CN113430272A - 一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用，涉及基因检测技术领域。以人RAPGEFL1基因的CpG岛的甲基化作为标志物，通过检测其甲基化水平的增加可以对食管癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高食管癌的检出率，从而满足食管癌/癌前病变早筛早诊的临床需求。

Description

一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用。
背景技术
食管癌是发生在食管黏膜上皮及食管腺上皮的恶性肿瘤，是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。据全球癌症统计数据显示，2018年食管癌的发病率居恶性肿瘤第八位，死亡率居第七位。
食管癌的早期诊断能明显提高治疗效果并改善患者的预后，目前内镜和细胞活检等技术相结合有效提高了高危人群中食管癌的检出率，但这些技术存在患者接受度低、操作不够灵活等问题。
近期分子生物学方面的进展为开发简便、有效的早期诊断方法提供了新的方向，食管癌组织中存在多基因、多位点的甲基化，并且在食管癌发生的早期即出现DNA甲基化的改变，因此，甲基化改变可以作为食管癌早期诊断的标志物，从DNA甲基化角度探索食管癌诊断策略已成为一种新的思路。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂在制备食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断产品中的应用，试剂为用于检测食管癌相关基因上的靶区域的甲基化的试剂，食管癌相关基因为RAPGEFL1基因，靶区域选自RAPGEFL1基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2和区域3；
其中，区域1选自Chr17:40191282-40191349正链，区域2选自 Chr17:40191371-40191476正链，区域3选自 Chr17:40191544-40191653正链。
以GRch38.p13基因组为参照，RAPGEFL1基因位于人的17号染色体上的40177010-40195655位置。RAPGEFL1基因编码Rap型鸟苷酸交换因子1(rap guanine nucleotideexchange factor like 1)。
发明人发现，RAPGEFL1基因的三个区域在食管癌/癌前病变中的甲基化水平显著高于正常样本，基于此，可以通过检测这三个区域的甲基化水平实现食管癌诊断或辅助诊断，若这三个区域的中的至少一个区域的甲基化水平高于正常样本的甲基化水平，则可诊断或辅助诊断该样本患有食管癌/癌前病变。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述靶区域选自RAPGEFL1 基因的区域3中的全长区域或部分区域：区域3选自 Chr17:40191544-40191653正链。
发明人发现区域3对于样本的检测灵敏度和特异性要优于区域1 和区域2对于样本的检测灵敏度和特异性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂用于检测RAPGEFL1 基因上的区域1正链上的Chr7:40191282、Chr7:40191291、 Chr7:40191299、Chr7:40191305、Chr7:40191324、Chr7:40191333、 Chr7:40191342和Chr7:40191349至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
试剂用于检测RAPGEFL1基因上的区域2正链上的 Chr7:40191391、Chr7:40191399、Chr7:40191407、Chr7:40191456和 Chr7:40191458至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
试剂用于检测RAPGEFL1基因上的区域3正链上的 Chr7:40191545、Chr7:40191548、Chr7:40191552、Chr7:40191564、 Chr7:40191615、Chr7:40191618、Chr7:40191639、Chr7:40191642和 Chr7:40191652至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述食管癌诊断或辅助诊断产品选自如下产品中的至少一种：试剂盒、芯片和测序文库。
需要说明的是，上述食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断产品可以是任意一种的体外诊断产品形式，并不限于上述的试剂盒、芯片和测序文库的产品类型，只要能满足食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的需求均在本发明的保护范围内。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂选自如下核酸组合中的至少一种：用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域2的核酸组合2和用于检测区域3的核酸组合3；
核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合2的碱基序列如SEQ IDNO.4-6所示，核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示。
本发明还提供了一种检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合，其选自如下核酸组合中的至少一种：核酸组合1、核酸组合2和核酸组合3。
核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合2的碱基序列如SEQ IDNO.4-6所示，核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示。
需要说明的是，若一种核酸组合与上述核酸组合(核酸组合1-3) 所示的碱基序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该核酸组合同样具有一定的食管癌或癌前病变的诊断功能(特异性或灵敏度与本申请核酸组合1-3相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述CpG岛选自RAPGEFL1 基因的如下区域中的全长区域或部分区域：
区域1、区域2和区域3。本发明中CpG岛与上述的靶区域等同。
其中，区域1选自Chr17:40191282-40191349正链，区域2选自 Chr17:40191371-40191476正链，区域3选自 Chr17:40191544-40191653正链。
核酸组合1用于检测区域1，核酸组合2用于检测区域2，核酸组合3用于检测区域3。
癌变过程中，DNA甲基化水平的异常多发生在CpG岛内，CpG 岛主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的区域，长度在200-3000bp之间，G+C的含量超过50％。
本发明还提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，其包括检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合。
上述检测试剂可以是冻干粉，也可以是溶液形态，例如将核酸组合溶解于超纯水或缓冲液中。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测试剂为检测 RAPGEFL1基因的CpG岛的甲基化状态的试剂，甲基化状态的检测手段包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap endonuclease法。
在一种实施方式中，上述食管癌为食管鳞癌。
本发明还提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合或食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本。
在一种实施方式中，上述检测试剂盒还包括PCR缓冲液。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的食管癌诊断或辅助诊断试剂、检测试剂盒及核酸组合物是以人RAPGEFL1基因的CpG岛的甲基化作为标志物，通过检测其甲基化水平的增加可以对食管癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高食管癌的检出率，从而满足食管癌/癌前病变早筛早诊的临床需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为目的区域1-3区分食管高级别瘤变样本和正常样本的ROC 曲线；
图2为目的区域1-3区分食管癌样本和正常样本的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合1。核酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸。该核苷酸组合1可检测RAPGEFL1基因上 Chr17:40191282-40191349区域正链(目的区域1)的甲基化。
区域1正链碱基序列如下(5’-3’)：
CGCCCTGGCCGCCCCTCCGCTGCCGTGGGTGCAGCTGGAGTTCGTGGACTACGTGTTCCACGGGGAGC。
完全甲基化的区域1经亚硫酸氢盐转化后的序列如下(5’-3’)：
CGTTTTGGTCGTTTTTTCGTTGTCGTGGGTGTAGTTGGAGTTCGTGGATTACGTGTTTTACGGGGAGC。
区域1甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’)：
CGTTTTGGTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO.1)；
区域1甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’)：
GCTCCCCGTAAAACACGTAAT(SEQ ID NO.2)；
区域1甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’)：
TGTCGTGGGTGTAGTTGGAGTTCGT(SEQ ID NO.3)。
SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上 Chr7:40191282、Chr7:40191291、Chr7:40191299、Chr7:40191305、Chr7:40191324、Chr7:40191333、Chr7:40191342和Chr7:40191349 位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合2，核酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸。该核苷酸组合2可检测RAPGEFL1基因上 Chr17:40191371-40191476区域正链(目的区域2)的甲基化。
区域2正链碱基序列如下(5’-3’)：
ACTTGGAGCTGCTGCTGCAGCGCTGCAGCGAGGTCACGCA CTGGGTGGCCACCGAAGTGCTGCTCTGCGAGGCCCCGGGCAA GCGCGCGCAGCTGCTCAAGAAGTT。
完全甲基化的区域2经亚硫酸氢盐转化后的序列如下(5’-3’)：
ATTTGGAGTTGTTGTTGTAGCGTTGTAGCGAGGTTACGTAT TGGGTGGTTATCGAAGTGTTGTTTTGCGAGGTTTCGGGTAAGC GCGCGTAGTTGTTTAAGAAGTT。
区域2甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’)：
ATTTGGAGTTGTTGTTGTAGCG(SEQ ID NO.4)；
区域2甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’)：
AACTTCTTAAACAACTACGCGC(SEQ ID NO.5)；
区域2甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’)：
TGTAGCGAGGTTACGTATTGGGTG(SEQ ID NO.6)。
SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上 Chr7:40191391、Chr7:40191399、Chr7:40191407、Chr7:40191456和 Chr7:40191458位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合3，核酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸。该核苷酸组合3可检测RAPGEFL1基因上 Chr17:40191544-40191653区域正链(目的区域3)的甲基化。
区域3正链碱基序列如下(5’-3’)：
CCGCCGCCCGCCCCTGACCCCGCCTCCCACCCCCGCAGCT GCAAGCAGAACCAGGACCTGCTGTCTTTCTACGCCGTGGTCAT GGGGCTGGACAACGCCGCTGTCAGCCG。
完全甲基化的区域3经亚硫酸氢盐转化后的序列如下(5’-3’)
TCGTCGTTCGTTTTTGATTTCGTTTTTTATTTTCGTAGTTGTA AGTAGAATTAGGATTTGTTGTTTTTTTACGTCGTGGTTATGGGGT TGGATAACGTCGTTGTTAGTCG。
区域3甲基化特异性PCR的上游引物序列为(5’-3’)：
TCGTCGTTCGTTTTTGATTTCG(SEQ ID NO.7)；
区域3甲基化特异性PCR的下游引物序列为(5’-3’)：
CCTCCCAAATAAATCGAAAACG(SEQ ID NO.8)；
区域3甲基化特异性PCR的探针序列为(5’-3’)：
CGACTAACAACGACGTTATCCAA(SEQ ID NO.9)。
SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸可检测位于该区域正链上 Chr7:40191545、Chr7:40191548、Chr7:40191552、Chr7:40191564、 Chr7:40191615、Chr7:40191618、Chr7:40191639、Chr7:40191642和 Chr7:40191652位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供一种食管癌/癌前病变的诊断或辅助诊断方法，其包括：
采用甲基化特异性PCR方法检测样本区域1-3(请参照实施例 1-3所示的区域1-3)的甲基化，具体步骤包括：
(1)cfDNA提取：
用BCT采血管(Streck)收集血液样本，并于24小时内在4℃条件下1900g转速离心10分钟分离血浆。用QIAamp MinElute cfDNA Mini Kit提取血浆中的cfDNA，具体步骤参见厂家的说明书。
(2)亚硫酸氢盐转化：
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。在本过程中，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶不变，尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤(A)配对，胞嘧啶与鸟嘌呤(G)配对，以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。
(3)甲基化特异性PCR反应：
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测 RAPGEFL1基因区域1-3的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因的检测探针。以ACTB作为内参基因，PCR反应体系如表1 所示。ACTB作为内参基因，其中ACTB的上游引物为： AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.10)；ACTB的下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.11)；ACTB的探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.12)。
目标区域的探针在5’端标记的报告基团为FAM，3’端标记的猝灭基团为MGB，ACTB探针在5’端的报告基团为VIC，3’端的猝灭基团为BHQ1。
表1 PCR反应体系表。
组分 规格 体积(μL)
缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 2
区域上游引物 10μM 0.5
区域下游引物 10μM 0.5
区域探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB探针 10μM 0.5
DNA酶 5U/μL 0.3
待测样本DNA / 2
纯化水 / 补至25
如表1所示，在检测RAPGEFL1区域1-区域3任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将该区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中，缓冲液、dNTP和DNA。检测区域1-3的甲基化时，加入的待检样本DNA是将前述步骤(1)提取到的cfDNA经亚硫酸氢盐转化(步骤(2))而成。
PCR反应条件如下表2所示。
表2 PCR反应程序。
Figure BDA0003140014200000101
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小 Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到每个样本待检测目的基因的Ct值和内参基因 ACTB的Ct值。
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。
阴性对照为纯化水。
阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的区域1-3对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并克隆至人工合成质粒。区域1-3的阳性对照为103拷贝/ 微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1-3的人工合成质粒1：1混合而成，如区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1：1混合而成。
阴性对照要无扩增，阳性对照Ct值应在26-30之间，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
结果分析和判读方法：2-ΔΔCt法对胃癌/高级别瘤变样本和健康人样本进行ROC分析，记录约登指数最大时的灵敏度、特异性和AUC 值，其中ΔΔCt＝(Ct待检区域-CtACTB)样本-(Ct待检区域-CtACTB)阳性对照。
用SPSS 22.0软件做ROC分析，以验证每个待检区域对食管癌样本和正常样本的诊断效能、对食管癌前病变样本和正常样本的诊断效能。选取约登指数最大时的ΔCt作为cut-off值，记录此时的灵敏度、特异性和AUC值。
实施例5
本实施例提供本发明提供的区域1-3与对照区域的检测效果对比，对照组的上游引物序列为：GCGAGTTTAAGTTTCGTGC，对照组的下游引物序列为：GCAAAACTAAAAAAACGCG。
对照区域在染色体上的位置为：Chr17:40177371-40177537正链。
区域1-3的上下游引物如实施例1-3所示。
采用甲基化特异性PCR方法检测样本区域的甲基化，具体步骤包括：
(1)cfDNA提取：
用BCT采血管(Streck)收集血液样本，并于24小时内在4℃条件下1900g转速离心10分钟分离血浆。用QIAamp MinElute cfDNA Mini Kit提取血浆中的cfDNA，具体步骤参见厂家说明书。
(2)亚硫酸氢盐转化
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见厂家说明书。在本过程中，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶不变，尿嘧啶在后续的PCR步骤中与腺嘌呤(A)配对，胞嘧啶与鸟嘌呤(G)配对，以此实现甲基化与未甲基化序列的区分。
(3)PCR反应
用SYBR Green法对亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应，以检测RAPGEFL1基因区域1-3和对照区域在样本中的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物，同时加入内参基因的检测引物。以ACTB 作为内参基因，ACTB的上下游引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，用SYBRTMGreen PCR预混液(货号4309155)进行 PCR，PCR反应体系如表3所示。
表3 SYBRTMGreen PCR预混液进行PCR的反应体系。
Figure BDA0003140014200000121
Figure BDA0003140014200000131
PCR反应条件如下表4所示。
表4 SYBRTMGreen PCR预混液进行PCR的反应程序。
Figure BDA0003140014200000132
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小 Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到每个样本待检测目的基因的Ct值和内参基因 ACTB的Ct值。
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有ACTB基因和目标基因序列的人工合成质粒，浓度为103拷贝/微升，阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
结果分析和判读方法：当某一区域的Ct值≤38时，即认为该区域在该样本中被检出甲基化，计算目的区域1-3和对照区域在食管癌前病变样本、食管癌样本和正常样本中的甲基化检出率。
实施例6
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括实施例1中的核酸组合1。
实施例7
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括实施例2中的核酸组合2。
实施例8
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括实施例3中的核酸组合3。
实施例9
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括实施例1中的核酸组合1、实施例2中的核酸组合2和实施例3中的核酸组合3。
实施例10
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括核酸组合(与实施例1中的核酸组合相同)，该核酸组合用于检测区域1的Chr7:40191282、Chr7:40191291、 Chr7:40191299、Chr7:40191305、Chr7:40191324、Chr7:40191333、 Chr7:40191342和Chr7:40191349至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化水平。
实施例11
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括核酸组合(与实施例2中的核酸组合2相同)，该核酸组合用于检测区域2的Chr7:40191391、Chr7:40191399、 Chr7:40191407、Chr7:40191456和Chr7:40191458至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化水平。
实施例12
本实施例提供了一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，该试剂包括核酸组合(与实施例3中的核酸组合相同)，该核酸组合用于检测区域3的Chr7:40191545、Chr7:40191548、 Chr7:40191552、Chr7:40191564、Chr7:40191615、Chr7:40191618、 Chr7:40191639、Chr7:40191642和Chr7:40191652至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化水平。
实验例1
选择59例食管高级别瘤变和65例正常血液样本，样本来自于郑州大学第一附属医院，用实施例1-3的方法对目的区域1-3在每个样本中的甲基化情况进行检测，按照实施例4所述的方法分析目的区域 1-3对食管高级别瘤变样本和正常样本的诊断效能，输出灵敏度、特异性及AUC值，结果见下表5，目的区域1-3的ROC曲线见附图1。
表5不同区域条件下的样本的灵敏度、特异性及AUC值。
区域名称 灵敏度 特异性 AUC
目的区域1 67.8％ 95.4％ 0.824
目的区域2 64.4％ 93.8％ 0.801
目的区域3 76.3％ 95.4％ 0.872
结果显示，区域1-3对于食管高级别瘤变的检测灵敏度均在60％以上，特异性均大于90％，AUC值均在0.8以上，其中目的区域3 的AUC值最高，明显优于目的区域1和目的区域2，目的区域3对食管高级别瘤变样本的检测敏感性为76.3％，特异性为95.4％。
实验例2
选择59例食管癌和65例正常血液样本(正常样本与实验例1 中的样本相同)，用实施例1-3的方法对目的区域1-3在每个样本中的甲基化情况进行检测，按照实施例4所述的方法分析目的区域1-3 对食管癌样本和正常样本的诊断效能，输出灵敏度、特异性及AUC值，结果见下表6，目的区域1-3的ROC曲线见附图2。
表6不同区域条件下的样本的灵敏度、特异性及其AUC值。
区域名称 灵敏度 特异性 AUC
目的区域1 86.4％ 93.8％ 0.911
目的区域2 84.7％ 92.3％ 0.902
目的区域3 91.5％ 95.4％ 0.948
结果显示，区域1-3对于食管癌的检测灵敏度均在80％以上，特异性均大于90％，AUC值均在0.9以上，其中目的区域3的AUC值最高，明显优于目的区域1和目的区域2，目的区域3对食管高级别瘤变样本的检测敏感性为91.5％，特异性为95.4％。
对比例1
选择59例食管高级别瘤变(同实验例1)、59例食管癌(同实验例2)和65例正常血液样本(同实验例1和实验例2)，用实施例5 所述的方法检测目的区域1-3及对照区域在高级别瘤变样本、食管癌样本和正常样本中的甲基化检出率，结果如表7所示。
表7不同区域条件下的食管癌高级别瘤变样本、食管癌样本和正常样本的灵敏度、特异性及其 AUC值。
Figure BDA0003140014200000161
Figure BDA0003140014200000171
如表7所示，目的区域1-3在食管癌高级别瘤变样本和食管癌样本中的甲基化检出率显著高于对照区域，目的区域1-3在正常样本中的甲基化检出率低于对照区域，表明目的区域1-3的检测效果优于对照区域。另外，目的区域3的检测效果优于目的区域1和2，这与实验例1和实验例2的结果一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgttttggtc gttttttcg 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctccccgta aaacacgtaa t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtcgtgggt gtagttggag ttcgt 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atttggagtt gttgttgtag cg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aacttcttaa acaactacgc gc 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtagcgagg ttacgtattg ggtg 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcgtcgttcg tttttgattt cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cctcccaaat aaatcgaaaa cg 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgactaacaa cgacgttatc caa 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims (10)

1.一种试剂在制备食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂为用于检测食管癌相关基因上的靶区域的甲基化的试剂，所述食管癌相关基因为RAPGEFL1基因，所述靶区域选自RAPGEFL1基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域1、区域2和区域3；
其中，所述区域1选自Chr17:40191282-40191349正链，所述区域2选自Chr17:40191371-40191476正链，所述区域3选自Chr17:40191544-40191653正链。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶区域选自RAPGEFL1基因的区域3中的全长区域或部分区域：所述区域3选自Chr17:40191544-40191653正链。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂用于检测RAPGEFL1基因上的区域1正链上的Chr7:40191282、Chr7:40191291、Chr7:40191299、Chr7:40191305、Chr7:40191324、Chr7:40191333、Chr7:40191342和Chr7:40191349至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
所述试剂用于检测RAPGEFL1基因上的区域2正链上的Chr7:40191391、Chr7:40191399、Chr7:40191407、Chr7:40191456和Chr7:40191458至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
所述试剂用于检测RAPGEFL1基因上的区域3正链上的Chr7:40191545、Chr7:40191548、Chr7:40191552、Chr7:40191564、Chr7:40191615、Chr7:40191618、Chr7:40191639、Chr7:40191642和Chr7:40191652至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
优选地，所述食管癌诊断或辅助诊断产品选自如下产品中的至少一种：试剂盒、芯片和测序文库。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自如下核酸组合中的至少一种：用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2和用于检测所述区域3的核酸组合3；
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示，所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示。
5.一种检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合，其特征在于，所述检测RAPGEFL1基因CpG岛的核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：核酸组合1、核酸组合2和核酸组合3；
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示，所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示。
6.根据权利要求5所述的检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合1用于检测区域1的全长区域或部分区域，所述核酸组合2用于检测区域2的全长区域或部分区域，所述核酸组合3用于检测区域3的全长区域或部分区域；
其中，所述区域1选自Chr17:40191282-40191349正链，所述区域2选自Chr17:40191371-40191476正链，所述区域3选自Chr17:40191544-40191653正链。
7.一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，其包括权利要求5-6任一项所述的检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合。
8.根据权利要求7所述的食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为检测RAPGEFL1基因的CpG岛的甲基化状态的试剂，所述甲基化状态的检测手段包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flapendonuclease法；
优选地，所述食管癌为食管鳞癌。
9.一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求5-6任一项所述的检测RAPGEFL1基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合或权利要求7-8任一项所述的食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂。
10.根据权利要求9所述的食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血浆样本、血清样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115851959A (zh) * 2022-12-30 2023-03-28 武汉艾米森生命科技有限公司 一种用于食管鳞状细胞癌及癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534600A (zh) * 2020-06-18 2020-08-14 广州达健生物科技有限公司 食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534600A (zh) * 2020-06-18 2020-08-14 广州达健生物科技有限公司 食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAKAMASA TAKAHASHI等: "Estimation of the Fraction of Cancer Cells in a Tumor DNA Sample Using DNA Methylation", 《PLOS ONE》 *
UCSC: "《UCSC》", 13 March 2020 *
YAN CHEN等: "Screening aberrant methylation profile in esophageal squamous cell carcinoma for Kazakhs in Xinjiang area of China", 《MOL BIOL REP》 *
梁佳等: "miR-6867及其宿主基因RAPGEFL1在食管鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达及甲基化状态", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115851959A (zh) * 2022-12-30 2023-03-28 武汉艾米森生命科技有限公司 一种用于食管鳞状细胞癌及癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒
CN115851959B (zh) * 2022-12-30 2024-04-12 武汉艾米森生命科技有限公司 一种用于食管鳞状细胞癌及癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒

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