CN114941029A

CN114941029A - 肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒

Info

Publication number: CN114941029A
Application number: CN202210310901.5A
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 董兰兰; 张玮; 万康康; 李国强
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114941029B

Abstract

本发明涉及一种肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒。该生物标志物包括以下基因中的至少一种：IL12RB2、HENMT1、STRIP1、FAM228B、EGR4、NRP2、MST1R、FEZF2、TTC33、OXCT1、HIST1H4F、HIST1H3F、HIST1H4H、IL20RA、C6orf99、PRR15、DLX6‑AS1、GCC1、VIPR2、BNIP3L、ESRP1、NXNL2、PRKG1、HMX2、STX2、FZD2、MYCBPAP、TCAM1P、LIPE‑AS1和ZNF551，通过检测这些生物标志物的甲基化水平诊断肝癌，灵敏度和特异性好。

Description

肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒。

背景技术

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病率在全球范围内呈上升趋势。据估计，到2025年，全球每年将有100万人口罹患肝癌。据世界卫生组织发布的2018年全球范围内恶性肿瘤流行情况的数据显示：肝癌新发病例约84万人，在所有恶性肿瘤中位居第六名；死亡病例约78万人，在恶性肿瘤中位居第四名。因此，肝癌严重威胁人类的生命健康，是人类面临的重要公共卫生问题之一。

原发性肝癌包括肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)以及其它罕见的癌症，其中肝细胞肝癌是原发性肝癌最常见的形式，占比高达90％左右。乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素、嗜烟、酗酒、糖尿病、肥胖等是引发肝癌的主要原因。早期肝癌症状不明显，患者通常仅仅表现出非特异性的消化道症状，如食欲不振、恶心、呕吐等，因此很难在早期确诊。超过85％的肝癌患者在就诊时已经是中晚期，患者生存期不足2年。因此，肝癌早筛的意义重大，可以显著提高患者的生存期和生活质量，也可以大大减少癌症的治疗费用。

目前临床上常用的肝癌的诊断方法包括：腹部超声、血清学甲胎蛋白(AFP)检测、X线计算机断层成像(CT)、磁共振成像(MRI)及细针穿刺活检等。单独腹部彩超检查对早期肝癌诊断的灵敏度只有32％，单独血清甲胎蛋白检测对早期肝癌诊断的灵敏度约为32％-49％。彩超联合血清甲胎蛋白检测可将肝癌诊断的敏感性提升至63％左右，灵敏度仍较低。而其它影像学检查如CT或MRI等有辐射性，且花费较高，而且同超声一样，受医师操作水平和患者体型的影响。所以，整体来讲，这些方法或灵敏度低或对医师技术水平要求较高或花费较大或具有创伤性，难以满足早期筛查的需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种肝癌的生物标志物，以改善肝癌早期筛查的灵敏度较低的问题。

此外，还提供一种用于诊断肝癌的核酸产品和试剂盒。

一种肝癌的生物标物，所述生物标志物包括以下基因中的至少一种：IL12RB2、HENMT1、STRIP1、FAM228B、EGR4、NRP2、MST1R、FEZF2、TTC33、OXCT1、HIST1H4F、HIST1H3F、HIST1H4H、IL20RA、C6orf99、PRR15、DLX6-AS1、GCC1、VIPR2、BNIP3L、ESRP1、NXNL2、PRKG1、HMX2、STX2、FZD2、MYCBPAP、TCAM1P、LIPE-AS1和ZNF551，通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断肝癌。

经验证，通过将IL12RB2、HENMT1、STRIP1、FAM228B、EGR4、NRP2、MST1R、FEZF2、TTC33、OXCT1、HIST1H4F、HIST1H3F、HIST1H4H、IL20RA、C6orf99、PRR15、DLX6-AS1、GCC1、VIPR2、BNIP3L、ESRP1、NXNL2、PRKG1、HMX2、STX2、FZD2、MYCBPAP、TCAM1P、LIPE-AS1和ZNF551中的至少一种基因作为肝癌的生物标志物，检测其甲基化水平诊断或辅助诊断肝癌，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高早期肝癌的检出率。

在其中一个实施例中，以GRCh3p13为参考，通过检测以下区域中的至少一个区域的甲基化水平来诊断肝癌：Chr1：67307636～67307672、Chr2：24077340～24077424、Chr2：73291568～73291619、Chr2：205681880～205681982、Chr3：62374029～62374082、Chr5：40680840～40680920、Chr6：26240802～26240890、Chr6：26284599～26284639、Chr6：158870023～158870111、Chr7：29566410～29566466、Chr7：127585769～127585849、Chr7：159144032～159144065、Chr8：26448522～26448562、Chr8：94641809～94641865、Chr9：88535336～88535376、Chr10：123149988～123150054、Chr12：130819077～130819115、Chr17：63848873～63848967、Chr19：42397141～42397213、Chr19：57708712～57708795、Chr1：108661384～108661438、Chr1：110068977～110069062、Chr3：49903852～49903884、Chr5：41870353～41870412、Chr6：26250330～26250415、Chr6：137044175～137044243、Chr7：97005387～97005440、Chr10：50991252～50991292、Chr17：44558127～44558198和Chr17：50508557～50508652。

用于检测上述的肝癌的生物标志物的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。

一种核酸产品，用于诊断肝癌，所述核酸产品包括以下检测引物对中的至少一组：

用于检测IL12RB2基因甲基化水平的IL12RB2引物对、用于检测HENMT1基因甲基化水平的HENMT1引物对、用于检测STRIP1基因甲基化水平的STRIP1引物对、用于检测FAM228B基因甲基化水平的FAM228B引物对、用于检测EGR4基因甲基化水平的EGR4引物对、用于检测NRP2基因甲基化水平的NRP2引物对、用于检测MST1R基因甲基化水平的MST1R引物对、用于检测FEZF2基因甲基化水平的FEZF2引物对、用于检测TTC33基因甲基化水平的TTC33引物对、用于检测OXCT1基因甲基化水平的OXCT1引物对、用于检测HIST1H4F基因甲基化水平的HIST1H4F引物对、用于检测HIST1H3F基因甲基化水平的HIST1H3F引物对、用于检测HIST1H4H基因甲基化水平的HIST1H4H引物对、用于检测IL20RA基因甲基化水平的IL20RA引物对、用于检测C6orf99基因甲基化水平的C6orf99引物对、用于检测PRR15基因甲基化水平的PRR15引物对、用于检测DLX6-AS1基因甲基化水平的DLX6-AS1引物对、用于检测GCC1基因甲基化水平的GCC1引物对、用于检测VIPR2基因甲基化水平的VIPR2引物对、用于检测BNIP3L基因甲基化水平的BNIP3L引物对、用于检测ESRP1基因甲基化水平的ESRP1引物对、用于检测NXNL2基因甲基化水平的NXNL2引物对、用于检测PRKG1基因甲基化水平的PRKG1引物对、用于检测HMX2基因甲基化水平的HMX2引物对、用于检测STX2基因甲基化水平的STX2引物对、用于检测FZD2基因甲基化水平的FZD2引物对、用于检测MYCBPAP基因甲基化水平的MYCBPAP引物对、用于检测TCAM1P基因甲基化水平的TCAM1P引物对、用于检测LIPE-AS1基因甲基化水平的LIPE-AS1引物对和用于检测ZNF551基因甲基化水平的ZNF551引物对。

在其中一个实施例中，以GRCh3p13为参考，所述IL12RB2引物对用于扩增Chr1：67307636～67307672区域内的核酸片段，所述FAM228B引物对用于扩增Chr2：24077340～24077424区域内的核酸片段，所述EGR4引物对用于扩增Chr2：73291568～73291619区域内的核酸片段，所述NRP2引物对用于扩增Chr2：205681880～205681982区域内的核酸片段，所述FEZF2引物对用于扩增Chr3：62374029～62374082区域内的核酸片段，所述TTC33引物对用于扩增Chr5：40680840～40680920区域内的核酸片段，所述HIST1H4F引物对用于扩增Chr6：26240802～26240890区域内的核酸片段，所述HIST1H4H引物对用于扩增Chr6：26284599～26284639区域内的核酸片段，所述C6orf99引物对用于扩增Chr6：158870023～158870111区域内的核酸片段，所述PRR15引物对用于扩增Chr7：29566410～29566466区域内的核酸片段，所述GCC1引物对用于扩增Chr7：127585769～127585849区域内的核酸片段，所述VIPR2引物对用于扩增Chr7：159144032～159144065区域内的核酸片段，所述BNIP3L引物对用于扩增Chr8：26448522～26448562区域内的核酸片段，所述ESRP1引物对用于扩增Chr8：94641809～94641865区域内的核酸片段，所述NXNL2引物对用于扩增Chr9：88535336～88535376区域内的核酸片段，所述HMX2引物对用于扩增Chr10：123149988～123150054区域内的核酸片段，所述STX2引物对用于扩增Chr12：130819077～130819115区域内的核酸片段，所述TCAM1P引物对用于扩增Chr17：63848873～63848967区域内的核酸片段，所述LIPE-AS1引物对用于扩增Chr19：42397141～42397213区域内的核酸片段，所述ZNF551引物对用于扩增Chr19：57708712～57708795区域内的核酸片段，所述HENMT1引物对用于扩增Chr1：108661384～108661438区域内的核酸片段，所述STRIP1引物对用于扩增Chr1：110068977～110069062区域内的核酸片段，所述MST1R引物对用于扩增Chr3：49903852～49903884区域内的核酸片段，所述OXCT1引物对用于扩增Chr5：41870353～41870412区域内的核酸片段，所述HIST1H3F引物对用于扩增Chr6：26250330～26250415区域内的核酸片段，所述IL20RA引物对用于扩增Chr6：137044175～137044243区域内的核酸片段，所述DLX6-AS1引物对用于扩增Chr7：97005387～97005440区域内的核酸片段，所述PRKG1引物对用于扩增Chr10：50991252～50991292区域内的核酸片段，所述FZD2引物对用于扩增Chr17：44558127～44558198区域内的核酸片段，所述MYCBPAP引物对用于扩增Chr17：50508557～50508652区域内的核酸片段。

在其中一个实施例中，所述IL12RB2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示；和/或，所述FAM228B引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：3～4所示；和/或，所述EGR4引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：5～6所示；和/或，所述NRP2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：7～8所示；和/或，所述FEZF2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：9～10所示；和/或，所述TTC33引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：11～12所示；和/或，所述HIST1H4F引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：13～14所示；和/或，所述HIST1H4H引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：15～16所示；和/或，所述C6orf99引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：17～18所示；和/或，所述PRR15引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：19～20所示；和/或，所述GCC1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：21～22所示；和/或，所述VIPR2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：23～24所示；和/或，所述BNIP3L引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：25～26所示；和/或，所述ESRP1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：27～28所示；和/或，所述NXNL2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：29～30所示；和/或，所述HMX2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：31～32所示；和/或，所述STX2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：33～34所示；和/或，所述TCAM1P引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：35～36所示；和/或，所述LIPE-AS1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：37～38所示；和/或，所述ZNF551引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：39～40所示；所述HENMT1引物对包括核苷酸序列如SEQIDNO：41～44所示的引物对；和/或，所述STRIP1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：45～48所示；和/或，所述MST1R引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：49～52所示；和/或，所述OXCT1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：53～56所示；和/或，所述HIST1H3F引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：57～60所示；和/或，所述IL20RA引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：61～64所示；和/或，所述DLX6-AS1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：65～68所示；和/或，所述PRKG1引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：69～72所示；所述FZD2引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：73～76所示；和/或，所述MYCBPAP引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：77～80所示。

在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有荧光基团。

一种诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒利用下述方法中的至少一种检测上述的生物标志物的甲基化水平而诊断肝癌：甲基化特异性PCR法、甲基化特异性荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括上述的用于诊断肝癌的核酸产品。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。

术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的编码区和非编码区，编码区包括外显子和内含子序列。

术语“寡核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“CpG岛”指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。

术语“CpG岛区域甲基化水平”指的是CpG岛内一个或多个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化水平。术语“甲基化位点”指的是区域中至少一个CpG二核苷酸位点，尤其指区域中至少一个CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。

术语“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。

术语“全基因组亚硫酸氢盐测序”是将样本的基因组进行亚硫酸氢盐处理，并结合高通量测序技术，在单碱基分辨率水平检测DNA中胞嘧啶甲基化情况。需要说明的是，在本文中肝癌包括原发性肝细胞癌和肝内胆管癌。肝脏其他病变包括肝脏良性病变(肝血管瘤、肝囊肿、肝内钙化灶)，HBV感染的非癌患者或肝硬化。

本申请一实施方式提供了一种肝癌的生物标物，该生物标志物包括以下基因中的至少一种：IL12RB2、HENMT1、STRIP1、FAM228B、EGR4、NRP2、MST1R、FEZF2、TTC33、OXCT1、HIST1H4F、HIST1H3F、HIST1H4H、IL20RA、C6orf99、PRR15、DLX6-AS1、GCC1、VIPR2、BNIP3L、ESRP1、NXNL2、PRKG1、HMX2、STX2、FZD2、MYCBPAP、TCAM1P、LIPE-AS1和ZNF551。上述基因作为肝癌的生物标志物，通过检测其甲基化水平诊断或辅助诊断肝癌，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高早期肝癌的检出率。此外，癌症相关基因的异常甲基化通常发生在癌症的早期且比较稳定。因此，通过检测上述生物标志物的甲基化水平来诊断或辅助诊断肝癌稳定性好，准确性高，易于早期诊断。另外，以上述基因作为生物标志物制备的用于诊断或辅助诊断肝癌的产品对医师技术水平的依赖性较低，且无创伤性，应用前景好。

具体地，在NCBI数据库中，IL12RB2基因的Gene ID：3595，HENMT1基因的Gene ID：113802，STRIP1基因的Gene ID：85369，FAM228B基因的Gene ID：375190，EGR4基因的GeneID：1961，NRP2基因的Gene ID：8828，MST1R基因的Gene ID：4486，FEZF2基因的Gene ID：55079，TTC33基因的Gene ID：23548，OXCT1基因的Gene ID：5019，HIST1H4F基因的Gene ID：8361，HIST1H3F基因的Gene ID：8968，HIST1H4H基因的Gene ID：8365，IL20RA基因的GeneID：53832，C6orf99基因的Gene ID：100130967，PRR15基因的Gene ID：222171，DLX6-AS1基因的Gene ID：285987，GCC1基因的Gene ID：79571，VIPR2基因的Gene ID：7434，BNIP3L基因的Gene ID：665，ESRP1基因的Gene ID：54845，NXNL2基因的Gene ID：158046，PRKG1基因的Gene ID：5592，HMX2基因的Gene ID：3167，STX2基因的Gene ID：2054，FZD2基因的Gene ID：2535，MYCBPAP基因的Gene ID：84073，TCAM1P基因的Gene ID：146771，LIPE-AS1基因的GeneID：100996307，ZNF551基因的Gene ID：90233。

在一些实施例中，检测生物标志物的甲基化水平的目标区域为基因的CpG岛。可以理解的是，在其他实施例中，检测生物标志物的甲基化水平的目标区域不限于CpG岛，还可以是基因的其他区域。

在一些实施例中，以GRCh38.p13为参考，IL12RB2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr1：67307636～67307672；HENMT1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr1：108661384～108661438；STRIP1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr1：110068977～110069062；FAM228B基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr2：24077340～24077424；EGR4基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr2：73291568～73291619；NRP2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr2：205681880～205681982；MST1R基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr3：49903852～49903884；FEZF2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr3：62374029～62374082；TTC33基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr5：40680840～40680920；OXCT1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr5：41870353～41870412；HIST1H4F基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr6：26240802～26240890；HIST1H3F基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr6：26250330～26250415；HIST1H4H基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr6：26284599～26284639；IL20RA基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr6：137044175～137044243；C6orf99基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr6：158870023～158870111；PRR15基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr7：29566410～29566466；DLX6-AS1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr7：97005387～97005440；GCC1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为127585769～127585849；VIPR2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr7：159144032～159144065；BNIP3L基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr8：26448522～26448562；ESRP1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr8：94641809～94641865；NXNL2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr9：88535336～88535376；PRKG1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr10：50991252～50991292；HMX2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr10：123149988～123150054；STX2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr12：130819077～130819115；FZD2基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr17：44558127～44558198；MYCBPAP基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr17：50508557～50508652；TCAM1P基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr17：63848873～63848967，LIPE-AS1基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr19：42397141～42397213；ZNF551基因作为生物标志物时，检测甲基化水平的目标区域为Chr19：57708712～57708795。需要说明的是，如无特别说明，本文中的基因的位置的均以GRCh38.p13为参考。可以理解的是，在检测目标区域的甲基化水平时，可以针对上述任一目标区域的全区域进行检测，还可以针对上述任一目标区域的部分区域进行检测。

在一些实施例中，上述生物标志物来源于ctDNA。ctDNA是一类来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞并释放入血的血浆游离DNA(cfDNA)，其包含多种肿瘤特异性的信息：如肿瘤基因的突变及拷贝数变化，肿瘤DNA的甲基化改变的信息等。在一些实施例中，上述生物标志物来自cfDNA。

基于上述，本申请一实施方式还提供了一种用于检测上述生物标志物的甲基化水平的试剂在制备用于诊断肝癌的产品中的应用。

基于上述，本申请一实施方式还提供了一种诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包括用于检测上述生物标志物的甲基化水平的试剂。

在一些实施例中，上述试剂盒包括核酸产品。该核酸产品用于检测上述生物标志物的甲基化水平。

可选地，上述核酸产品包括以下检测引物对中的至少一组：用于检测IL12RB2基因甲基化水平的IL12RB2引物对、用于检测HENMT1基因甲基化水平的HENMT1引物对、用于检测STRIP1基因甲基化水平的STRIP1引物对、用于检测FAM228B基因甲基化水平的FAM228B引物对、用于检测EGR4基因甲基化水平的EGR4引物对、用于检测NRP2基因甲基化水平的NRP2引物对、用于检测MST1R基因甲基化水平的MST1R引物对、用于检测FEZF2基因甲基化水平的FEZF2引物对、用于检测TTC33基因甲基化水平的TTC33引物对、用于检测OXCT1基因甲基化水平的OXCT1引物对、用于检测HIST1H4F基因甲基化水平的HIST1H4F引物对、用于检测HIST1H3F基因甲基化水平的HIST1H3F引物对、用于检测HIST1H4H基因甲基化水平的HIST1H4H引物对、用于检测IL20RA基因甲基化水平的IL20RA引物对、用于检测C6orf99基因甲基化水平的C6orf99引物对、用于检测PRR15基因甲基化水平的PRR15引物对、用于检测DLX6-AS1基因甲基化水平的DLX6-AS1引物对、用于检测GCC1基因甲基化水平的GCC1引物对、用于检测VIPR2基因甲基化水平的VIPR2引物对、用于检测BNIP3L基因甲基化水平的BNIP3L引物对、用于检测ESRP1基因甲基化水平的ESRP1引物对、用于检测NXNL2基因甲基化水平的NXNL2引物对、用于检测PRKG1基因甲基化水平的PRKG1引物对、用于检测HMX2基因甲基化水平的HMX2引物对、用于检测STX2基因甲基化水平的STX2引物对、用于检测FZD2基因甲基化水平的FZD2引物对、用于检测MYCBPAP基因甲基化水平的MYCBPAP引物对、用于检测TCAM1P基因甲基化水平的TCAM1P引物对、用于检测LIPE-AS1基因甲基化水平的LIPE-AS1引物对和用于检测ZNF551基因甲基化水平的ZNF551引物对。

在一些实施例中，以GRCh38.p13为参考，IL12RB2引物对用于检测Chr1：67307636～67307672区域内的甲基化水平；HENMT1引物对用于检测Chr1：108661384～108661438区域内的甲基化水平；STRIP1引物对用于检测Chr1：110068977～110069062区域内的甲基化水平；FAM228B引物对用于检测Chr2：24077340～24077424区域内的甲基化水平；EGR4引物对用于检测Chr2：73291568～73291619区域内的甲基化水平；NRP2引物对用于检测Chr2：205681880～205681982区域内的甲基化水平；MST1R引物对用于检测Chr3：49903852～49903884区域内的甲基化水平；FEZF2引物对用于检测Chr3：62374029～62374082区域内的甲基化水平；TTC33引物对用于检测Chr5：40680840～40680920区域内的甲基化水平；OXCT1引物对用于检测Chr5：41870353～41870412区域内的甲基化水平；HIST1H4F引物对用于检测Chr6：26240802～26240890区域内的甲基化水平；HIST1H3F引物对用于检测Chr6：26250330～26250415区域内的甲基化水平；HIST1H4H引物对用于检测Chr6：26284599～26284639区域内的甲基化水平；IL20RA引物对用于检测Chr6：137044175～137044243区域内的甲基化水平；C6orf99引物对用于检测Chr6：158870023～158870111区域内的甲基化水平；PRR15引物对用于检测Chr7：29566410～29566466区域内的甲基化水平；DLX6-AS1引物对用于检测Chr7：97005387～97005440区域内的甲基化水平；GCC1引物对用于检测Chr7：127585769～127585849区域内的甲基化水平；VIPR2引物对用于检测Chr7：159144032～159144065区域内的甲基化水平；BNIP3L引物对用于检测Chr8：26448522～26448562区域内的甲基化水平；ESRP1引物对用于检测Chr8：94641809～94641865区域内的甲基化水平；NXNL2引物对用于检测Chr9：88535336～88535376区域内的甲基化水平；PRKG1引物对用于检测Chr10：50991252～50991292区域内的甲基化水平；HMX2引物对用于检测Chr10：123149988～123150054区域内的甲基化水平；STX2引物对用于检测Chr12：130819077～130819115区域内的甲基化水平；FZD2引物对用于检测Chr17：44558127～44558198区域内的甲基化水平；MYCBPAP引物对用于检测Chr17：50508557～50508652区域内的甲基化水平；TCAM1P引物对用于检测Chr17：63848873～63848967区域内的甲基化水平；LIPE-AS1引物对用于检测Chr19：42397141～42397213区域内的甲基化水平；ZNF551引物对用于检测Chr19：57708712～57708795区域内的甲基化水平。

在一些实施例中，上述试剂盒通过亚硫酸氢盐测序法检测基因的甲基化水平。可选地，通过设计扩增甲基化和非甲基化的模板的引物对对模板进行扩增，并对扩增产物进行测序，从而确定甲基化水平。可以理解的是，可以采用简并引物的方式扩增甲基化和非甲基化的模板，以减少引物的成本。

可选地，IL12RB2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，用于扩增Chr1：67307636～67307672区域内的核酸片段。FAM228B引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示，用于扩增Chr2：24077340～24077424区域内的核酸片段。EGR4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示，用于扩增Chr2：73291568～73291619区域内的核酸片段。NRP2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示，用于扩增Chr2：205681880～205681982区域内的核酸片段。FEZF2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示，用于扩增Chr3：62374029～62374082区域内的核酸片段。TTC33引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示，用于扩增Chr5：40680840～40680920区域内的核酸片段。HIST1H4F引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：13～14所示，用于扩增Chr6：26240802～26240890区域内的核酸片段。HIST1H4H引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示，用于扩增Chr6：26284599～26284639区域内的核酸片段。C6orf99引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示，用于扩增Chr6：158870023～158870111区域内的核酸片段。PRR15引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～20所示，用于扩增Chr7：29566410～29566466区域内的核酸片段。GCC1引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：21～22所示，用于扩增Chr7：127585769～127585849区域内的核酸片段。VIPR2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：23～24所示，用于扩增Chr7：159144032～159144065区域内的核酸片段。BNIP3L引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：25～26所示，用于扩增Chr8：26448522～26448562区域内的核酸片段。ESRP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：27～28所示，用于扩增Chr8：94641809～94641865区域内的核酸片段。NXNL2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：29～30所示，用于扩增Chr9：88535336～88535376区域内的核酸片段。HMX2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：31～32所示，用于扩增Chr10：123149988～123150054区域内的核酸片段。STX2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：33～34所示，用于扩增Chr12：130819077～130819115区域内的核酸片段。TCAM1P引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：35～36所示，用于扩增Chr17：63848873～63848967区域内的核酸片段。LIPE-AS1引物对的核苷酸序列如SEQID NO：37～38所示，用于扩增Chr19：42397141～42397213区域内的核酸片段。ZNF551引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：39～40所示，用于扩增Chr19：57708712～57708795区域内的核酸片段。此时，IL12RB2引物对、FAM228B引物对、EGR4引物对、NRP2引物对、FEZF2引物对、TTC33引物对、HIST1H4F引物对、HIST1H4H引物对、C6orf99引物对、PRR15引物对、GCC1引物对、VIPR2引物对、BNIP3L引物对、ESRP1引物对、NXNL2引物对、HMX2引物对、STX2引物对、TCAM1P引物对、LIPE-AS1引物对和ZNF551引物对均为简并引物，可以用于扩增甲基化和非甲基化的目标区域。

HENMT1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO：41～44所示的引物对，其中，SEQ IDNO：41～42用于扩增甲基化的Chr1：108661384～108661438区域内的核酸片段，SEQ ID NO：43～44用于扩增非甲基化的Chr1：108661384～108661438区域内的核酸片段。

STRIP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：45～48所示，其中，SEQ ID NO：45～46用于扩增甲基化的Chr1：110068977～110069062区域内的核酸片段，SEQ ID NO：47～48用于扩增非甲基化的Chr1：110068977～110069062区域内的核酸片段。

MST1R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：49～52所示，其中，SEQ ID NO：49～50用于扩增甲基化的Chr3：49903852～49903884区域内的核酸片段，SEQ ID NO：51～52用于扩增非甲基化的Chr3：49903852～49903884区域内的核酸片段。

OXCT1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：53～56所示，其中，SEQ ID NO：53～54用于扩增甲基化的Chr5：41870353～41870412区域内的核酸片段，SEQ ID NO：55～56用于扩增非甲基化的Chr5：41870353～41870412区域内的核酸片段。

HIST1H3F引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：57～60所示，其中，SEQ ID NO：57～58用于扩增甲基化的Chr6：26250330～26250415区域内的核酸片段，SEQ ID NO：59～60用于扩增非甲基化的Chr6：26250330～26250415区域内的核酸片段。

IL20RA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：61～64所示，其中，SEQ ID NO：61～62用于扩增甲基化的Chr6：137044175～137044243区域内的核酸片段，SEQ ID NO：63～64用于扩增非甲基化的Chr6：137044175～137044243区域内的核酸片段。

DLX6-AS1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：65～68所示，其中，SEQ ID NO：65～66用于扩增甲基化的Chr7：97005387～97005440区域内的核酸片段，SEQ ID NO：67～68用于扩增非甲基化的Chr7：97005387～97005440区域内的核酸片段。

PRKG1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：69～72所示，其中，SEQ ID NO：69～70用于扩增甲基化的Chr10：50991252～50991292区域内的核酸片段，SEQ ID NO：71～72用于扩增非甲基化的Chr10：50991252～50991292区域内的核酸片段。

FZD2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：73～76所示，其中，SEQ ID NO：73～74用于扩增甲基化的Chr17：44558127～44558198区域内的核酸片段，SEQ ID NO：75～76用于扩增非甲基化的Chr17：44558127～44558198区域内的核酸片段。

MYCBPAP引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：77～80所示，其中，SEQ ID NO：77～78用于扩增甲基化的Chr17：50508557～50508652区域内的核酸片段，SEQ ID NO：79～80用于扩增非甲基化的Chr17：50508557～50508652区域内的核酸片段。可以理解的是，上述各引物对的核苷酸序列不限于上述，还可以与根据需要扩增的目标区域进行设计。

在一些实施例中，上述诊断肝癌的试剂盒利用荧光定量法检测生物标志物的甲基化水平。具体地，上述核酸产品还包括检测引物对和与检测引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团。可选地，检测探针为Taqman探针。具体地，检测探针上连接有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。可选地，荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然，在同一个反应体系中有两种以上的探针时，不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。

在一些实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸；甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；质控品用于质控；PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系；核酸测序试剂用于测序。

在其中一个实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐转化试剂或酶法转化试剂。

在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂和DNA聚合酶。

在其中一个实施例中，质控品包括阳性参考品和阴性参考品。

可以理解的是，在其他实施例中，上述诊断肝癌的试剂盒检测各目标基因甲基化水平的方法不限于上述的荧光定量法和亚硫酸氢盐测序法，还可以是其他方法。例如甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法或甲基化敏感性限制性内切酶法等。对应地，上述诊断肝癌的试剂盒包括相应的试剂。

在一些实施例中，上述诊断肝癌的试剂盒适用的样本包括但不限于血液样本、组织样本和粪便样本。

经验证，上述诊断肝癌的试剂盒对血浆样本的检测灵敏度达到88.6％，特异性为89.4％，利于肝癌的早期诊断。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

本实施例描述了筛选用于肝癌筛查的差异甲基化区域(Differentiallymethylated regions，DMRs)的过程：从武汉大学中南医院收集了12对肝癌冷冻组织样本及癌旁冷冻组织样本，所有受试者的样本收集过程得到了武汉大学中南医院伦理委员会的批准。从12对肝癌冷冻组织切片以及癌旁冷冻组织切片中提取基因组DNA并进行全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)，通过对数据进行分析计算，鉴定出与肝癌的发生发展相关的DMRs。具体实验过程如下：

1、DNA模板的提取(从组织样本中提取基因组DNA)

使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(Tiangen,#DP304-03)分别提取12对肝癌冷冻组织和癌旁冷冻组织样本的基因组DNA，具体操作见试剂盒说明书。提取的DNA用NanoDrop 2000微量分光光度计检测DNA的纯度，用Qubit 2.0荧光光度计检测DNA样品的浓度。将提取的合格的200ng的基因组DNA与1ng未甲基化的λDNA(Promega,#D1521)混合，使用Covaris S220仪器将上述混合DNA打断，再使用AMPure XP(Agencourt,#A63882)核酸纯化磁珠对DNA进行片段选择，使DNA片段大小为100-300bp左右，具体操作见说明书。加入λDNA的作用是为了在转化时确定胞嘧啶C转化为尿嘧啶U的效率。

2、全基因组甲基化文库的构建

对上述步骤1提取的DNA片段进行起始建库，C-T转化根据EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit DNA(Zymo Research,D5006)试剂盒的说明书进行。首先将上述DNA进行末端修复，加入碱基A后，再加上测序接头，连接产物经纯化后用重亚硫酸氢盐进行处理，把未发生甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，而发生甲基化的胞嘧啶C则不发生改变。经过回收筛选后，对符合要求的片段进行PCR扩增建库。

待文库构建完成后，先使用Qubit 2.0荧光定量仪进行初步定量，随后使用Aglient 2100 Bioanalyzer对文库的插入片段大小进行检测，质量合格的文库用于上机测序。使用Illumina公司的Hiseq测序平台进行测序，两端各测150bp，基因组DNA的测序深度为30×。

3、质量控制、数据处理和分析

测序完成后得到的原始序列可能包含测序接头或低质量序列，需要剔除接头被污染的Reads和质量较低的Reads。对于过滤后所得到的Clean Reads数据，采用Bismark平台，将所得的测序序列与参考基因组进行比对。根据比对结果，采用Bismark软件的“methylation extractor”功能计算CpG位点的甲基化水平。对于每个发生甲基化的胞嘧啶C，其甲基化水平的计算公式如下：单个胞嘧啶C的甲基化水平＝甲基化的Reads数量/(甲基化的Reads数量+非甲基化的Reads数量)×100，DMRs内胞嘧啶C的甲基化率＝该DMRs区域中甲基化胞嘧啶C的数量/该DMRs区域中所有胞嘧啶C的数量×100。通过比较各个CpG位点在肝癌患者组织和癌旁组织中甲基化率的异同，采用层次贝叶斯模型辨析出可能与肝癌发生发展有关的差异甲基化区域，其中696个为高甲基化DMRs。根据以下筛选标准：1)在癌旁组织中，样本的DMRs中甲基化比例≤10％；2)在一个DMR中差异CpG二核苷酸的个数≥5，最终得到30个尚未公开的可能用于肝癌诊断或辅助诊断的高甲基化DMRs，具体见表1。

表1 用于肝癌筛查的30个DMRs标志物

DMRs	染色体	位置(起始)	位置(结束)	DMRs长度(bp)	差异CpG个数	基因名
							(1)	Chr1	67307636	67307672	37	6	IL12RB2
(2)	Chr1	108661384	108661438	55	5	HENMT1
							(3)	Chr1	110068977	110069062	86	5	STRIP1
(4)	Chr2	24077340	24077424	85	9	FAM228B
							(5)	Chr2	73291568	73291619	52	8	EGR4
(6)	Chr2	205681880	205681982	103	6	NRP2
							(7)	Chr3	49903852	49903884	33	5	MST1R
(8)	Chr3	62374029	62374082	54	7	FEZF2
							(9)	Chr5	40680840	40680920	81	8	TTC33
(10)	Chr5	41870353	41870412	60	6	OXCT1
							(11)	Chr6	26240802	26240890	89	6	HIST1H4F
(12)	Chr6	26250330	26250415	86	8	HIST1H3F
							(13)	Chr6	26284599	26284639	41	8	HIST1H4H
(14)	Chr6	137044175	137044243	69	9	IL20RA
							(15)	Chr6	158870023	158870111	89	11	C6orf99
(16)	Chr7	29566410	29566466	57	5	PRR15
							(17)	Chr7	97005387	97005440	54	6	DLX6-AS1
(18)	Chr7	127585769	127585849	81	11	GCC1
							(19)	Chr7	159144032	159144065	34	8	VIPR2
(20)	Chr8	26448522	26448562	41	8	BNIP3L
							(21)	Chr8	94641809	94641865	57	5	ESRP1
(22)	Chr9	88535336	88535376	41	8	NXNL2
							(23)	Chr10	50991252	50991292	41	5	PRKG1
(24)	Chr10	123149988	123150054	67	6	HMX2
							(25)	Chr12	130819077	130819115	39	6	STX2
(26)	Chr17	44558127	44558198	72	6	FZD2
							(27)	Chr17	50508557	50508652	96	6	MYCBPAP
(28)	Chr17	63848873	63848967	95	21	TCAM1P
							(29)	Chr19	42397141	42397213	73	5	LIPE-AS1
(30)	Chr19	57708712	57708795	84	6	ZNF551

实施例2

本实施例在血浆中验证实施例1的30个DMRs可用于肝癌的筛查：从武汉大学中南医院收集的70例肝癌患者、34例HBV感染的非癌患者、23例肝硬化患者以及85例健康人的血液样本，每位受试者收集10～20mL血液样本。所有受试者的样本收集过程得到了武汉大学中南医院伦理委员会的批准。从受试者的血液样本中提取血浆游离DNA(cfDNA)，经亚硫酸氢盐转化后采用聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增相应的含DMRs的区域，再用桑格尔测序的方法分析PCR扩增产物中受试者每个DMRs的甲基化状态，进而判断受试者是否为肝癌患者。具体实验过程如下：

1、DNA模板的提取(血浆cfDNA的提取)

使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(Tiangen,#DP709)提取上述受试者的血浆cfDNA，具体操作见试剂盒说明书。

2、亚硫酸氢盐的转化

将提取好的模板DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。

3、PCR扩增及测序

对于DMR(1)，DMR(4)，DMR(5)，DMR(6)，DMR(8)，DMR(9)，DMR(11)，DMR(13)，DMR(15)，DMR(16)，DMR(18)，DMR(19)，DMR(20)，DMR(21)，DMR(22)，DMR(24)，DMR(25)，DMR(28)，DMR(29)和DMR(30)，使用简并引物扩增模板(简并引物序列见表2)，配置PCR反应体系(见表3)，PCR扩增程序见表4，在PCR扩增结束后，使用简并引物对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。

表2 扩增DMRs的简并引物

表3 添加简并引物的PCR反应体系

组分	用量(μL)
		10×Taq buffer(Mg<sup>2+</sup> Free)	5
25mM Mg<sup>2+</sup>	4
		dNTP Mix(10mM each)	1
上游引物(10μM)	1
		下游引物(10μM)	1
热启动Taq DNA聚合酶	0.5
		模板DNA	10
超纯水	补至50

表4 PCR扩增程序

对于DMR(2)，DMR(3)，DMR(7)，DMR(10)，DMR(12)，DMR(14)，DMR(17)，DMR(23)，DMR(26)，DMR(27)，难以设计简并引物以cfDNA为模板扩增目的片段，因此分别设计甲基化引物对和非甲基化引物对扩增相应的DMR(引物序列见表5)，配置PCR反应体系(见表6)，PCR扩增程序同表4，在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。

表5 扩增DMRs的甲基化引物对和非甲基化引物对序列

表6 添加甲基化引物和非甲基化引物的PCR反应体系

组分	用量(μL)
		10×Taq buffer(Mg<sup>2+</sup> Free)	5
25mM Mg<sup>2+</sup>	4
		dNTP Mix(10mM each)	1
甲基化上游引物(10μM)	1
		甲基化下游引物(10μM)	1
非甲基化上游引物(10μM)	0.5
		非甲基化下游引物(10μM)	0.5
热启动Taq DNA聚合酶	0.5
		模板DNA	10
超纯水	补至50

4、分析结果

根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的差异CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。

如果一个扩增子中95％以上的差异CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该DMRs中是甲基化阳性的。若受试者的样本在所述的任意一个DMRs中是甲基化阳性的，则认为该样本为肝癌阳性样本。计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目，并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性为病例结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。利用单个DMR检测受试者是否为肝癌患者的效果见表7。

表7 单个DMR在血浆样本中的灵敏度和特异性

从表7可以看出，单个DMR检测肝癌患者血浆样本的效果各不相同，总体来说，其灵敏度和特异性良好。其中，单个DMR检测肝癌患者血浆样本的灵敏度最高为85.7％，最低为57.1％。单个DMR检测HBV感染者血浆样本的特异性最高可达到97.1％，最低为85.3％。单个DMR检测肝硬化患者血浆样本的特异性最高可达到95.7％，最低为82.6％。单个DMR在健康人血浆样本中的特异性最高为98.8％，最低为90.6％。

结合以上30个标志物检测肝癌患者血浆样本的效果，定义若受试者的样本在所述的30个DMRs中至少有一个DMR是甲基化阳性的，则该样本为肝癌阳性样本。重新计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目，并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。在这种情况下，上述30个DMRs检测肝癌的性能见表8。

表8 30个DMRs在血浆样本中的灵敏度和特异性

由表8可以看出，根据表1中列出的30个DMRs的甲基化状态判断肝癌患者的灵敏度达到了88.6％，其在健康人中的特异性达到了89.4％，可以显著的区分肝癌患者和健康人，同时其检测HBV感染者和肝硬化等患者的特异性分别为82.4％和78.3％。上述结果说明以所述的30个DMRs为标志物，通过分析受试者血浆中cfDNA的甲基化状态，可以有效地区分肝癌患者、健康人和肝脏其它病变患者。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒

<160> 80

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggtggagaga gaattatttt gtt 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcttctcaat tcaactctaa aaac 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggaggggttt ttaggttga 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggggaaataa actaaaaaaa taac 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggtgttgtgt cgtttttttt tat 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ccacaaaccc ttccaatacc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gggaaaggat ttgagtagta a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gggcaaaaaa aattaaataa c 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggagaaagtt tttattgatt aagg 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aacccaaaac taaccataaa act 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aagtggttat aatttagaaa gtagg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aaaataataa aaaaaaaaca aaact 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

aggttttttt tagggttatt ttttt 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tccctttctc cttaacacat cc 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gggggaaata atatttgtaa gttt 24

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cgcaaaccca aatccaaa 18

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gggttggttt ttagtgaggt ata 23

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tcctataaaa caaaaaataa ccact 25

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ggagtagaaa gaaaagtaag gaag 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gggaaaacta ctaatccaat cc 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

aaaaaatagg tttgggaaag g 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

ggggggtaat aaaaatacaa tac 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gggatcgatt tagatttgtt t 21

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

ggcttacttt cctcttaaaa act 23

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

tgtgtttggg gtgtgttttg 20

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

aggccttaaa aattaaaata acaaa 25

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

ggggtttatt tttagggttt ttt 23

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

tcctcgctcc cctactaaaa c 21

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

ggggtaggtt ttgagaggtt tag 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

ggcctacaaa aaaataatca cct 23

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

gcgtagattt tggtgagtat gt 22

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

gggggtataa aaaaataaaa cc 22

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

tgtttatttt tttgttttgg gatt 24

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

aaacccgaaa caaaactaaa cac 23

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

tcgttaggga gtagttagta gaggt 25

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

ggggggctat aactattatt ttc 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gggggttgtt aggtttagtt agt 23

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

ggggctaaaa aaaacttacc c 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

gggggtgtag aaaatagttt tt 22

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

ggacccaaaa tcgaaaaca 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

tttttgcgtt tgtcgcgtc 19

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

cgactcgcga tctacgaacg 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

gggtttttgt gtttgttgtg tt 22

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

aggcaactca caatctacaa aca 23

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

gggttcgagt tgtcggtgtc 20

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

acaaaaaccg cgcaatacg 19

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

ggggtttgag ttgttggtgt t 21

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

gggacaaaaa ccacacaata ca 22

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

ttgacgtttg cggacgtac 19

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

aaccaaacct tcctcgcg 18

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

gggttgatgt ttgtggatgt at 22

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

ggaaccaaac cttcctcaca 20

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

gggaggttgt tttagattcg c 21

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

atttccttcg caatcgcg 18

<210> 55

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

ttgtattagg ttgttttaga tttgt 25

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

caaatttcct tcacaatcac a 21

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

tggggagttt tattaggtaa gtttc 25

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

cgccgctatc aaaaatcg 18

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

gggggagttt tattaggtaa gtttt 25

<210> 60

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

taaaatccac cactatcaaa aatca 25

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

tgagtttggt ttttaaagcg c 21

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

accaatccca aattcccg 18

<210> 63

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

tgggagtttg gtttttaaag tgt 23

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

aaccaatccc aaattccca 19

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

aagtatcggc ggtcggtc 18

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

acgacttcta ctaacgtata cgcg 24

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

ggaagtattg gtggttggtt 20

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

gggggctact aacatataca ca 22

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

gtattagggg cgtatttcgt c 21

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

gacgactaaa acgacaaccg 20

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

gttgtattag gggtgtattt tgtt 24

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

aacaacaact aaaacaacaa cca 23

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 73

ttagtggttc gagcgtttgc 20

<210> 74

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 74

taataccccc gacacccg 18

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 75

ggtttttagt ggtttgagtg tttgt 25

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 76

caaaataccc ccaacaccca 20

<210> 77

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 77

attgatcggt ggatgcgc 18

<210> 78

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 78

ggcttcataa taccgcccg 19

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

gggttgattg gtggatgtgt 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 80

gggcttcata ataccaccca 20

Claims

1.一种肝癌的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括以下基因中的至少一种：IL12RB2、HENMT1、STRIP1、FAM228B、EGR4、NRP2、MST1R、FEZF2、TTC33、OXCT1、HIST1H4F、HIST1H3F、HIST1H4H、IL20RA、C6orf99、PRR15、DLX6-AS1、GCC1、VIPR2、BNIP3L、ESRP1、NXNL2、PRKG1、HMX2、STX2、FZD2、MYCBPAP、TCAM1P、LIPE-AS1和ZNF551，通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断肝癌。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，以GRCh38.p13为参考，通过检测以下区域中的至少一个区域的甲基化水平来诊断肝癌：Chr1：67307636～67307672、Chr2：24077340～24077424、Chr2：73291568～73291619、Chr2：205681880～205681982、Chr3：62374029～62374082、Chr5：40680840～40680920、Chr6：26240802～26240890、Chr6：26284599～26284639、Chr6：158870023～158870111、Chr7：29566410～29566466、Chr7：127585769～127585849、Chr7：159144032～159144065、Chr8：26448522～26448562、Chr8：94641809～94641865、Chr9：88535336～88535376、Chr10：123149988～123150054、Chr12：130819077～130819115、Chr17：63848873～63848967、Chr19：42397141～42397213、Chr19：57708712～57708795、Chr1：108661384～108661438、Chr1：110068977～110069062、Chr3：49903852～49903884、Chr5：41870353～41870412、Chr6：26250330～26250415、Chr6：137044175～137044243、Chr7：97005387～97005440、Chr10：50991252～50991292、Chr17：44558127～44558198和Chr17：50508557～50508652。

3.用于检测权利要求1所述的肝癌的生物标志物的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。

4.一种核酸产品，用于诊断肝癌，其特征在于，所述核酸产品包括以下检测引物对中的至少一组：

5.根据权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，以GRCh38.p13为参考，所述IL12RB2引物对用于扩增Chr1：67307636～67307672区域内的核酸片段，所述FAM228B引物对用于扩增Chr2：24077340～24077424区域内的核酸片段，所述EGR4引物对用于扩增Chr2：73291568～73291619区域内的核酸片段，所述NRP2引物对用于扩增Chr2：205681880～205681982区域内的核酸片段，所述FEZF2引物对用于扩增Chr3：62374029～62374082区域内的核酸片段，所述TTC33引物对用于扩增Chr5：40680840～40680920区域内的核酸片段，所述HIST1H4F引物对用于扩增Chr6：26240802～26240890区域内的核酸片段，所述HIST1H4H引物对用于扩增Chr6：26284599～26284639区域内的核酸片段，所述C6orf99引物对用于扩增Chr6：158870023～158870111区域内的核酸片段，所述PRR15引物对用于扩增Chr7：29566410～29566466区域内的核酸片段，所述GCC1引物对用于扩增Chr7：127585769～127585849区域内的核酸片段，所述VIPR2引物对用于扩增Chr7：159144032～159144065区域内的核酸片段，所述BNIP3L引物对用于扩增Chr8：26448522～26448562区域内的核酸片段，所述ESRP1引物对用于扩增Chr8：94641809～94641865区域内的核酸片段，所述NXNL2引物对用于扩增Chr9：88535336～88535376区域内的核酸片段，所述HMX2引物对用于扩增Chr10：123149988～123150054区域内的核酸片段，所述STX2引物对用于扩增Chr12：130819077～130819115区域内的核酸片段，所述TCAM1P引物对用于扩增Chr17：63848873～63848967区域内的核酸片段，所述LIPE-AS1引物对用于扩增Chr19：42397141～42397213区域内的核酸片段，所述ZNF551引物对用于扩增Chr19：57708712～57708795区域内的核酸片段，所述HENMT1引物对用于扩增Chr1：108661384～108661438区域内的核酸片段，所述STRIP1引物对用于扩增Chr1：110068977～110069062区域内的核酸片段，所述MST1R引物对用于扩增Chr3：49903852～49903884区域内的核酸片段，所述OXCT1引物对用于扩增Chr5：41870353～41870412区域内的核酸片段，所述HIST1H3F引物对用于扩增Chr6：26250330～26250415区域内的核酸片段，所述IL20RA引物对用于扩增Chr6：137044175～137044243区域内的核酸片段，所述DLX6-AS1引物对用于扩增Chr7：97005387～97005440区域内的核酸片段，所述PRKG1引物对用于扩增Chr10：50991252～50991292区域内的核酸片段，所述FZD2引物对用于扩增Chr17：44558127～44558198区域内的核酸片段，所述MYCBPAP引物对用于扩增Chr17：50508557～50508652区域内的核酸片段。

6.根据权利要求5所述的核酸产品，其特征在于，所述IL12RB2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；和/或，所述FAM228B引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；和/或，所述EGR4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；和/或，所述NRP2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；和/或，所述FEZF2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示；和/或，所述TTC33引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示；和/或，所述HIST1H4F引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示；和/或，所述HIST1H4H引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示；和/或，所述C6orf99引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：17～18所示；和/或，所述PRR15引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～20所示；和/或，所述GCC1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：21～22所示；和/或，所述VIPR2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：23～24所示；和/或，所述BNIP3L引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：25～26所示；和/或，所述ESRP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：27～28所示；和/或，所述NXNL2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：29～30所示；和/或，所述HMX2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：31～32所示；和/或，所述STX2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：33～34所示；和/或，所述TCAM1P引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：35～36所示；和/或，所述LIPE-AS1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～38所示；和/或，所述ZNF551引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：39～40所示；所述HENMT1引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO：41～44所示的引物对；和/或，所述STRIP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：45～48所示；和/或，所述MST1R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：49～52所示；和/或，所述OXCT1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：53～56所示；和/或，所述HIST1H3F引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：57～60所示；和/或，所述IL20RA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：61～64所示；和/或，所述DLX6-AS1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：65～68所示；和/或，所述PRKG1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：69～72所示；所述FZD2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：73～76所示；和/或，所述MYCBPAP引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：77～80所示。

7.根据权利要求4～6任一项所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针，所述检测探针上连接有荧光基团。

8.一种诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用下述方法中的至少一种检测权利要求1或2所述的生物标志物的甲基化水平而诊断肝癌：甲基化特异性PCR法、甲基化特异性荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4～7任一项所述的用于诊断肝癌的核酸产品。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。