不同病理学类型，其中肝细胞癌占85％～90％。由于肝细胞癌早期症状不明显，我国民众普遍缺乏疾病预防和体检意识，往往诊断时已经到达中晚期，失去手术机会。早筛早诊早治是降低肝细胞癌发病率与死亡率的有效方法，方便、安全、快捷、高通量的筛查方法尤为重要。

目前我国肝细胞癌诊疗指南推荐的方案是：高危人群，每隔6个月进行1 次肝脏超声检查和血清甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)检测，进行肝癌早期筛查。AFP是目前唯一可用的检测和监测肝癌的血液标志物，但AFP的灵敏度和特异性仅为58.2％和85.3％，难以满足肝细胞癌早筛早诊的临床需求。影像学检查对早期肝细胞癌的确诊仍然相当困难，在实际应用中易受病灶大小、机器灵敏度及操作者水平等因素的影响。为了提高我国肝细胞癌高风险人群的早诊比例，急需一种灵敏性和特异性高的检测方法来普及肝癌早筛并提高早期筛查的准确度。

现有技术表明血液中的循环肿瘤DNA(Ct DNA)与肿瘤组织中的DNA 有很强的一致性，然而目前已报道的肝细胞癌血液标记物很少，且灵敏性和准确性不高。

发明内容

本申请提供一种肝癌的检测试剂及试剂盒，可以用于肝癌诊断或辅助诊断，具有良好的灵敏度和特异性。

第一方面，本申请提供一种肝癌的检测和诊断的试剂，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自TCF24基因的CpG岛的全长或部分区域。

可选的，所述CpG岛的核苷酸序列为SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49所示核苷酸序列中的一种或两种。

可选的，所述部分区域的核苷酸序列包括SEQ ID NO.34至SEQ ID NO.44 所示核苷酸序列中的至少一种。

可选的，所述试剂包括：

(a)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点；以及

(b)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。

可选的，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物；和/或，

所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法及QuARTS(例如参见专利文献US8715937B2)法。

可选的，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异性检测所述靶核苷酸的甲基化特异性引物对和/或特异性探针。

可选的，所述引物对包括如下引物对中的任一组：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；

SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；

SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合；

SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的组合；

SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23的组合；

SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的组合；

SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29的组合；

和/或SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32的组合；

可选的，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、 SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、 SEQ ID NO.27、SEQID NO.30及SEQ ID NO.33中的至少一种。

可选的，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、血浆、肝脏组织及肝来源的细胞样本中的至少一种。

第二方面，本发明还提供一种用于肝癌的检测和诊断的试剂盒，包括第一方面所述的试剂。

有益效果：

本申请提供一种肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒，通过将TCF24基因作为目标基因，检测TCF24基因中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化，用于肝癌诊断或辅助诊断，具有良好的灵敏度和特异性，该试剂在血液样本中仍具有优异检测效果，为肝癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。

具体实施方式

本申请的发明人发现，TCF24基因CpG岛在肝癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，并且经大量及长期的实验证明：检测其CpG岛区域甲基化的增加可以对肝癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。

鉴于此，本申请提供了一种试剂，具体来说，所述试剂用于肝癌的检测、诊断或辅助诊断。所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自TCF24 CpG岛的全长或部分区域。

CpG岛是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤，其主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的区域，长度在200-3000bp之间，G和C的总含量超过50％。TCF24的CpG岛包括如下序列(5’-3’)：

CCGGCTTTAAACGCCTCTCCAGCCACCTGTGAACCGCGAAGGAGCC GGCTTTCGCGGCGGGGACCTTGCCACCAGTACCCTCGCGGGCCGAGGTC GTTCTCCCGGTCGGCTTCCCGCCTCACCCGAAAAGGAATTAGAGCATCTA CCCAAGACGGTGACTGGCAGGGCAGATCAAGGTGTCCTGGTCTCGGCCC CAGCCCCGCGGTGCGCCCCGCCCGCTTACCTTGACCGGGTGCAGGTAGC CATCGCCGCGCAGGGCGCCCAACCCGGCGTCCGCCGGCGCCTCGGCGTCGTCCTGCAGGCTGCGGGTGAGATGCGCGATGTAGGTGGTGGCCAGCAGC AGCACGTCCAGCTTGGACAGCTTGGTGTCGGGCGGCACGGACGGCAGC GTGCGCTGCAGCTCCAGGAAAGCGTGCCGCAGGGTCTGCACCCGGCTG CGCTCCCGCGCCGCATTCGCCGCCGCCGGCCGCCCGCTCCCGGAACGCG AGCCGCCCCCAGGGCCCGCCGGCCCCGGCCCGGTCCGCCCGGGACGCG AGTCGCGGATGGCGGCGGCCAGGGGCGCGGGCTCGGCGCTGGCGCTGA GGGGGCTGCCCGCTGGGCGGCCGCGGTCCATGGCAGCTTCCCGCGCCGC GCGCGCTGCAAAGGACCGAAGGTGCGGTGAGGCCGGGGGGCGGTCGGG CTTAACCCGAGAGGCGCAGCCCCCTGGTTCTCCCCGTGCGCCCACCAGC AGCCCAACGGGGCTAAGGGCGCTCTCAAGCGAGCTCGTTTTGCCTGGGA CGCGATTTGCTTCCGGACGTCTGGGGAGAGTTGCGGAACTCCGGAGTTC TTGGGCTTCCTAGAAGGATAAGAAGAGGCGCAGTGCCGGCTTTGCTTTT CAGGGGCAAATTAAGCAAAAGGTCTACTCTACCCGGGAAGAAAGATCTC GGAAGCACAGCTCAGGATCAGCACTCGTTCGCGCTTGGGTGACTTTATC CAACCCGGCACGCACGAGAGGTGGCGCGGCTCCTTCTCGCCGACGCCG CGGAAAACCACGGCTCACCAGCCGCCCTCGGCCTTTCACGCCAGGGGG GATTTCTGCCCGAGGAGCGGGGGACCCTTAGCCTCACCTCGGGGTACGG CACCCGCCACCGTTCCGAGCCCGAGAGCTGCGCAGTACGCGTCTGACGG GCCCCTCACCTTTCCTGGAGCGGCTGAGTGGAGCTCCGCTCCGTCGTGA GGGCGGGCGAGGGGCGTGGAGCAGGGCCTGTGTGGCCAGGGCCGCGCT GGTCACTCCATCCTCGTCCGGCCGATGCCCAAGTCGACGGCTGTTTCCAA CCTCCGCTGGCTGTGACTTTTATGCGGGCGCCCCGCGGCCAGGCGTGTG TGCTCCGACCGGCTAAGGCAGGTCGGGCGGAGGACCTGGCCCACCGGAGAGGCTACGCCGGGGGCTGAGGCGGCTTAGAGGGTCATTAATCAAACCC TCCGGCGGGGCGGGCTCGGGGGCGGGGCGTCCTCCTGGCCCCGCCCCTC GGCTCACTGCCTCACGCTGCTTTCCCCGAGGCGCCTCGCTGAGGGCGGC GTGTGGAGAGTTTGGGGTGTCTGCCGCCGGCTGCGGTGGGGCCGGGCTG GAGGCCGCGGGTGAGGCCTGTGGTTAACCTCGCGCTGCCGAGGTCTTAC CTCCTCGAGTCCAGTCTGATTCCAGGCCGCTTCCAGGCCGGTGCCCAGC TGAGGCGGGAACGCTGCAGTTTGGTTGAGCGTGACTTTTAGGCTCTGTG AGGAAAAGTCGAGCGCGCCACATCGAGGCGCTAGCCGTTTATTCTACCA CAAGGTAAAAGATTCATGCTGTCCTAGTTACCCTAAAGCTGGGAGATACA CTGCACTTCCTACCAGACCCCGAATGCTCTCAGTGTCTGTAATTCTTTAA GAAGTTCCTAGAGCAGACAGCCCTTGGATCGTGGGCACTTCTCCCCGGG GACGGGGACCCTGCTGACCGCCTCCGCTGCCCCCGCGGGGGCCACCGCT CTTTAATTATTTGGGCGAAACATTCTTTTCTGGTTTTGCACTTGTGGACTC ACGGGAAGCGTGACTTGCAGCGAGGCAGGACCCGATCCCAGGCTTCTTT AGAAAGCGGACGCTGCGCCCCAAGGCCTGTTCAGAGCCGCCCCAGGAA GCCGTGGGTCCCCGACCGCCCCAAACCGCAGCGGTTTCTGCAGGTCCTG GACCCGTCGCCTT。

上述序列(SEQ ID NO.48)在染色体上的位置为Chr8:66961153-66963363 (以hg38基因组为参考)。

所述CpG岛还包括上述区域的反向互补区域SEQ ID NO.49。

术语“DNA甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。

TCF24基因位于人8号染色体，具体位置为Chr8:66946501-66962592bp(负链)，本申请中提到的位点或区域的位置均是以hg38为参考。

本领域技术人员可以理解的是，所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。

在一些实施例中，所述CpG岛区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.48至SEQ ID NO.49中的一种或两种，或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、 80％、90％、95％或99％的同一性的序列。所述部分区域为为选自SEQ ID NO.48至SEQ ID NO.49核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸。

具体来说，所述SEQ ID NO.48为Chr8:66961153-66963363bp区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.49为Chr8:66963363-66961153bp区域负义链上的核苷酸序列。

两个核酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment) 后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。同一性百分比或一致性百分比意指在最佳比对(bestalignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的百分比，该百分比是纯粹统计学的，且两个序列之间的差异随机地分布并分布在其整个长度上。通常，这种序列的比较可以手动进行，也可以利用序列比对工具(例如Blast或其他在线序列比对软件)进行。

在一些实施例中，所述部分区域包括SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.44中的至少一种。选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的同一性的序列。

具体来说，所述SEQ ID NO.34为Chr8:66961175-66961324bp区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.35为Chr8:66961475-66961563bp区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.36为Chr8:66961543-66961662bp区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.37为Chr8:66961643-66961805bp区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ IDNO.38为Chr8:66961827-66961968bp区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.39为Chr8:66962825-66962909bp 区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.40为Chr8:66963065-66963141 区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.41为Chr8:66961457-66961242 bp区域的负义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.42为 Chr8:66961770-66961680bp区域的负义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.43 为Chr8:66961955-66961829bp区域的负义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.44为Chr8:66963127-66962925bp区域的负义链上的核苷酸序列；

在一些实施例中，所述试剂包括：

(c)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点；以及

(d)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。

作为示例性方案，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物。

作为示例性方案，所述甲基化检测方法包括：基于重亚硫酸盐转化的PCR (例如甲基化特异性PCR)、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR 法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法及 QuARTS法。

在一些实施例中，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异性检测所述靶核苷酸的甲基化特异性引物对和/或特异性探针。

“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。

作为示例性方案，所述引物对包括如下引物对中的任一组：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；

SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；

SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合；

SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的组合；

SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23的组合；

SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的组合；

SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29的组合；

SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32的组合；和/或，选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物。

“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过 PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。

作为示例性方案，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、 SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、 SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.30及SEQ ID NO.33中的至少一种，或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性探针。

本申请实施例中，所述探针为Taqman探针，标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，在一些实施方式中，所述探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光猝灭基团为MGB。

在一些实施例中，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，包括人、非人类灵长动物。所述哺乳动物的离体生物学样本可以来自体液、血液、血清、血浆、血细胞、腹水、淋巴液、间质液、组织样本及肝来源的细胞样本中的至少一种，本发明优选采用血液、血浆或血清作为检测样本。当所述样本例如来自血液、血浆或血清时，所述试剂可适用于无创检测。

本申请一种用于肝癌的检测和诊断的试剂盒，包括以上任一项实施例所述的试剂。

本申请还提供了用于肝癌的检测和诊断的芯片，所述芯片能够特异性检测 DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自TCF24基因CpG岛的全长或部分区域。

本申请还提供一种以上实施例所述试剂盒的使用方法，该方法包括：

(1)提取DNA样品；

(2)加入反应试剂，对所述DNA样品进行处理；

(3)加入检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述DNA样品中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应。所述靶核苷酸序列源自TCF24 基因CpG岛的全长或部分区域。具体的，所述反应试剂能差异修饰所述DNA 样本中的甲基化位点和非甲基化位点，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸的特定CpG中的胞嘧啶是甲基化的还是非甲基化的，或者进一步计算或评估靶核苷酸序列中的CpG二核苷酸位点发生甲基化的比例。

下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。

实施例1

本实施例提供用于肝癌的检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂1，该PCR 试剂1包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂1可检测TCF24基因上Chr8:66961175-66961324区域(编号为区域1)正链的甲基化；

区域1正链碱基序列如下：

CCACCTGTGAACCGCGAAGGAGCCGGCTTTCGCGGCGGGGACCTTG CCACCAGTACCCTCGCGGGCCGAGGTCGTTCTCCCGGTCGGCTTCCCGC CTCACCCGAAAAGGAATTAGAGCATCTACCCAAGACGGTGACTGGCAGG GCAGAT。

实施例2

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂2，该PCR试剂2包括SEQID NO.3-SEQ ID NO.6所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR试剂2可检测TCF24基因上Chr8:66961475-66961563区域(编号为区域2)正链的甲基化；

区域2正链碱基序列如下：

GTAGGTGGTGGCCAGCAGCAGCACGTCCAGCTTGGACAGCTTGGTG TCGGGCGGCACGGACGGCAGCGTGCGCTGCAGCTCCAGGAAAG。

实施例3

本实施例提供用肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂3，该PCR试剂3 包括SEQID NO.7-SEQ ID NO.9所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR试剂3 可检测TCF24基因上Chr8:66961543-66961662区域(编号为区域3)正链的甲基化；

区域3正链碱基序列如下：

TGCGCTGCAGCTCCAGGAAAGCGTGCCGCAGGGTCTGCACCCGGCT GCGCTCCCGCGCCGCATTCGCCGCCGCCGGCCGCCCGCTCCCGGAACGC GAGCCGCCCCCAGGGCCCGCCGGCC。

实施例4

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂4，该PCR试剂4包括SEQID NO.10-SEQ ID NO.12所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂4可检测TCF24基因上Chr8:66961643-66961805区域(编号为区域4)正链的甲基化；

区域4正链碱基序列如下：

GCCCCCAGGGCCCGCCGGCCCCGGCCCGGTCCGCCCGGGACGCGA GTCGCGGATGGCGGCGGCCAGGGGCGCGGGCTCGGCGCTGGCGCTGAG GGGGCTGCCCGCTGGGCGGCCGCGGTCCATGGCAGCTTCCCGCGCCGCGCGCGCTGCAAAGGACCGAAGG。

实施例5

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂5，该PCR试剂5包括SEQID NO.13-SEQ ID NO.15所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂5可检测TCF24基因上Chr8:66961827-66961968区域(编号为区域5)正链的甲基化；

区域5正链碱基序列如下：

TCGGGCTTAACCCGAGAGGCGCAGCCCCCTGGTTCTCCCCGTGCGC CCACCAGCAGCCCAACGGGGCTAAGGGCGCTCTCAAGCGAGCTCGTTTT GCCTGGGACGCGATTTGCTTCCGGACGTCTGGGGAGAGTTGCGGAAC。

实施例6

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂6，该PCR试剂6包括SEQID NO.16-SEQ ID NO.18所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂6可检测TCF24基因上Chr8:66962825-66962909区域(编号为区域6)正链的甲基化；

区域6正链碱基序列如下：

TGATTCCAGGCCGCTTCCAGGCCGGTGCCCAGCTGAGGCGGGAACG CTGCAGTTTGGTTGAGCGTGACTTTTAGGCTCTGTGAGG。

实施例7

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂7，该PCR试剂7包括SEQID NO.19-SEQ ID NO.21所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂7可检测TCF24基因上Chr8:66963065-66963141区域(编号为区域7)正链的甲基化；

区域7负链碱基序列如下：

AGAGCAGACAGCCCTTGGATCGTGGGCACTTCTCCCCGGGGACGGGGACCCTGCTGACCGCCTCCGCTGCCCCCGCG。

实施例8

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂8，该PCR试剂8包括SEQID NO.22-SEQ ID NO.24所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂8可检测TCF24基因上Chr8:66961457-66961242区域(编号为区域8)负链的甲基化；

区域8负链碱基序列如下：

CAGCCTGCAGGACGACGCCGAGGCGCCGGCGGACGCCGGGTTGGG CGCCCTGCGCGGCGATGGCTACCTGCACCCGGTCAAGGTAAGCGGGCGG GGCGCACCGCGGGGCTGGGGCCGAGACCAGGACACCTTGATCTGCCCTGCCAGTCACCGTCTTGGGTAGATGCTCTAATTCCTTTTCGGGTGAGGCGG GAAGCCGACCGGGAGAACGACCTC。

实施例9

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂9，该PCR试剂9包括SEQID NO.25-SEQ ID NO.27所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂9可检测TCF24基因上Chr8:66961770-66961680区域(编号为区域9)负链的甲基化；

区域9负链碱基序列如下：

CTGCCATGGACCGCGGCCGCCCAGCGGGCAGCCCCCTCAGCGCCAG CGCCGAGCCCGCGCCCCTGGCCGCCGCCATCCGCGACTCGCGTCC。

实施例10

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂10，该PCR试剂10包括SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.30所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂10可检测TCF24基因上Chr8:66961955-66961829区域(编号为区域10)负链的甲基化；

区域10负链碱基序列如下：

CCCCAGACGTCCGGAAGCAAATCGCGTCCCAGGCAAAACGAGCTC GCTTGAGAGCGCCCTTAGCCCCGTTGGGCTGCTGGTGGGCGCACGGGGA GAACCAGGGGGCTGCGCCTCTCGGGTTAAGCCC。

实施例11

本实施例提供用于肝癌检测和诊断的试剂，其包括PCR试剂11，该PCR试剂11包括SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.33所示的核苷酸，具体序列见表1。该PCR 试剂11可检测TCF24基因上Chr8:66963127-66962925区域(编号为区域11)负链的甲基化；

区域11负链碱基序列如下：

AGGCGGTCAGCAGGGTCCCCGTCCCCGGGGAGAAGTGCCCACGAT CCAAGGGCTGTCTGCTCTAGGAACTTCTTAAAGAATTACAGACACTGAG AGCATTCGGGGTCTGGTAGGAAGTGCAGTGTATCTCCCAGCTTTAGGGTA ACTAGGACAGCATGAATCTTTTACCTTGTGGTAGAATAAACGGCTAGCGC CTCGATGTG。

表1.实施例1至实施例11中涉及的目标基因、引物和探针

实施例12

本实施例提供使用实施例1-实施例11任意一种试剂进行肝癌诊断的方法，其包括如下步骤：

(1)血浆DNA提取和转化

首先将5mL血液在1300×g转速下离心12分钟以分离血浆，血浆应放在-80℃冰箱保存直至使用，用试剂盒提取血浆中DNA，用EpiTech Bisulfite Kit对提取好的DNA进行亚硫酸氢盐转化，具体操作参见厂家说明书。经过转化，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶不变，尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤(A)配对，胞嘧啶与鸟嘌呤(G)配对，以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。

(2)阳性对照、阴性对照制备

每个基因的阳性对照和阴性对照均为构建到载体上的人工合成序列，人工合成序列的碱基组成参照待扩增目的片段的序列设计而成，阴性对照中所有胞嘧啶C的位置都设计为T，阳性对照中除CG二核苷酸位置的C为C外，其他位置的C都设计为T，其他位置的核苷酸与待扩增目的片段相同。

(3)PCR反应

以β-actin作为内参基因，以PCR反应体系如表2所示。β-actin作为内参基因，其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.45)；β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.46)；β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ IDNO.47)。

检测目标区域的探针为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。

表2.实施例12中涉及的PCR反应体系中各组分配方成分表

如表2所示，在检测区域1-区域11任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、β-actin引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。

PCR反应条件如下表3所示。

表3.实施例10的PCR反应条件

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2 个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，区域1-11的阳性对照分别为含有目标扩增序列的人工合成质粒，举例来说，区域1阳性对照的制备方法为：将SEQ ID NO.34中所有的CG二核苷酸中的C保持不变，其余的C全部变成T，剩余位置的碱基序列与SEQ ID NO.34 对应位置的碱基相同，得到的序列用于人工合成，将合成的序列构建至载体上。区域2-11的阳性对照制备方法与区域1相同，人工序列的合成分别参照SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.44。

阳性对照浓度为10³拷贝/微升，阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果分析和判读方法：若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性：

灵敏度(Sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；

特异性(Specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。

具体到本实施例中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。

实验例1

从武汉某医院共搜集143例肝癌患者的肝组织样本和50例癌旁组织样本，按照实施例12中所述方法对进行基因组提取、亚硫酸氢盐转化，并用转化后的 DNA作为模板，选用实施例1至实施例11中的针对TCF24基于11个区域的甲基化特异性引物和探针组合进行PCR检测。检测结果如下表4所示。

表4.区域1-区域11在肝组织样本中的检测灵敏度和特异性

由表4的结果可知，对于组织样本，实施例1-实施例11的试剂在肝癌患者检测诊断中，均有良好的灵敏度和特异性。其中，实施例1至实施例11在肝癌患者的组织样本中的灵敏度均在80％以上，对肝癌癌旁组织的检测特异性均不低于90％。尤其是实施例2-实施例5、实施例9和实施例10的检测灵敏度最优，均大于90％；且检测特异性均也均不低于90％。

实验例2

从武汉某医院共搜集到120例健康人的血液样本、56例肝硬化血液样本和 95例肝癌患者(37例临床分期为I/II期，58例临床分期)的血液样本，按照实施例12中所述方法进行血浆分离、基因组提取、亚硫酸氢盐转化，并用转化后的DNA作为模板，选用实施例1至实施例11中的针对TCF24基于11个区域的甲基化特异性引物和探针组合进行PCR检测。检测如下表5所示。

表5.区域1-11在血浆样本中的检测灵敏度和特异性

由表5的结果可知，对于血浆样本，实施例1-实施例11的试剂在肝癌患者检测诊断中，均有良好的灵敏度和特异性。其中，实施例1-实施例11对肝癌血浆样本的检测灵敏度均在60％以上，除实施例11以外，实施例1-实施例10在肝硬化血浆样本中的检测特异性均在90％以上，实施例1-实施例11健康人血浆的检测特异性均在90％以上。尤其是实施例2-实施例5和实施例10的检测灵敏度最优，均大于70％且检测特异性均大于90％。

综上，无论是采用组织样本还是血液样本，实施例1-实施例11的试剂在肝癌患者检测诊断中，均有良好的灵敏度和特异性，说明将TCF24基因作为目标基因，检测TCF24基因中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化，可用于肝癌诊断或辅助诊断具有良好的灵敏度和特异性，并且该试剂在应用于血液样本中，可简化取样环节，减小取样创伤，可提高检测试剂的普及性，为肝癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。此外，值得注意的是，发明人还发现TCF24 基因上的特定CpG岛区域(即：SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37、 SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43)上的CpG岛区域在肝癌中的甲基化水平显著高于其他区域，并经过实验验证以这些特定CpG岛区域作为靶核苷酸检测的试剂具有更优的灵敏度和特异性，由于这些特定区域的干扰更少，因此可进一步提高检测的灵敏度和特异性，对于肝癌的诊断或辅助诊断具有重要的意义。

以上对本申请所提供的一种肝癌检测和诊断的试剂及试剂盒，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。

序列表

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒

<141> 2021-07-22

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttatttgtga atcgcgaagg agtc 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atctacccta ccaatcaccg tctta 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttagtatttt cgcgggtcga ggtc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gtaggtggtg gttagtagta gtacg 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctttcctaaa actacaacgc acg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tttggatagt ttggtgtcgg gc 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgcgttgtag ttttaggaaa gcgt 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

aaccgacgaa ccctaaaaac gac 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tattcggttg cgttttcgcg tc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gtttttaggg ttcgtcggtt tc 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccttcgatcc tttacaacgc g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ttggcgttga gggggttgtt c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tcgggtttaa ttcgagaggc 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

attccgcaac tctccccaaa c 21

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agtagtttaa cggggttaag ggcgt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tgattttagg tcgtttttag gtcgg 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cctcacaaaa cctaaaaatc acgc 24

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ttagttgagg cgggaacgtt gtagt 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

agagtagata gtttttggat cgtgg 25

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

cgcgaaaaca acgaaaacg 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ttcggggacg gggattttgt t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

tagtttgtag gacgacgtcg a 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gaaatcgttc tcccgatcga 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

acgtcgggtt gggcgtttt 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ttgttatgga tcgcggtcgt t 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

aaacgcgaat cgcgaataac 20

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

ttttagcgtt agcgtcgagt tcg 23

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

ttttagacgt tcggaagtaa atcgc 25

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

gaacttaacc cgaaaaacgc aa 22

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

taaaacgagt tcgtttgaga gcgtt 25

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

aggcggttag tagggttttc g 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

cacatcgaaa cgctaaccgt t 21

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

tcggggagaa gtgtttacga tttaa 25

<210> 34

<211> 150

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

ccacctgtga accgcgaagg agccggcttt cgcggcgggg accttgccac cagtaccctc 60

gcgggccgag gtcgttctcc cggtcggctt cccgcctcac ccgaaaagga attagagcat 120

ctacccaaga cggtgactgg cagggcagat 150

<210> 35

<211> 89

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

gtaggtggtg gccagcagca gcacgtccag cttggacagc ttggtgtcgg gcggcacgga 60

cggcagcgtg cgctgcagct ccaggaaag 89

<210> 36

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

tgcgctgcag ctccaggaaa gcgtgccgca gggtctgcac ccggctgcgc tcccgcgccg 60

cattcgccgc cgccggccgc ccgctcccgg aacgcgagcc gcccccaggg cccgccggcc 120

<210> 37

<211> 163

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 37

gcccccaggg cccgccggcc ccggcccggt ccgcccggga cgcgagtcgc ggatggcggc 60

ggccaggggc gcgggctcgg cgctggcgct gagggggctg cccgctgggc ggccgcggtc 120

catggcagct tcccgcgccg cgcgcgctgc aaaggaccga agg 163

<210> 38

<211> 142

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 38

tcgggcttaa cccgagaggc gcagccccct ggttctcccc gtgcgcccac cagcagccca 60

acggggctaa gggcgctctc aagcgagctc gttttgcctg ggacgcgatt tgcttccgga 120

cgtctgggga gagttgcgga ac 142

<210> 39

<211> 85

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39

tgattccagg ccgcttccag gccggtgccc agctgaggcg ggaacgctgc agtttggttg 60

agcgtgactt ttaggctctg tgagg 85

<210> 40

<211> 77

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

agagcagaca gcccttggat cgtgggcact tctccccggg gacggggacc ctgctgaccg 60

cctccgctgc ccccgcg 77

<210> 41

<211> 216

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

cagcctgcag gacgacgccg aggcgccggc ggacgccggg ttgggcgccc tgcgcggcga 60

tggctacctg cacccggtca aggtaagcgg gcggggcgca ccgcggggct ggggccgaga 120

ccaggacacc ttgatctgcc ctgccagtca ccgtcttggg tagatgctct aattcctttt 180

cgggtgaggc gggaagccga ccgggagaac gacctc 216

<210> 42

<211> 91

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 42

ctgccatgga ccgcggccgc ccagcgggca gccccctcag cgccagcgcc gagcccgcgc 60

ccctggccgc cgccatccgc gactcgcgtc c 91

<210> 43

<211> 127

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 43

ccccagacgt ccggaagcaa atcgcgtccc aggcaaaacg agctcgcttg agagcgccct 60

tagccccgtt gggctgctgg tgggcgcacg gggagaacca gggggctgcg cctctcgggt 120

taagccc 127

<210> 44

<211> 203

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 44

aggcggtcag cagggtcccc gtccccgggg agaagtgccc acgatccaag ggctgtctgc 60

tctaggaact tcttaaagaa ttacagacac tgagagcatt cggggtctgg taggaagtgc 120

agtgtatctc ccagctttag ggtaactagg acagcatgaa tcttttacct tgtggtagaa 180

taaacggcta gcgcctcgat gtg 203

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

ggagtggttt ttgggtttg 19

<210> 48

<211> 2211

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 48

ccggctttaa acgcctctcc agccacctgt gaaccgcgaa ggagccggct ttcgcggcgg 60

ggaccttgcc accagtaccc tcgcgggccg aggtcgttct cccggtcggc ttcccgcctc 120

acccgaaaag gaattagagc atctacccaa gacggtgact ggcagggcag atcaaggtgt 180

cctggtctcg gccccagccc cgcggtgcgc cccgcccgct taccttgacc gggtgcaggt 240

agccatcgcc gcgcagggcg cccaacccgg cgtccgccgg cgcctcggcg tcgtcctgca 300

ggctgcgggt gagatgcgcg atgtaggtgg tggccagcag cagcacgtcc agcttggaca 360

gcttggtgtc gggcggcacg gacggcagcg tgcgctgcag ctccaggaaa gcgtgccgca 420

gggtctgcac ccggctgcgc tcccgcgccg cattcgccgc cgccggccgc ccgctcccgg 480

aacgcgagcc gcccccaggg cccgccggcc ccggcccggt ccgcccggga cgcgagtcgc 540

ggatggcggc ggccaggggc gcgggctcgg cgctggcgct gagggggctg cccgctgggc 600

ggccgcggtc catggcagct tcccgcgccg cgcgcgctgc aaaggaccga aggtgcggtg 660

aggccggggg gcggtcgggc ttaacccgag aggcgcagcc ccctggttct ccccgtgcgc 720

ccaccagcag cccaacgggg ctaagggcgc tctcaagcga gctcgttttg cctgggacgc 780

gatttgcttc cggacgtctg gggagagttg cggaactccg gagttcttgg gcttcctaga 840

aggataagaa gaggcgcagt gccggctttg cttttcaggg gcaaattaag caaaaggtct 900

actctacccg ggaagaaaga tctcggaagc acagctcagg atcagcactc gttcgcgctt 960

gggtgacttt atccaacccg gcacgcacga gaggtggcgc ggctccttct cgccgacgcc 1020

gcggaaaacc acggctcacc agccgccctc ggcctttcac gccagggggg atttctgccc 1080

gaggagcggg ggacccttag cctcacctcg gggtacggca cccgccaccg ttccgagccc 1140

gagagctgcg cagtacgcgt ctgacgggcc cctcaccttt cctggagcgg ctgagtggag 1200

ctccgctccg tcgtgagggc gggcgagggg cgtggagcag ggcctgtgtg gccagggccg 1260

cgctggtcac tccatcctcg tccggccgat gcccaagtcg acggctgttt ccaacctccg 1320

ctggctgtga cttttatgcg ggcgccccgc ggccaggcgt gtgtgctccg accggctaag 1380

gcaggtcggg cggaggacct ggcccaccgg agaggctacg ccgggggctg aggcggctta 1440

gagggtcatt aatcaaaccc tccggcgggg cgggctcggg ggcggggcgt cctcctggcc 1500

ccgcccctcg gctcactgcc tcacgctgct ttccccgagg cgcctcgctg agggcggcgt 1560

gtggagagtt tggggtgtct gccgccggct gcggtggggc cgggctggag gccgcgggtg 1620

aggcctgtgg ttaacctcgc gctgccgagg tcttacctcc tcgagtccag tctgattcca 1680

ggccgcttcc aggccggtgc ccagctgagg cgggaacgct gcagtttggt tgagcgtgac 1740

ttttaggctc tgtgaggaaa agtcgagcgc gccacatcga ggcgctagcc gtttattcta 1800

ccacaaggta aaagattcat gctgtcctag ttaccctaaa gctgggagat acactgcact 1860

tcctaccaga ccccgaatgc tctcagtgtc tgtaattctt taagaagttc ctagagcaga 1920

cagcccttgg atcgtgggca cttctccccg gggacgggga ccctgctgac cgcctccgct 1980

gcccccgcgg gggccaccgc tctttaatta tttgggcgaa acattctttt ctggttttgc 2040

acttgtggac tcacgggaag cgtgacttgc agcgaggcag gacccgatcc caggcttctt 2100

tagaaagcgg acgctgcgcc ccaaggcctg ttcagagccg ccccaggaag ccgtgggtcc 2160

ccgaccgccc caaaccgcag cggtttctgc aggtcctgga cccgtcgcct t 2211

<210> 49

<211> 2211

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 49

aaggcgacgg gtccaggacc tgcagaaacc gctgcggttt ggggcggtcg gggacccacg 60

gcttcctggg gcggctctga acaggccttg gggcgcagcg tccgctttct aaagaagcct 120

gggatcgggt cctgcctcgc tgcaagtcac gcttcccgtg agtccacaag tgcaaaacca 180

gaaaagaatg tttcgcccaa ataattaaag agcggtggcc cccgcggggg cagcggaggc 240

ggtcagcagg gtccccgtcc ccggggagaa gtgcccacga tccaagggct gtctgctcta 300

ggaacttctt aaagaattac agacactgag agcattcggg gtctggtagg aagtgcagtg 360

tatctcccag ctttagggta actaggacag catgaatctt ttaccttgtg gtagaataaa 420

cggctagcgc ctcgatgtgg cgcgctcgac ttttcctcac agagcctaaa agtcacgctc 480

aaccaaactg cagcgttccc gcctcagctg ggcaccggcc tggaagcggc ctggaatcag 540

actggactcg aggaggtaag acctcggcag cgcgaggtta accacaggcc tcacccgcgg 600

cctccagccc ggccccaccg cagccggcgg cagacacccc aaactctcca cacgccgccc 660

tcagcgaggc gcctcgggga aagcagcgtg aggcagtgag ccgaggggcg gggccaggag 720

gacgccccgc ccccgagccc gccccgccgg agggtttgat taatgaccct ctaagccgcc 780

tcagcccccg gcgtagcctc tccggtgggc caggtcctcc gcccgacctg ccttagccgg 840

tcggagcaca cacgcctggc cgcggggcgc ccgcataaaa gtcacagcca gcggaggttg 900

gaaacagccg tcgacttggg catcggccgg acgaggatgg agtgaccagc gcggccctgg 960

ccacacaggc cctgctccac gcccctcgcc cgccctcacg acggagcgga gctccactca 1020

gccgctccag gaaaggtgag gggcccgtca gacgcgtact gcgcagctct cgggctcgga 1080

acggtggcgg gtgccgtacc ccgaggtgag gctaagggtc ccccgctcct cgggcagaaa 1140

tcccccctgg cgtgaaaggc cgagggcggc tggtgagccg tggttttccg cggcgtcggc 1200

gagaaggagc cgcgccacct ctcgtgcgtg ccgggttgga taaagtcacc caagcgcgaa 1260

cgagtgctga tcctgagctg tgcttccgag atctttcttc ccgggtagag tagacctttt 1320

gcttaatttg cccctgaaaa gcaaagccgg cactgcgcct cttcttatcc ttctaggaag 1380

cccaagaact ccggagttcc gcaactctcc ccagacgtcc ggaagcaaat cgcgtcccag 1440

gcaaaacgag ctcgcttgag agcgccctta gccccgttgg gctgctggtg ggcgcacggg 1500

gagaaccagg gggctgcgcc tctcgggtta agcccgaccg ccccccggcc tcaccgcacc 1560

ttcggtcctt tgcagcgcgc gcggcgcggg aagctgccat ggaccgcggc cgcccagcgg 1620

gcagccccct cagcgccagc gccgagcccg cgcccctggc cgccgccatc cgcgactcgc 1680

gtcccgggcg gaccgggccg gggccggcgg gccctggggg cggctcgcgt tccgggagcg 1740

ggcggccggc ggcggcgaat gcggcgcggg agcgcagccg ggtgcagacc ctgcggcacg 1800

ctttcctgga gctgcagcgc acgctgccgt ccgtgccgcc cgacaccaag ctgtccaagc 1860

tggacgtgct gctgctggcc accacctaca tcgcgcatct cacccgcagc ctgcaggacg 1920

acgccgaggc gccggcggac gccgggttgg gcgccctgcg cggcgatggc tacctgcacc 1980

cggtcaaggt aagcgggcgg ggcgcaccgc ggggctgggg ccgagaccag gacaccttga 2040

tctgccctgc cagtcaccgt cttgggtaga tgctctaatt ccttttcggg tgaggcggga 2100

agccgaccgg gagaacgacc tcggcccgcg agggtactgg tggcaaggtc cccgccgcga 2160

aagccggctc cttcgcggtt cacaggtggc tggagaggcg tttaaagccg g 2211

Claims

1.一种肝癌的检测和诊断的试剂，其特征在于，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自TCF24基因CpG岛的全长或部分区域。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述CpG岛的核苷酸序列为SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49所示核苷酸序列中的一种或两种。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述部分区域的核苷酸序列包括SEQ IDNO.34至SEQ ID NO.44所示核苷酸序列中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括：

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物；和/或，

所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法及QuARTs法。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异性检测所述靶核苷酸的甲基化特异性引物对和/或特异性探针。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述引物对包括如下引物对中的任一组：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；

SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；

SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合；

SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的组合；

SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23的组合；

SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的组合；

SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29的组合；和/或

SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32的组合。

8.根据权利要求6或7所述的试剂，其特征在于，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30及SEQ ID NO.33中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、血浆、肝脏组织及肝来源的细胞样本中的至少一种。

10.一种用于肝癌的检测和诊断的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至9任一项所述的试剂。