CN112195245A

CN112195245A - 血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用

Info

Publication number: CN112195245A
Application number: CN202011112826.9A
Authority: CN
Inventors: 顾月清; 刘云龙; 陈红红
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: Shandong Kanghua Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2021-01-08

Abstract

本发明公开了血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用。血浆中肺癌相关的甲基化基因组合，所述的组合包含SHOX2、CDO1。所述的组合还包含选自以下任意一种或多种基因：PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT。本发明所述的组合作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。一种肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于包含本发明所述的组合物。本发明试剂盒可将生物标记物的检测灵敏度提高到3‑10拷贝/微升，提供的6种肺癌相关基因SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT基因的甲基化情况是潜在的肺癌(尤其是早期肺癌)诊断、预后评估及疗效监测的有意义的临床指标。

Description

血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用

技术领域

本发明属于生物医药检测领域，涉及一种血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用。

背景技术

肺癌是目前中国乃至全世界发病率、死亡率均居榜首的恶性肿瘤，也是全世界范围内的主要死亡原因之一，严重威胁着人类的健康和生命质量。

肺癌大致可以分为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌，又可分为肺鳞癌，肺腺癌，大细胞肺癌，约占80％～85％，其余为小细胞肺癌。其均与DNA异常甲基化有或多或少的关系。

由于我国工业化不断发展导致空气污染日益加重，加之烟草流行率全球最高以及老龄化等因素的影响，肺癌的发病率和死亡率越来越高。如此巨大的死亡率主要原因在于大多数肺癌发现时已经是中晚期，由于癌症是影响某些通路特定癌症基因经过持续的一系列改变并积累而引发的，但巨大多数肺癌在前90％的生命周期内未被检测到。有数据表明，I-II期肺癌患者的5年总生存率为30-49％，而III期及以后则为1-14％，因此肺癌早期筛查具有重要意义。

目前最流行的肺癌早期筛查的方法是低剂量螺旋CT(low-dosecomputedtomography，LDCT)，其对发现早期肺癌的敏感度是常规X线胸片的4～10倍，可以早期检出早期周围型肺癌。但对肺结节良恶性判断上效果差强人意。另外还有一些辅助手段，血清学肿瘤标志物检测中CEA、NSE、CYFRA21-1、SCC等，但在早期肺癌中，这些方法的临床敏感性均较低。而DNA甲基化在肺癌发展早期事件之一，通过检测DNA异常甲基化可以很好地进行肺癌早期发生发展的监测。因此DNA甲基化肿瘤标志物有望成为肺癌早期及肺结节良恶性判断的有效手段，临床应用前景广泛。

DNA甲基化修饰的异常是导致肺癌发生的重要因素之一。通过对抑癌基因异常甲基化的研究而提高肺癌患者的早期诊断率并为其进一步治疗开辟新的方向是近年研究的热点之一。大量研究表明，肺癌的发生常与多种基因CpG岛的异常甲基化有关。近年来,研究比较热门的基因有p16、RASSF1A、SHOX2、PTGER4、 CDH1、CDH13、FHTI、TMS1/ASC等。

目前在早期检测和筛查肺癌方面存在的最大问题在于取得检测样本组织所需实施的侵入性活检方法对病人造成较大痛苦。液体活组织检查是免除痛苦最理想的方法，其中用于分析的生物样品可以从血液、尿液、唾液、痰液、肺泡灌洗液、胸水或组织样品获得。本试剂盒的适用样本主要为血液分离出的血浆cfDNA，既是最微创的液体活检样本，又能免于组织异质性带来的误差。

目前针对DNA甲基化检测的方法主要有以下几种方法：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、高分辨率溶解曲线法、荧光定量法、芯片法、高通量测序及飞行质谱法等，相较之下，实时荧光定量PCR法成本低，普及率高，快速且灵敏度、特异性都特别好，因此本试剂盒选择，此方法，临床应用价值更大。

目前针对DNA甲基化检测方法，在检测之前，要对提取的待检DNA进行亚硫酸盐处理，此方法是行业金标准，利用商业化试剂盒对基因组DNA转化效率可达到90％以上，但对血浆游离核酸的转化后得率仍较低。但在这种情况下，本试剂盒所设计的引物探针组仍然可以达到检测灵敏度。其他酶切法仅在科研中使用，方法不够稳定，因此不能应用于临床。

已有与本试剂盒相似的试剂盒获得国家相关机构的批准认证，仅两家公司(国内外各一家)，如 Epigenomics公司生产的Epi proLung试剂盒，其检测针对肺癌的SHOX2和PTGER4的甲基化状态；上海透景生命科技股份有限公司生产的Lung-Me^TM试剂盒，其也针对肺癌的SHOX2和RASSF1A的甲基化状态，而本试剂盒根据临床样本中血浆游离DNA的实验筛选出6种肺癌相关基因并进行多种基因甲基化组合检测并进行甲基化的相对定量。本团队通过大量文献进行更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期肺癌筛查的更好的甲基化基因靶点，并设计出数套可针对这些靶点进行甲基化检测的引物及探针组合，我们的方案可取得更高的检测特异性和敏感度，利用新发现的基因靶标检测组合制成了早期肺癌的检测和筛查试剂盒。

在荧光定量PCR中常用的探针为TaqMan探针、分子信标探针等。本试剂盒采用经优化修饰的TaqMan 探针。TaqMan探针用于实时荧光定量PCR中是目前最准确，最灵敏，并得到国际公认的核酸分子定量检测方法，经优化修饰的TaqMan探针如MGB-TaqMan是普通的TaqMan探针基础上发展起来的一项新技术，具有荧光本底低，分辨率更高，杂交特异性更强。重复性好，探针长度缩短等优点，特别适合于亚硫酸氢盐处理后含有高AT的序列的杂交与检测。因此，本试剂盒使用优化修饰的TaqMan探针使得实验方法更可靠、高效且稳定可重复。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供血浆中肺癌相关甲基化基因组合。

本发明的另一目的是提供一种肺癌辅助诊断试剂盒。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

血浆中肺癌相关的甲基化基因组合，包含SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT中的任意两种及以上，优选至少包含SHOX2、CDO1。

作为本发明的一种优选，所述的组合还包含选自以下任意一种或多种基因：PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT。

作为本发明的进一步优选，所述的组合优选自以下任意一种：

组合1：SHOX2和CDO1；

组合2：SHOX2、CDO1和HOXA7；

组合3：SHOX2、CDO1、HOXA7和SCT；

组合4：SHOX2、CDO1、PTGER4、HOXA7和SCT；

组合5：SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT。

上述基因在NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站中Genebank编号分别为：SHOX2:NC_000003.12(158095905..158106420)、CDO1:NC_000005.10(115804733..115816659)、PTGER4： NC_000005.10(40679915..40740936)、TAC1：NC_000007.14(97732086..97740472)、HOXA7：NC_000007.14 (27153716..27156675)和SCT：NC_000011.10(626095..627692)。

本发明所述的组合作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

一种用于检测的血浆中肺癌相关的甲基化基因组合物，包含荧光定量PCR检测本发明所述的甲基化基因组合的引物和探针。

上述特异性引物长度均在15-30nt范围内，且在严格条件下与亚硫酸氢盐处理后的甲基化目标基因区域DNA杂交。

上述特异性探针经过MGB修饰,长度为15-30nt,且在严格条件下与亚硫酸氢盐处理后的甲基化目标基因区域DNA杂交。

作为本发明的一种优选，检测SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT基因甲基化状态的引物和探针分别如下所示：

其中，TaqMan探针的5'端标记的荧光基团为有机荧光染料或无机染料中的任一种，3'端标记猝灭基团为有机染料的任一种。

本发明所述的组合物在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

一种肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于包含本发明所述的组合物。

作为本发明的一种优选，所述的试剂盒还包含荧光定量PCR检测内参基因GAPDH的引物和探针。

作为本发明的一种优选，所述的试剂盒中还包含：PCR反应体系、阴性质控品和阳性质控品，所述PCR 反应体系包括：

每个反应体积为20μL，其中含有DNA聚合酶及PCR反应缓冲液的预混液10μL/反应；各肺癌相关基因及内参GAPDH亚硫酸氢盐转化后的DNA的上、下游引物及TaqMan探针组，其中每一种基因及内参GAPDH的上、下游引物浓度均为0.2μΜ～0.6μΜ/反应，每一种基因及内参GAPDH探针均为0.2μΜ～0.6μΜ/反应；阳性质控品500μL；阴性质控品500μL。

所述的阴性质控品为无DNA酶的水或者经亚硫酸氢盐转化后的人基因组DNA，所述的阳性质控品为稀释到一定浓度的人工合成质粒DNA。

上述试剂盒中DNA聚合酶及PCR反应缓冲液的预混液包括热启动TaqDNA聚合酶PCR缓冲液中包含 dNTP,Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵和氯化镁等。

使用本发明试剂盒进行检测时，受试样品DNA为经过亚硫酸氢盐转化试剂盒处理过的完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。

进一步地，在一个反应管内进行多个核酸片段检测，并同时在一个反应管内进行多个波段荧光信号检测，通过不同的荧光信号区别不同的DNA片段；或者，可以在不同的反应管内进行不同核酸片段检测，并同时在一个反应管内进行单个波段荧光信号检测，通过荧光信号区别不同的DNA片段；或者，可以在不同的反应管内进行多个核酸片段检测，并同时在一个反应管内进行多个波段荧光信号检测，通过荧光信号区别不同的DNA片段。

进一步地，所述待测样品来源于：含有细胞的样本提取的核酸，人源血浆但不限于血浆，也包括血浆、血清、全血中无细胞DNA或循环肿瘤DNA；

进一步地，所述试剂盒其特征在于，包括如下步骤：采用DNA提取试剂盒提取并纯化人源样DNA；将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐转化试剂盒进行处理；以处理后的DNA为模板，采用所述引物探针组和所述内参基因的引物及探针进行PCR扩增。

一种血浆中肺癌多种相关基因甲基化的检测方法，包括以下步骤：

(1)血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂盒从受试者血浆样本中提取并纯化游离DNA(其他液体活检样本可用相对应的提取试剂盒提取纯化即可)；

(2)血浆游离DNA甲基化转化：利用血浆游离DNA甲基化转化试剂盒对提取的血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐试剂处理并随后进行纯化(其他液体活检样本可用相对应的亚硫酸氢盐转化试剂盒转化并纯化即可)；

(3)qPCR扩增：对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA进行PCR扩增，利用Taqman分析法，每个模板的PCR 扩增做三个重复；每个反应体系20μL，其中含2xPCR反应缓冲液；本发明所述肺癌相关目标基因区域靶点的引物各400nM，所对应探针各400nM；GAPDH基因区域靶点的引物400nM，GAPDH基因区域靶点探针400nM； qPCR程序为：

一个循环：95℃30s；

然后50个循环：95℃15s，60℃30s；

PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间。

有益效果：

经实验测试，本发明试剂盒可将生物标记物的检测灵敏度提高到3-10拷贝/微升，检测灵敏度和临床敏感性的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及筛选合适的靶标基因检测位点及优化各靶标组合实现的。本发明的技术方案中，可以将6种肺癌相关基因SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT 中多种基因组合对肺癌患者及正常人进行验证，并进行ROC曲线拟合及多元回归。实验表明使用肺癌患者血浆cfDNA进行上述多种基因甲基化检测进行验证时，上述肺癌相关甲基化基因的甲基化水平普遍偏高；而阴性验证实验中，使用正常人血浆中cfDNA进行上述多种基因甲基化检测，结果表明仅有极低的轻微甲基化表现。对以上检测结果进行甲基化相对定量标准曲线处理，并将每个检测基因的甲基化程度数值带入多元回归方程，通过Cut-off值判定肺癌发生风险。总之，6种肺癌相关基因SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、 HOXA7和SCT基因的甲基化情况是潜在的肺癌(尤其是早期肺癌)诊断、预后评估及疗效监测的有意义的临床指标。本发明对于深入了解早期肺癌的发病机制，认识其发生发展规律，提高我国早期肺癌诊治水平具有重要的价值，也为寻求新的早期肺癌靶向治疗策略奠定基础。本发明提供的试剂盒，可以应用于辅助诊断肺癌和肺癌进展监测，同时为多发性肺癌的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明：

图1 SHOX2甲基化阳性参考品qPCR扩增曲线图(A)；SHOX2甲基化的标准曲线图(B)；SHOX2甲基化阴/阳性参考品qPCR扩增曲线图(C)；CDO1甲基化阳性参考品qPCR扩增曲线图(D)；CDO1甲基化的标准曲线图(E)； CDO1甲基化阴/阳性参考品qPCR扩增曲线图(F)

图2为SHOX2相对甲基化定量标准曲线方程(A)及CDO1相对甲基化定量标准曲线方程(B)

图3为肺癌患者血浆中SHOX2基因甲基化及GAPDH检测扩增曲线图(A)；正常人血浆中SHOX2基因甲基化及GAPDH检测扩增曲线图(B)

图4为6种肺癌甲基化相关基因组合ROC曲线：组合1的ROC曲线(A)；组合2的ROC曲线(B)；组合3 的ROC曲线(C)组合4的ROC曲线(D)；组合5的ROC曲线(E)

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的附图，通过特定的示例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，只是作为示例，因此不能以此来限制本发明的保护范围。

为使本领域技术人员了解本发明的效果及特点，本文对所提到的术语进行定义：

本文所用的“肺癌(lung cancer)”，是指肺部的恶性肿瘤，特征为肺部组织中的细胞不受控制地生长。肺癌包括小细胞肺癌(small-cell lung carcinoma，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)。

本文所用的“早期肺癌”表示处于于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。或者肺癌Ⅰ、Ⅱ期。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。

本文所用的“核酸”、“核酸序列”等等，指的是聚核苷酸，可以是gDNA、质粒DNA，cfDNA。“gDNA”指的是基因组DNA，质粒DNA是体外重组DNA,cfDNA指人体血液中循环的无细胞DNA。也可以是这些物质的组合(即部分是gDNA和部分是质粒DNA的重组核酸)。

本文所用的“CpG岛”指CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG 保持或高于正常概率。CpG岛主要位于基因的启动子(promotor)和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。CpG岛的GC含量大于50％，长度500～1000bp。

本文所用的“甲基化”是指DNA双链胞嘧啶的位置C5处的胞嘧啶甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为典型的体外DNA扩增方法未保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化 DNA”还可指原始模板分别为未甲基化或甲基化的扩增DNA。

本文所用的“高甲基化的”是指特定位点(例如，CpG二核苷酸或一组二核苷酸或富含CpG的区)以一定速率以特定样品类型或组织类型甲基化的核酸，所述速率在可测量程度上大于对于另一种组织或样品类型中同一DNA中的可比较位点所观察到的速率。“高度甲基化的”可以指单个特定C残基或区中多个C内的平均甲基化速率，作为所测定样品中所述位点的拷贝的分数。在一些实施方案中，在不使所述术语限于任何特定的甲基化水平的情况下，超甲基化位点可>10％甲基化，优选地>20％至40％，更优选地>50％至75％，仍更优选地介于75％与100％之间。

术语“荧光定量PCR或者qPCR”是指由Eads等(1999)Cancer Res.59:2302–2306描述的本领域公认的基于荧光的实时PCR技术。

本文所用的“引物探针组”指检测中所需要的引物和探针，引物指在置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，在核苷酸和诱导剂诸如生物催化剂(例如，DNA聚合酶等)的存在下)能够充当合成的起始点的寡核苷酸(无论是当在纯化的限制性消化中时天然存在还是以合成方式产生)。为了扩增的最大效率，引物通常是单链的，但可以可替代地为部分或完全双链的。与模板核酸杂交的引物部分足够长以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于很多因素，包括温度、引物来源和使用方法。引物可包括标记、标签、捕获部分等。探针指能够与另一种目标寡核苷酸杂交的无论是当在纯化的限制性消化中时天然存在还是以合成方式、以重组方式或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。预期了在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”标记使得可在任何检测系统中检测到，所述任何检测系统包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。不希望本发明限于任何特定的检测系统或标记。

本文所用的“试剂盒”指检测中所需要的的试剂，包括引物、探针、酶、dNTP，缓冲液、阳性质控品和阴性质控品。

本文所用的“灵敏度”指可检测的最低分析浓度，或称为检测限，本试剂盒检测方法的“特异性”指对非靶标及未甲基化的靶标检测为阴性的能力。而“临床敏感性”指试验检出有病的人数占患者总数的比例(真阳性率)，“临床特异性”指试验检出健康对照的人数占患者总数的比例(真阴性率)

本发明采用相对甲基化定量方法，以GAPDH作为内参基因(非甲基化)，建立相对于GAPDH的相对甲基化量标准曲线方程，将检测数值ΔCt mean带入方程即可得到肺癌相关基因的相对甲基化程度。

本发明中，在一些实施方案中，采用统计方法构建基于生物标志物基因的甲基化水平的诊断模型，统计方法选自以下方法：多元线性回归，逻辑回归、聚类分析、贝叶斯和非贝叶斯方法等。

本发明中，利用本发明的试剂盒辅助医师对患者患肺癌的风险进行分级并计划接下来将采取的诊断步骤。本发明提供的方法类似地还可用于评估无症状高风险患者中的肺癌风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指标的全面评估的一部分。

本发明中生物标志物基因的组合提供了用于在肺癌进展不同分期中预测肺癌存在或检测肺癌的敏感、特异且准确的手段。对血浆中甲基化水平的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，所公开的方法可用于预测或检测样品中肺癌的存在、肺癌的阶段、肺癌的亚型、肺癌的良性或恶性、肺癌的转移可能性以及与预防、诊断和治疗患者肺癌有关的其它肺癌特征。

另外，本发明技术方案中，采用甲基化相对定量方法，主要以GAPDH为内参参照，并构建甲基化相对定量参考品，然后进行相对甲基化标准曲线的制作。通过标准曲线可得出肺癌相关基因的甲基化程度，相比于甲基化定量检测更加灵敏，提高了检测准确性，减少了假阳性率，对于肺癌及早期肺癌诊断更加有临床价值。

此外，本技术发明方案中，采取单基因双靶标检测，每个基因均有两组筛选优化的甲基化检测的引物探针组，且互不干扰，能够显著提高检测临床敏感性，提高了真阳性率。

实施例1：实时荧光PCR检测DNA甲基化、引物探针组设计及验证

本实施例中提供一种对包括6种肺癌相关基因SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT及内参GAPDH 的引物探针组设计方法及流程；

本实施例中还提供了一种血浆中肺癌相关基因甲基化的检测方法及试剂盒，可以对肺癌及早期肺癌进行筛查和辅助诊断，检测结果通过阴性参考品、阳性参考品进行验证，对上述设计的引物探针组进行验证。

具体步骤如下：

1.对6种肺癌相关的基因及内参GAPDH序列进行查询：

通过National Center for Biotechnology Information(NCBI)查询肺癌相关的基因SHOX2、CDO1、PTGER4、 TAC1、HOXA7和SCT及内参GAPDH，并通过ABI公司推出的MethylPrimer Express v1.0软件或者“MethPrimer”进行CpG岛预测，MethPrimer默认的CpG岛跨度至少200bp,GC含量>50％,CpG出现频率＞0.6.因此符合这些参数的区域都默认为CpG岛。找到CpG岛所在位置上下游50bp处进行序列截取，并下载保存好标准硫化后的序列，即除CpG二核苷酸之外的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

2.针对肺癌相关的基因SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT及内参GAPDH的序列进行上、下游引物及探针设计:利用Methyl Primer Express v1.0或者Meth Primer或者用Primer Premier5对6种肺癌相关基因及内参GAPDH的序列进行上、下游引物及探针设计。并利用NCBI验证引物探针特异性。

设计上下游引物均需满足一下条件：

(1)扩增产物长度60-200bp之间；(2)引物长度15-30bp；(3)引物的3’端避免高GC或高AT含量区域； (4)引物3’端最后一个碱基为G或者C，避免使用T；(5)正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超过5℃。 Tm值调整至52℃-62℃；(6)引物的GC含量控制在30％-70％之间为好；(7)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，避开GC含量不均匀的区域；(8)引物设计时请尽量避开T/C或者A/G的连续结构；除此之外，还有(8)引物的3’端至少有一个CpG中的C；(9)引物中应包含尽量多的CpG位点。

设计探针均需满足以下条件：

(1)长度一般为18-40mer；(2)G-C含量控制在40-80％左右；(3)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现；(4)在引物的5’端避免使用G；(5)选用比较多的碱基C。(6)退火温度Tm控制在 68-70℃左右。另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。

得到6种肺癌甲基化相关基因及内参基因GAPDH的上、下游引物及探针组如表1：

表1本发明试剂盒中包含的特异性引物探针组

将上述引物探针序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

阳性参考品的制备(以SHOX2为例，其他6种甲基化基因及GAPDH的方法同SHOX2，以下不再赘述)

通过将目标序列质粒进行大肠杆菌转化获得，

将SHOX2、其他肺癌甲基化相关基因及GAPDH检测靶标转化后的阳性序列如表2所示，插入质粒pUC57构建重组质粒，抗性为氨苄青霉素，该重组质粒转化到大肠杆菌top10中。以上部分交生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2本发明试剂盒所检测的特定基因的检测靶点转化后阳性序列

大肠杆菌培养

大肠杆菌在固体LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素50μg/ml，琼脂15g/L,氨苄青霉素的浓度为50μg/ml)37℃培养24h，挑取单菌落到3ml液体LB 培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素50μg/ml)37℃、210r/min,培养 12h后吸取100μL到10mL液体LB培养基进行扩大培养(1％)，培养条件如下：37℃、210r/min,培养2 h。12000r/min离心1min收集大肠杆菌菌体。

大肠杆菌中质粒提取

质粒提取用质粒提取利用天根DP103-02质粒小提试剂盒进行提取，提取步骤参考其说明书部分。利用Nano Drop对提取的质粒进行定量检测，得到高浓度SHOX2的阳性参考品。目标序列的拷贝数计算方法如下：

目标序列的拷贝数＝质量(g)×6.23×10²³/660×质粒DNA长度

利用本试剂盒检测灵敏度分析具体如下(SHOX2为例)

本试剂盒含有DNA聚合酶5G qPCR Premix 1.0mL；6种甲基化基因及GAPDH序列的上、下游引物及探针组，阳性质控品500μL和阴性对照品500μL。

同时本试剂盒还提供阳性质控品和阴性质控品，具体如下：阳性质控品是经过测序确认的质粒重组DNA，浓度为1×10⁴copies/μL；阴性质控品为经亚硫酸氢盐转化的人基因组DNA或者无DNA酶的水。

取20μL SHOX2阳性参考品，加入180μL DEPC处理的水中依次进行梯度稀释，获得以下不同梯度的阳性参考品。依次为：3.52×10⁵copies/μL、3.52×10⁴copies/μL、3.52×10³copies/μL、 3.52×10²copies/μL、3.52×10¹copies/μL、3.52×10⁰copies/μL。

同样，取20μL CDO1阳性参考品，加入180μL DEPC处理的水中依次进行梯度稀释，获得以下不同梯度的阳性参考品。依次为：3.90×10⁵copies/μL、3.90×10⁴copies/μL、3.90×10³copies/μL、 3.90×10²copies/μL、3.90×10¹copies/μL、3.90×10⁰copies/μL。

利用上述梯度稀释的DNA模板，进行qPCR实验，反应体系如下：

表3 SHOX2/CDO1甲基化检测反应体系

5G qPCR Premix由dNTP,Mg²⁺,Taq DNA聚合酶,Tris-HCI及KCl等组成，购自天筛(上海)科技有限公司。引物探针提供序列后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

SHOX2的两组探针标记5‘端标记FAM，3‘端标记MGB；CDO1的两组探针标记5‘端标记VIC，3‘端标记 MGB；GAPDH的探针标记5‘端标记ROX，3‘端标记MGB；实现三重检测。

所使用的引物探针序列见表1。

每个检测组设置三个复孔，qPCR反应条件如下：

表4 SHOX2、CDO1甲基化及GAPDH检测反应条件

结果如图1所示，本发明SHOX2最低可以检测到3.52×10⁰copies/μL，且当甲基化SHOX2阳性参考品在 3.52×10⁵copies/μL到3.52×10⁰copies/μL范围内呈现较好的线性范围，同时CDO1最低可以检测到 3.90×10⁰copies/μL，且当甲基化CDO1阳性参考品在3.90×10⁵copies/μL到3.90×10⁰copies/μL范围内呈现较好的线性范围其他基因检测范围均在10⁵copies/μL到10⁰copies/μL数量级之间，最低检测限可达3-10copies/μL。

阴性参考品的制备验证方法特异性

通过将阴性目标序列质粒进行大肠杆菌转化获得，将SHOX2、CDO1及其他肺癌相关基因检测靶标非甲基化模板模拟亚硫酸氢盐转化，将表2中序列中的所有“C”全部转化为“T”；将序列交由工生物工程(上海)股份有限公司完成完成以下步骤：插入质粒pUC57构建重组阴性质粒，抗性为氨苄青霉素，该重组质粒转化到大肠杆菌top10中，储存在甘油中。

按照阳性参考品的制备的步骤：大肠杆菌培养，质粒提取，提取核酸定量，加入DEPC处理的水稀释到 1×10⁵copies/μL作为阴性对照品。

按照上述甲基化SHOX2/CDO1阳性参考品的PCR反应体系及反应条件，加入阴性参考品进行反应，实验结果如附图1(C)、(F)。结果表明，无任何扩增信号，表明本试剂盒设计的所有引物探针特异性高，均可区分甲基化与非甲基化模板。

使用阴阳性参考品浓度约1×10⁵copies/μL作为模板，6种肺癌甲基化基因及GAPDH引物探针组结果见表5：表5所设计引物探针组对阳性参考品(甲基化,“+”)和阴性参考品(非甲基化,“-”)检测结果(CT，均值)

实施例2：构建靶标相对甲基化标准线性方程

配制以GAPDH为参照的SHOX2/CDO1相对甲基化程度参考品，主要包括甲基化程度为100％(10⁵copies/ul (SHOX2):10⁵copies/ul(CDO1)：10⁵copies/ul(GAPDH))、10％(10⁴copies/ul(SHOX2):10⁴copies/ul (CDO1):10⁵copies/ul(GAPDH))、1％(10³copies/ul(SHOX2):10³copies/ul(CDO1):10⁵copies/ul(GAPDH))、 0.1％(10²copies/ul(SHOX2):10²copies/ul(CDO1):10⁵copies/ul(GAPDH))、0.01％(10¹copies/ul(SHOX2)： 10¹copies/ul(CDO1):10⁵copies/ul(GAPDH))。其他4种肺恶性肿瘤的基因的相对甲基化参考品同SHOX2/CDO1制备方法，因此不再赘述。

利用上述梯度稀释的DNA模板，进行qPCR实验，反应体系如下：

表3 SHOX2/CDO1相对甲基化检测反应体系

以上SHOX2上、下游引物指SHOX2引物组合1和组合2的两组引物。CDO1上、下游引物指CDO1引物组合1 和组合2的两组引物。SHOX2的两组探针标记5‘端标记FAM，3‘端标记MGB；CDO1的两组探针标记5‘端标记VIC，3‘端标记MGB；GAPDH的探针标记5‘端标记ROX，3‘端标记MGB；实现三重检测。

每个检测组设置三个复孔，qPCR反应条件同实施例1。

实验结果见附图3。

实施例3：6种不同肺癌甲基化基因联合检测试剂盒检测肺癌患者、正常人血浆的临床敏感性和临床特异性验证

本示例通过验证肺癌血浆中6种肺癌相关甲基化基因不同组合的DNA甲基化状态及正常人血浆里的血浆游离DNA的甲基化状态判断本试剂盒中所选基因组合的临床敏感性及临床特异性。

血浆游离DNA提取：

使用

Serum/Plasma Circulating DNA Kit(购自南京诺唯赞生物技术有限公司，货号N902-01)，按照试剂盒说明书进行操作。

血浆游离DNA亚硫酸氢盐转化：

以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA Methylation-DirectTM KIT(D5031)说明书进行亚硫酸盐转化。扩增与检测：

使用实时荧光PCR测定法，在来自病理学确定为肺癌的80名患者和68名正常个体的血浆中，检测了上述6 种标志物基因不同组合的相对甲基化水平。

将纯化后的核酸进行qPCR扩增，同时使用每个基因的两组引物探针组(见表1)，能够增加检测临床敏感性。设置三个复孔，每个反应均检测内参GAPDH，反应体系及条件同实施例1中验证试验，反应结束后分析数据，当Ct阈值设定在线性扩增区间，读取各个样本的相关甲基化基因的ΔCT mean值(检测阴、阳性样本扩增图见附图2)，根据靶标相对甲基化标准线性方程计算相对甲基化程度，然后进行靶标组合检测。

本发明使用可商购软件包(IBM SPSS Statistics 24购自IBM，GraphPad Prism8.0.2购自GraphPad)进行血浆生物标志物水平的描述性统计、受试者工作特征(ROC)曲线。使用非参数Kruskal-Wallis检验 (ANOVA)，然后使Dunn's多重比较后检验确定了统计学差异。对于所有的统计学比较，P值<0.05视为统计学显著。使用逻辑回归组合了6种标志物基因，产生的AUC为0.9433(95％CI：0.8194-0.9723；P值： <0.0001)(图4)。为了让监测分析方法更简单，不同标志物进行多组组合并建立逻辑回归模型。得到的AUC 值及P值见表6，ROC曲线图见附图4。

表6不同标志物组合的ROC曲线的AUC值及P值

一般来说，6种标志物的逻辑回归模型的临床敏感性和临床特异性稍好些，但基于操作分析程序和成本考虑，其他几种标志物组合也是比较好的选择。

根据回归方程将各基因CT值带入方程，并根据ROC曲线得出cut-off值，并根据cut-off值得到所检测生物标志物的组合和临床敏感性和临床特异性结果示于表7中。

表7所检测生物标志物的组合和临床敏感性及临床特异性结果

为了达到不同的预期用途和目的，本发明提供的检测试剂盒可通过调整cut-off值达到不同的临床敏感性和临床特异性指标。在实施例2中，为了提高临床敏感性，设定cut-off值并不代表本发明仅能用此为 cut-off值，可根据本发明提供的ROC曲线，选取不同的cut-off值作为判定标准。

表6/7结果表明，将6种肺癌相关甲基化基因进行不同组合，组合检测性能指标良好。其AUC值均高于0.8500，说明上述肺癌相关基因相对甲基化定量的组合检测能够使准确性得到提高。

实施例4.临床实验验证单基因双靶点检测与单基因单靶点检测临床敏感性、临床特异性

以试剂盒SHOX2、CDO1、HOXA7和SCT组合检测为例，对30例肺癌患者及30例正常人志愿者血浆样本分成两等份(样本组A/B)，验证单基因双靶点检测与单基因单靶点检测差异性，即一份样本用SHOX2、CDO1、HOXA7 和SCT组合中每个基因两组引物探针组检测，另一份样本用用SHOX2、CDO1、HOXA7和SCT组合中每个基因的其中一组引物探针组检测。具体步骤如下：

以上所述两等份样本，按照实施例3中的cfDNA提取及亚硫酸盐转化步骤对临床样本进行处理，以亚硫酸氢盐处理的DNA模板，进行实时荧光定量PCR验证。

使用SHOX2、CDO1、HOXA7和SCT基因的两组引物探针(样本组A)：

反应体系A-1：荧光定量PCR扩增每孔反应体系的终体积组成为：5G qPCR Premix预混液10μL，SHOX2特异性引物探针组合1、组合2混合液(10μΜ)0.8μL，其中两组探针均标记FAM；CDO1特异性引物探针组合1、组合2混合液(10μΜ)0.8μL，其中两组探针均标记VIC；GAPDH特异性引物探针混合液(10μΜ) 0.8μL，其中GAPDH探针标记ROX，加无酶水至15μL，最后加模板5μL，加盖，瞬时离心。样品均进行3 个复孔(平行样)检测并按照实施例1中反应条件进行试验。

反应体系A-2：荧光定量PCR扩增每孔反应体系的终体积组成为：5G qPCR Premix预混液10μL，HOXA7特异性引物探针组合1、组合2混合液(10μΜ)0.8μL，其中两组探针均标记FAM；SCT特异性引物探针组合1、组合2混合液(10μΜ)0.8μL，其中两组探针均标记VIC；GAPDH特异性引物探针混合液(10μΜ) 0.8μL，其中GAPDH探针标记ROX，加无酶水至15μL，最后加模板5μL，加盖，瞬时离心。样品均进行3 个复孔(平行样)检测并按照实施例1中反应条件进行试验。

使用SHOX2、CDO1、HOXA7和SCT基因的单组引物探针(样本组B)：

反应体系B-1：荧光定量PCR扩增每孔反应体系的终体积组成为：5G qPCR Premix预混液10μL，SHOX2特异性引物探针组合2混合液(10μΜ)0.8μL，其中探针标记FAM；CDO1特异性引物探针组合1混合液(10 μΜ)0.8μL，其中探针标记VIC；GAPDH特异性引物探针混合液(10μΜ)0.8μL，其中GAPDH探针标记 ROX，加无酶水至15μL，最后加模板5μL，加盖，瞬时离心。样品均进行3个复孔(平行样)检测并按照实施例1中反应条件进行试验。

反应体系B-2：荧光定量PCR扩增每孔反应体系的终体积组成为：5G qPCR Premix预混液10μL，HOXA7特异性引物探针组合1混合液(10μΜ)0.8μL，其中探针标记FAM；SCT特异性引物探针组合1混合液(10 μΜ)0.8μL，其中探针标记VIC；GAPDH特异性引物探针混合液(10μΜ)0.8μL，其中GAPDH探针标记 ROX，加无酶水至15μL，最后加模板5μL，加盖，瞬时离心。样品均进行3个复孔(平行样)检测并按照实施例1中反应条件进行试验。

数据处理同实施例2，结果如表8：

表8单基因双靶点检测与单基因单靶点检测AUC值、临床敏感性及临床特异性比较

以上结果表明，单基因双靶点与单基因单靶点检测的4种肺癌相关基因相对甲基化的组合检测的AUC值均在0.8900以上，明显单基因双靶点检测临床敏感性更高，临床特异性更好，但总体差别不大，所以在本试剂盒应用中可综合考虑成本及临床性能，选择两种检测方式。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgattcgcgt agtttttttt aggag 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgaataacac gaaccgaaaa acga 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actcaaccta cctacgaacc ga 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggatagtta ggtaattttc gtttcg 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaccaacat aacgtaaacg cct 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgatcgggg tcgtacga 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgattggtt cgggaagttc gg 22

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccgcgacta accaacga 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgaacgacga acgcaacgc 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcggggttgg tacgattcg 19

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgccgttccc gaccga 16

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttccgccta cgctataacc g 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttttgtatt ttaaggttgc gtatc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actaaactat tcaaccgatc gaaac 25

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttcggggtta attcgttcgt t 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtttcgattt aaaggcgata cg 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taaccgaaac taaaacccta ctcg 24

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cggggaatgg acgcgg 16

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggtattgagt aggcgaaaga gc 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctctaattc ctccgaacgc ac 22

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aatcgctccg cactctcg 18

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcggtagtta tcgagagtgc g 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttactacgac gaacaatccc gc 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tctaattcct ccgaacgcac g 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcgtttgcga taagacggac g 21

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaccgcatcc aaaaataaat acgaaa 26

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caaccgcgcc atacaacg 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggagcgtagc gttgggga 18

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccgaaaatca cgaaactacc ga 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acaacctaac tccgctcttc cg 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttcgggcgtc gttataaagg g 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccataacgaa atcgaaacgc aa 22

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acgctacgac cacgaccc 18

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgtagggttc ggcgatattt agac 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

accctataac aaccgctaaa accg 24

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cgccctcccg caaacgacta a 21

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gagaaatttg ggaggttagg gatgg 25

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccaaacccac cccacaacaa c 21

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

acacatccaa cctacacc 18

Claims

1.血浆中肺癌相关的甲基化基因组合，其特征在于所述的甲基化基因组合包含SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT中的任意两种及以上，优选至少包含SHOX2和CDO1。

2.根据权利要求1所述的血浆中肺癌相关的甲基化基因组合，其特征在于所述的组合还包含选自以下任意一种或多种基因：PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT；所述的组合优选自以下任意一种：

组合1：SHOX2和CDO1；

组合2：SHOX2、CDO1和HOXA7；

组合3：SHOX2、CDO1、HOXA7和SCT；

组合4：SHOX2、CDO1、PTGER4、HOXA7和SCT；

组合5：SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT。

3.权利要求1～2中任一项所述的组合作为检测靶点在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

4.一种用于检测的血浆中肺癌相关的甲基化基因组合物，其特征在于包含荧光定量PCR检测权利要求1～2中任一项所述的甲基化基因组合的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，检测SHOX2、CDO1、PTGER4、TAC1、HOXA7和SCT基因甲基化状态的引物和探针分别如下所示：

6.权利要求4～5中任一项所述的组合物在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

7.一种肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于包含权利要求4～5中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含荧光定量PCR检测内参基因GAPDH的引物和探针；优选地，荧光定量PCR检测GAPDH基因的引物如SEQ ID NO:37、38所示，TaqMan探针如SEQ ID NO:39所示。

9.根据权利要求7所述的肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中还包含：PCR反应体系、阴性质控品和阳性质控品，所述PCR反应体系包括：

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性质控品为无DNA酶的水或者经亚硫酸氢盐转化后的人基因组DNA，所述的阳性质控品为稀释到一定浓度的人工合成质粒DNA。