CN117004712A - 用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用 - Google Patents

用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用。本发明研究发现，ZEB2(Zinc Finger E‑Box Binding Homeobox 2，锌指E盒结合同源盒蛋白2)基因CpG岛的甲基化与胃癌的发生密切相关，且该基因DNA分子的异常甲基化频繁地发生在癌症早期。通过ZEB2基因CpG岛的甲基化与胃癌的发生的相关性，选择特定的区域检测甲基化水平，能够对胃癌进行较准确的诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高早期胃癌的检出率。

Description

用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用。
背景技术
胃癌是世界范围内常见的消化道原发性恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中排名居于前位。幽门螺杆菌感染、吸烟、饮酒、肥胖、盐摄入、萎缩性胃炎以及胃癌家族史等是罹患胃癌的风险因素，且患者呈现年轻化的趋势。
胃癌早期临床症状不明显，患者易被误诊为胃炎或胃溃疡等慢性疾病，从而错过胃癌的最佳治疗期。而实际上，早期的胃癌是高度可治疗的，早期胃癌患者5年的生存率可达95％。因此，早期筛查和诊断对于胃癌的预防、治疗和复发预估具有十分重要的意义。
胃镜检测是胃癌诊断的金标准，但是其患者依从性差，且有一定的感染风险。近年来，基于液体活检技术的甲基化诊断方式在癌症包括胃癌的诊断中得到了越来越多的重视。已有产品通过检测血浆中RNF180/Septin9基因的甲基化水平来辅助诊断胃癌，虽然特异性较好，但灵敏度仍有提升的空间。因此，急需具备高灵敏度和高特异性的非侵入式的诊断方式用于早期胃癌的诊断。
发明内容
本发明研究人员发现，ZEB2(Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 2，锌指E盒结合同源盒蛋白2，Gene ID(NCBI)：9839)基因CpG岛的甲基化水平与胃癌的发生密切相关，且该基因DNA分子的异常甲基化频繁地发生在癌症早期。基于此，本申请提供一种用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用。
一种用于检测ZEB2基因CpG岛甲基化水平的试剂在制备胃癌诊断产品中的应用。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，所述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144523947-144524461、Chr2:144516541-144517556、Chr2:144524461-144523947和Chr2:144517556-144516541。
在其中一个实施例中，所述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398、Chr2:144516929-144516758、Chr2:144523947-144524125、Chr2:144524342-144524461、Chr2:144516670-144516878、Chr2:144516900-144517075、Chr2:144517100-144517247、Chr2:144517437-144517556、Chr2:144524274-144524163、Chr2:144517392-144517221、Chr2:144517147-144516940和Chr2:144516718-144516541。
一种用于诊断胃癌的核酸产品，所述核酸产品用于检测ZEB2基因CpG岛的甲基化水平。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，所述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144523947-144524461、Chr2:144516541-144517556、Chr2:144524461-144523947和Chr2:144517556-144516541。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398、Chr2:144516929-144516758、Chr2:144523947-144524125、Chr2:144524342-144524461、Chr2:144516670-144516878、Chr2:144516900-144517075、Chr2:144517100-144517247、Chr2:144517437-144517556、Chr2:144524274-144524163、Chr2:144517392-144517221、Chr2:144517147-144516940和Chr2:144516718-144516541。
在其中一个实施例中，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组、核苷酸序列如SEQID NO:21～22所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:52～53所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:54～57所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:58～61所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:62～63所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:64～65所示的引物组和核苷酸序列如SEQ IDNO:66～69所示的引物组中的至少一组。
在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针，其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:33所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示，与核苷酸序列如SEQ IDNO:13～14所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:41所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示。
一种胃癌的诊断试剂盒，包括以上任一实施例所述的核酸产品。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
一种检测ZEB2基因CpG岛甲基化水平的方法，包括如下步骤：
获取待测样本的DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；及
采用上述任一实施例所述的核酸产品或上述任一实施例所述的试剂盒对经过亚硫酸氢盐转化的所述DNA进行PCR，检测甲基化水平。
在其中一个实施例中，所述待测样本包括细胞样本、组织样本和血液样本的至少一种。
上述用于诊断胃癌的核酸产品，通过检测ZEB2基因上特定区域的甲基化水平，能够对胃癌进行较准确的诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高早期胃癌的检出率。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所述的“CpG岛”是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。
所述的“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
所述的“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化，或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
所述的“TaqMan探针”是指包含5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
所述的“Chr2:144523947-144524461”是指在2号染色体上起始位点为144523947，终止位点为144524461的一段正链区域。所述的“Chr2:144524461-144523947”是指在2号染色体上起始位点为144524461，终止位点为144523947的一段负链区域。本文中的其他区域编码原理与此相同，且本文中的编码均是以GRCh38.p13为参考基因组。
本申请一实施方式提供了一种用于检测ZEB2基因CpG岛甲基化水平的试剂在制备胃癌诊断产品中的应用。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，上述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144523947-144524461、Chr2:144516541-144517556、Chr2:144524461-144523947和Chr2:144517556-144516541。
进一步地，上述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398、Chr2:144516929-144516758、Chr2:144523947-144524125、Chr2:144524342-144524461、Chr2:144516670-144516878、Chr2:144516900-144517075、Chr2:144517100-144517247、Chr2:144517437-144517556、Chr2:144524274-144524163、Chr2:144517392-144517221、Chr2:144517147-144516940和Chr2:144516718-144516541。
优选地，上述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398和Chr2:144516929-144516758。
通过检测上述区域的甲基化水平，能够较准确地实现对胃癌的诊断。
本申请一实施方式还提供了一种用于诊断胃癌的核酸产品，该核酸产品用于检测ZEB2基因CpG岛的甲基化水平。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，该核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144523947-144524461、Chr2:144516541-144517556、Chr2:144524461-144523947和Chr2:144517556-144516541。
进一步地，该核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398、Chr2:144516929-144516758、Chr2:144523947-144524125、Chr2:144524342-144524461、Chr2:144516670-144516878、Chr2:144516900-144517075、Chr2:144517100-144517247、Chr2:144517437-144517556、Chr2:144524274-144524163、Chr2:144517392-144517221、Chr2:144517147-144516940和Chr2:144516718-144516541。
更进一步地，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组、核苷酸序列如SEQ IDNO:25～26所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:52～53所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:54～57所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:58～61所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:62～63所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:64～65所示的引物组和核苷酸序列如SEQ ID NO:66～69所示的引物组中的至少一组。
优选地，该核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398和Chr2:144516929-144516758。
更优选地，上述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:52～53所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:54～57所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:58～61所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:62～63所示的引物组、核苷酸序列如SEQ IDNO:64～65所示的引物组和核苷酸序列如SEQ ID NO:66～69所示的引物组中的至少一组。
更进一步地，上述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针，其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:34所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示，与核苷酸序列如SEQ IDNO:15～16所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:42所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示。
在一些实施例中，上述核酸产品还包括内参引物对。在一些实施例中，内参引物对包括用于扩增真核细胞管家基因的引物对。在一个可选的具体示例中，该内参引物对包括用于扩增ACTB(β-actin)基因片段或GAPDH基因片段的引物对。
在一个可选的具体示例中，该内参引物对为扩增ACTB(β-actin)基因片段的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:49～50所示。
进一步地，上述核酸产品还包括与内参引物对对应的检测探针。在一个可选的具体示例中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:49～50所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示。
在其中一个实施例中，上述检测探针为TaqMan荧光探针。检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。可以理解的是，对目标区域甲基化的检测与对内参基因的检测可以在同一个反应孔中进行也可以在不同反应孔中进行，根据实际情况来合理选择检测探针的荧光基团。在一个可选的具体示例中，对目标区域甲基化的检测与对内参基因的检测在同一个反应孔中进行，其中，目标区域甲基化的检测探针的荧光报告基团为FAM，其荧光淬灭基团为MGB；内参基因的检测探针的荧光报告基团为VIC，其荧光淬灭基团为BHQ-1。
在一些实施例中，该核酸产品还包括PCR内部控制品。该PCR内部控制品包括内部控制核酸片段、内部控制引物对及探针。
具体地，PCR内部控制品是指监控是否存在PCR抑制物及反应系统(包括试剂、PCR程序、荧光采集)是否正常的DNA序列。在PCR体系中加入内部控制品能够辨别假阴性和假阳性。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述核酸产品可以没有PCR内部控制品。
本申请一实施方式还提供了一种胃癌的诊断试剂盒，该试剂盒通过检测ZEB2基因CpG岛甲基化水平诊断或辅助诊断胃癌。该试剂盒包括以上任一实施例所述的核酸产品。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
具体地，甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在一个可选的具体示例中，甲基化转化试剂包括亚硫酸氢盐。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
本申请一实施方式还提供了一种检测ZEB2基因CpG岛甲基化水平的方法，包括步骤a1、步骤a2和步骤a3。具体地：
步骤a1：获取待测样本的DNA。
步骤a2：对DNA进行亚硫酸氢盐转化。
具体地，可采用亚硫酸氢盐对DNA进行亚硫酸氢盐转化。
步骤a3：采用上述任一实施例所述的核酸产品或上述任一实施例所述的试剂盒对经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行PCR，检测甲基化水平。
具体地，可以采用以下方法中的任一种检测甲基化：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在其中一个实施例中，所述待测样本包括细胞样本、组织样本和血液样本中的至少一种。
具体地，细胞样本包括体外培养的细胞和体内组织分离的细胞中的至少一种；组织样本包括活检组织和粪便中的至少一种；血液样本包括血浆、全血和分离的血细胞中的至少一种。
上述用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用，通过ZEB2基因CpG岛的甲基化与胃癌的发生的相关性，选择特定的区域检测甲基化水平，能够对胃癌进行较准确的诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高早期胃癌的检出率。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.收集样本
于武汉某医院收集30例胃癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本，30例胃癌样本的患者中有19例处于TNM分期的第Ⅲ期或第Ⅳ期，所有样本均为福尔马林浸泡及石蜡包埋的组织样本。此外，还收集了30例健康人的血液样本，每人收集静脉血10mL。所有样本的收集过程均经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.提取样本DNA
对于组织样本，使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(56404)提取DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
对于血液样本，使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行白细胞基因组DNA提取，具体操作见试剂盒说明书。
3.亚硫酸氢盐转化
将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.甲基化特异性定量PCR
以亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板，分别使用表1中的引物和探针，按照表2的配方配置反应体系，采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶对ZEB2基因的16个区域进行甲基化特异性定量PCR检测，PCR反应条件如表3所示。其中，区域1～区域16的核苷酸序列分别如表11中SEQ ID NO:70～SEQ ID NO:85所示，表1中的各核酸组合可检测的甲基化位点如表12所示。
每个PCR可检测ZEB2基因的一个区域在某一样本中的甲基化水平，即一个反应管中除了加入必须的反应成分和模板以外，需加入一个目标基因区域对应的检测引物对及探针，同时还需加入内参基因ACTB的检测引物及探针。检测目标区域的探针为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ-1。
在对目的基因的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照应进行同步检测。阴性对照为超纯水。阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的ZEB2基因区域1～16对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。ZEB2基因区域1～16的阳性对照分别为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1～16的人工合成质粒1:1混合而成，例如：区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1:1混合而成。
表1
表2
组分 浓度 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mmol/L 3
ZEB2区域上游引物 10μmol/L 0.5
ZEB2区域下游引物 10μmol/L 0.5
ZEB2区域探针 10μmol/L 0.5
ACTB上游引物 10μmol/L 0.5
ACTB下游引物 10μmol/L 0.5
ACTB探针 10μmol/L 0.5
Taq酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
表3
5.PCR结果分析
PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本的最小Ct值前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本的各个基因的Ct值。
当阴性对照无扩增，阳性对照有明显的指数增长期，阳性对照中的目标基因和内参基因的Ct值均在26～30之间，且待检样本的内参基因的Ct值≤35时，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
对于组织样本，当某一检测区域在样本上的Ct值≤38时，即认为在该样本在此区域被检出甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。对于血浆样本，当某一检测区域在样本上的Ct值≤45时，即认为在该样本在此区域被检出甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>45，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。
ZEB2基因区域1～16在30例健康人白细胞样本中经PCR检测均为甲基化阴性，即特异性达到100％。ZEB2基因区域1～16在组织样本中的PCR检测结果、灵敏度和特异性如表4所示。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表4
由表4可以看出，ZEB2基因区域1～16检测胃癌组织样本和癌旁组织样本的效果各不相同。ZEB2基因区域1～16在胃癌组织样本中的灵敏度高于63.3％，其在癌旁组织样本中的特异性高于73.3％。此外，ZEB2基因区域2(Chr2:144524156-144524311)、区域4(Chr2:144516541-144516656)、区域8(Chr2:144517304-144517426)、区域10(Chr2:144524461-144524279)、区域12(Chr2:144517553-144517398)和区域15(Chr2:144516929-144516758)的检测灵敏度和特异性显著高于其它区域，这六个区域在胃癌组织样本中的灵敏度高于83％，在癌旁组织中特异性大于或等于80％。
实施例2
本实施例的步骤1～3与实施例1相同，本实施例还包括：
4.PCR扩增
设计ZEB2基因区域2、区域4、区域8、区域10、区域12和区域15的甲基化和非甲基化引物对或简并引物对(如表5所示)，以亚硫酸氢盐转化后的组织基因组DNA为模板，分别进行PCR反应扩增ZEB2基因区域2、区域4、区域8、区域10、区域12和区域15，添加简并引物对的PCR反应液的配置体系如表6所示，添加甲基化引物对和非甲基化引物对的PCR反应液的配置体系如表7所示，PCR扩增程序如表8所示。其中，区域2、区域4、区域8、区域10、区域12和区域15的核苷酸序列如表11中所示。
表5
表6
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mmol/L Mg2+ 4
dNTP Mix(10mmol/L each) 1
上游引物(10μmol/L) 1
下游引物(10μmol/L) 1
热启动Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表7
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mmol/L each) 1
甲基化上游引物(10μmol/L) 1
甲基化下游引物(10μmol/L) 1
非甲基化上游引物(10μmol/L) 0.5
非甲基化下游引物(10μmol/L) 0.5
热启动Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表8
5.Sanger测序
在PCR扩增结束后，使用引物(表5中的甲基化引物对和非甲基化引物对或简并引物对)对扩增产物进行Sanger测序，同时从5’端和3’端测序。
6.测序结果分析
根据测序峰图对每个样本的扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。如果扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域中是甲基化阳性的。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性，结果见表9。
表9
表9的数据表明，通过亚硫酸氢盐测序的方法检测ZEB2基因区域2、区域4、区域8、区域10、区域12和区域15的甲基化状态，同样可以有效区分胃癌组织样本和癌旁组织样本，检测灵敏度在80％以上，检测特异性在76％以上。
实施例3
1.收集样本
于武汉某医院收集经组织活检确诊为胃癌患者的血浆样本及健康人血浆样本，每人收集5mL，共收集到胃癌患者血浆样本64例，健康人血浆样本53例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.提取样本DNA
使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐转化
此步骤与实施例1步骤3相同。
4.甲基化特异性定量PCR
此步骤与实施例1步骤4相同。
5.PCR结果分析
PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本的最小Ct值前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本的各个基因的Ct值。
当阴性对照无扩增，阳性对照有明显的指数增长期，阳性对照中的目标基因和内参基因的Ct值均在26～30之间，且待检样本的内参基因的Ct值≤35时，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
当某一检测区域在样本上的Ct值≤45时，即认为在该样本在此区域被检出甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>45，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。
ZEB2基因区域1～16在64例胃癌患者和53例健康人血浆cfDNA中的PCR检测结果、灵敏度和特异性如表10所示。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表10
由表10可以看出，ZEB2基因区域1～16对胃癌血浆样本的检测灵敏性均高于57％，对健康人血浆样本的检测特异性均高于77％。此外，ZEB2基因区域2(Chr2:144524156-144524311)、区域4(Chr2:144516541-144516656)、区域8(Chr2:144517304-144517426)、区域10(Chr2:144524461-144524279)、区域12(Chr2:144517553-144517398)和区域15(Chr2:144516929-144516758)的检测灵敏度和特异性显著高于其它区域，这六个区域在胃癌血浆样本中的灵敏性大于76％，在健康人血浆样本中特异性大于86％。
表11
表12
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 用于诊断胃癌的核酸产品、试剂盒及应用
<160> 85
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgttgcga gattcgtagg tt 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggggaaaat actcatttaa atcct 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtttttaat ttttcgcgcg t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaaccg aacaccgcc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgttcggga ttttgcgat 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgctcgaa acgcga 16
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggggattatg tagaaattgt cg 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaatcgataa taactcgaaa acg 23
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcggggtcgg tcgattt 17
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatcgcgcaa aatcccg 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttttaggcg gacgttttcg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggataaacg tcaaacaccc g 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttcggttta gtcgtcgcg 19
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<211> 20
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gaaccactac gcgactcgaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggttgcgtt ttttgtatcg 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggggttacta aatcgaacct acg 23
<210> 17
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<212> DNA
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cgataatgtg ggtatcgttc g 21
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<400> 18
accgccgaaa tttcgct 17
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttcgttcgga gcgcggt 17
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgcgtcgcga aaaaaaacg 19
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<211> 20
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taattttccg cgcgctct 18
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
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gcgtcgagtt tatgcgaatt g 21
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<400> 26
ccctaaatct cgaaccgcg 19
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<211> 16
<212> DNA
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cgaaccgaac gcgaacg 17
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<400> 30
aaacgaccga acgactccg 19
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ggtttatcgc gtttagattt cg 22
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<212> DNA
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aggggaccat ataaaaacta ccg 23
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<212> DNA
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<400> 33
agtagggcgg ttagttgagg ggttg 25
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
taggcggagg agcgcgtcg 19
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggcgtcgttc ggttagttga tttgg 25
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aagtttcgtt gcgttttgcg att 23
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggtttcgttg ttcgcggatc gtta 24
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gggtcgggcg cgagcg 16
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cggcgtcggt cgcggag 17
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atggtagttc gtatggattc ggcgt 25
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcgggtcgtt taggggagtc g 21
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atcgggcggc gggcg 15
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtagggatcg aagttggcgg cg 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgcgggcgat gtttatattg tcg 23
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggatggtttt cggtgtaaga ggcgt 25
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gttcggtcgg ggtttcgcg 19
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gggtttaggc gttggatcgc g 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggttcggtgg ggtcgatgat gg 22
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggagtggttt ttgggtttg 19
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aggtgatgtt aaataggttt ggttg 25
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggggggaaaa cgatctaata aa 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggatttgcgt gtgtttttcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aaaatcgacc gaccccg 17
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggggatttgt gtgtgttttt tg 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tggaaaatca accaacccca 20
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tgtgggtttc gagtcgcg 18
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gggcaataaa cgcgaacg 18
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gggttgggtt ttgagttgtg 20
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acacacattt caataaacac aaaca 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ggggggttta tggtaattag ttt 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggatccctac atttaatctc caa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tcggggttaa ggttgggg 18
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ggggacgaat caaataacaa ttc 23
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tttttcgttt cgttcgcg 18
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
aaccgttact taacgcaccg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
accgtttttt gttttgtttg tg 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cacaaaccat tacttaacac acca 24
<210> 70
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tgctgcgaga cccgcaggct gtggaatctc gcacgtcacc tggccccagc agggcggcca 60
gctgaggggt tgattttatt ttattttttt gaagtaaagg ctgaatctcg gcttcagggc 120
ttttgccaac gtctccactg acaggaacca gcaaacttca ggacccaaat gagcatctt 179
<210> 71
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tgtccccaat tttccgcgcg ctctgccact ccccccccca cacaccccgc cccaaccccc 60
gccgccagct tcggtccctg catttgatct ccaggaaggg ccccgctgca caggcggagg 120
agcgcgtcgc gggggggggc ggtgttcggc cccctc 156
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ccgcccggga tcctgcgacc cccgcccgcc gcccggtcag ctgacctggc tcgctcgcct 60
gctccccgcc cgccgccctg tttccggtcc ccggggtccg cgagccgcgc tccgagcggg 120
<210> 73
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gaccatgtag aaactgccgg gaaaagtctc gctgcgccct gcgactcctt cagtccccgg 60
cctgggggca gagcctgctg gagaggagtc atccgtcccc gagccatcat cgaccc 116
<210> 74
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcggggccgg ccgactccct cccaccccgg ggtctgggcg cgatgggccg ggccccgctg 60
cccgcggacc gttacttggc gcaccgagaa gcggccgggc gactccggca agaaacttta 120
agcctcgctg aggcgcagac ccggttcccc tctcctgcct tcgcagtctc tctgccaccc 180
ccgcccccgc cccgggatcc tgcgcgatc 209
<210> 75
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gccccaggcg gacgctcccg aagcccggcc ggagacccgg cgggccgggc gcgagcggag 60
cgggaggcgg aggcggaggg agggcggagg caggggctcg aggggggcag cggggctggg 120
ggcgcggggc cccggccgga cccccgcgct cggacccccg ggtgcctgac gctcac 176
<210> 76
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ccccggtcca gccgccgcgc gcgccgggct ccggcgccgg ccgcggaggg aggctcgccc 60
tagagccctg ggcgccgccg ccgccgccgc ctcggttcct tttccctttc cccctccttc 120
tccctgggtc tcgagccgcg tagtggcc 148
<210> 77
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ttgcgcctct tgcaccgggg gccatccgcc atgatcggct gcttcattga taagagcgga 60
tcagatggca gttcgcatgg actcggcgcc ctgcttcggc agcacgcagg ctcgatctag 120
caa 123
<210> 78
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cgacaatgtg ggcatcgccc gcgcccattg aaacgcgcgc gggccgccca ggggagccgg 60
gccagggccc cggcgagcac ccatccgcgc cccccaacgc caaagcgaaa cttcggcggc 120
<210> 79
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cccgctcgga gcgcggctcg cggaccccgg ggaccggaaa cagggcggcg ggcggggagc 60
aggcgagcga gccaggtcag ctgaccgggc ggcgggcggg ggtcgcagga tcccgggcgg 120
ggacaggtct gggggagggc ggtctggtgg gagggggccg aacaccgccc ccccccgcga 180
cgc 183
<210> 80
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ctccgcctgt gcagcggggc ccttcctgga gatcaaatgc agggaccgaa gctggcggcg 60
ggggttgggg cggggtgtgt ggggggggga gtggcagagc gcgcggaaaa tt 112
<210> 81
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gccgaagttt cgctttggcg ttggggggcg cggatgggtg ctcgccgggg ccctggcccg 60
gctcccctgg gcggcccgcg cgcgtttcaa tgggcgcggg cgatgcccac attgtcgctg 120
tgtttggttg ctagatcgag cctgcgtgct gccgaa 156
<210> 82
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gcgccgagtc catgcgaact gccatctgat ccgctcttat caatgaagca gccgatcatg 60
gcggatggcc cccggtgcaa gaggcgcaaa caagccaatc ccaggaggaa aaacggtaag 120
aagcagcccg aaccaaactt ttccgggcca ctacgcggct cgagacccag gg 172
<210> 83
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ctccgcggcc ggcgccggag cccggcgcgc gcggcggctg gaccgggggg tgttggggaa 60
gtgccgggca aagtgagcgt caggcacccg ggggtccgag cgcgggggtc cggccggggc 120
cccgcgcccc cagccccgct gcccccctcg agcccctgcc tccgccctcc ctccgcctcc 180
gcctcccgct ccgctcgcgc ccggcccg 208
<210> 84
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ggccgggctt cgggagcgtc cgcctggggc agggcggggg cccaggcgct ggatcgcgca 60
ggatcccggg gcgggggcgg gggtggcaga gagactgcga aggcaggaga ggggaaccgg 120
gtctgcgcct cagcgaggct taaagtttct tgccggagtc gcccggccgc tt 172
<210> 85
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ggcccatcgc gcccagaccc cggggtggga gggagtcggc cggccccgcg cggggtccgg 60
tggggtcgat gatggctcgg ggacggatga ctcctctcca gcaggctctg cccccaggcc 120
ggggactgaa ggagtcgcag ggcgcagcga gacttttccc ggcagtttct acatggtc 178

Claims (10)

1.一种用于检测ZEB2基因CpG岛甲基化水平的试剂在制备胃癌诊断产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以GRCh38.p13为参考基因组，所述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144523947-144524461、Chr2:144516541-144517556、Chr2:144524461-144523947和Chr2:144517556-144516541。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398、Chr2:144516929-144516758、Chr2:144523947-144524125、Chr2:144524342-144524461、Chr2:144516670-144516878、Chr2:144516900-144517075、Chr2:144517100-144517247、Chr2:144517437-144517556、Chr2:144524274-144524163、Chr2:144517392-144517221、Chr2:144517147-144516940和Chr2:144516718-144516541。
4.一种用于诊断胃癌的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品用于检测ZEB2基因CpG岛的甲基化水平。
5.根据权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，以GRCh38.p13为参考基因组，所述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144523947-144524461、Chr2:144516541-144517556、Chr2:144524461-144523947和Chr2:144517556-144516541。
6.根据权利要求5所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：Chr2:144524156-144524311、Chr2:144516541-144516656、Chr2:144517304-144517426、Chr2:144524461-144524279、Chr2:144517553-144517398、Chr2:144516929-144516758、Chr2:144523947-144524125、Chr2:144524342-144524461、Chr2:144516670-144516878、Chr2:144516900-144517075、Chr2:144517100-144517247、Chr2:144517437-144517556、Chr2:144524274-144524163、Chr2:144517392-144517221、Chr2:144517147-144516940和Chr2:144516718-144516541。
7.根据权利要求6所述的核酸产品，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1～2所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组、核苷酸序列如SEQ IDNO:5～6所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组、核苷酸序列如SEQ IDNO:9～10所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的引物组、核苷酸序列如SEQID NO:13～14所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:52～53所示的引物组、核苷酸序列如SEQ IDNO:54～57所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:58～61所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:62～63所示的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:64～65所示的引物组和核苷酸序列如SEQ ID NO:66～69所示的引物组中的至少一组。
8.根据权利要求7所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针，其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示，与核苷酸序列如SEQ IDNO:25～26所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:47所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物组对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示。
9.一种胃癌的诊断试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4～8任一项所述的核酸产品。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
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