CN114736968A - 血浆游离dna甲基化标志物在肺癌早筛中的用途以及肺癌早筛装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血浆游离DNA甲基化标志物在肺癌早筛中的用途以及肺癌早筛装置，属于基因诊断技术领域。本研究通过肺癌血浆cfDNA来研究肺癌和健康人的甲基化差异，并筛选出具有明显差异的甲基化区域，然后通过广义线性模型的方法，首次筛选出29个最佳的差异性甲基化区域(Differentially Methylated Region，DMR)并建立肺癌甲基化风险预测模型，适用于对早期肺癌进行风险预测评估，适用于高危人群肺癌的筛查与诊断。

Description

血浆游离DNA甲基化标志物在肺癌早筛中的用途以及肺癌早 筛装置

技术领域

本发明涉及血浆游离DNA甲基化标志物在肺癌早筛中的用途以及肺癌早筛装置，属于基因诊断技术领域。

背景技术

肺癌是当前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。在中国，肺癌的发病率及死亡率位居所有恶性肿瘤第一位。根据WHO分类标准，肺癌可以分为小细胞肺癌（SCLC，约15%病例）和非小细胞肺癌（NSCLC，约85%病例），其中NSCLC最常见的组织学亚型是腺癌和鳞状细胞癌。和其他恶性肿瘤类似，肺癌5年生存率随着诊断分期的升高而降低，Ⅰ期5年生存率为55.5%，而Ⅳ期仅为5.3%，相差10.5倍。Ⅰ、Ⅱ期NSCLC可以通过外科手术根治性切除的治疗方式而治愈，而80%以上的NSCLC在确诊时已经为晚期，失去进行手术治疗根治的机会，需要通过放化疗延长生命。肺癌的早期筛查诊断是改善肺癌患者生存率最重要的措施之一，目前尚无公认的肺癌早期筛查的最佳模式，因此，亟待开发出更高效和更经济的肺癌诊断方法以真正实现肺癌的早期诊断。

胸部低剂量计算机断层扫描（LDCT）是现阶段研究最多且最为大家公认的高危人群肺癌早期筛查手段，但LDCT筛查中出现的高假阳性率、过度诊断和治疗、辐射暴露、经济费用等问题也使LDCT用于肺癌早期筛查倍受争议。理想的筛查手段应具备以下特点：①无创；②有较好的量化指标和可重复性；③较高的敏感性和特异性。液体活检（liquidbiopsy）是指利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关分子分型信息的技术，是实现对肿瘤“个体化精准医疗”的重要手段。伴随着肺癌诊治中各种分子生物标志物的发现与应用，液体活检在肺癌临床诊断治疗领域的应用也日益广泛，其作为一种肿瘤无创检测方法，可以通过检查血液来源的肿瘤分子生物层面的改变来发现肿瘤，同时具备无创、简单、便捷的特点，更重要的是，其能有效克服肿瘤异质性，可有效实现精准的肿瘤辅助诊断、实时监测、疗效评价及预后判断。因此，液体活检有望成为肺癌早期筛查、伴随诊断、治疗监测及预后评估的理想技术。

液体活检主要包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和外泌体等检测，其中ctDNA是目前最受关注的液体活检靶标。ctDNA是指肿瘤在生长过程中，向人体血液循环释放的携带有肿瘤特异性基因突变、缺失、插入、重排、拷贝数变异及甲基化等信息的DNA片段，其主要来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或者肿瘤细胞分泌的外泌体。正常人血液循环系统中也会携带由正常细胞释放的的循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA），其不含有肿瘤相关的变异信息。因此基于血液来源的cfDNA检测能够区分出肿瘤人群和健康人群差异。

DNA甲基化是基因表观遗传学修饰方式之一，其与癌症的发生发展密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因沉默，进而影响肿瘤进程。到目前为止，DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，且发生在癌前或者癌症早期阶段。同样的，在肺癌患者中已检测出大量甲基化发生位点，肺癌相关基因甲基化异常不仅在肺癌组织中被检测，在肺癌患者的血清或血浆、痰、支气管刷检和活检标本中均能够检测到。之前的研究已经发现，在肺癌发生的早期，游离核酸甲基化水平会出现微量变化，且甲基化程度随癌症恶性演变而增加，检测其游离形式可能成为肺癌早期检测和风险评估的一个生物指标。因此，可以针对血浆来源的cfDNA开发出能够进行肺癌筛查的甲基化诊断标志物。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：针对现有技术中肺癌早筛缺少基于cfDNA来源的生物标志物的问题，提供了一种对血浆样本cfDNA进行全基因组甲基化测序，通过对高通量测序结果进行肺癌和健康人血浆差异甲基化区域（DMR）分析、构建模型，实现了对肺癌无创筛查的目的。

一种肺癌血浆cfDNA来源的甲基化标志物，包括29个甲基化区域，所述的甲基化区域在基因组上的位置如下所示：chr1:16846957-16847076，chr1:147789828-147790115，chr1:202694171-202694290，chr1:209632977-209633096，chr2:88313308-88313427，chr2:174129371-174129490，chr3:23979298-23979417，chr3:24031011-24031130，chr3:140935671-140935790，chr3:171146299-171146418，chr4:29681671-29681790，chr4:111475706-111475825，chr5:2261571-2261690，chr5:96338471-96338590，chr5:153859895-15386001，chr6:113416071-113416190，chr7:27184678-27184797，chr7:112529894-112530013，chr8:49595550-49595669，chr8:52783811-52783930，chr8:101177686-101177805，chr9:32891311-32891430，chr11:70672332-70672451，chr15:59157379-59157505，chr16:55729777-55729896，chr17:17626292-17626411，chr17:17626493-17626612，chr18:58744011-58744130，chr20:37854411-37854530。

用于检测所述的甲基化标志物的试剂在用于制备对肺癌诊断试剂中的应用。

所述的应用中，诊断试剂是用血浆游离DNA作为样本。

所述的应用还包括如下步骤：

S1：获取肺癌和健康人血浆样本，提取cfDNA，构建文库及酶促转化，获得扩增文库产物并进行甲基化测序；

S2：测序数据对比至参考基因组，获得甲基化标志物的区域上的测序数据结果；

S3：获取每个甲基化标志物的区域上的甲基化率数值；

S4：将各个甲基化标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肺癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肺癌的预测。

步骤S3中，甲基化率是通过在甲基化标志物的区域中的CpG位点上的发生甲基化的reads数除以CpG位点的总reads数计算得到。

所述的参考基因组是hg19版。

所述的分类模型是以发生肺癌的概率作为输出值。

一种用于对肺癌早筛诊断装置，包括：

测序模块，用于从血浆样本中提取cfDNA并进行甲基化测序，获得甲基化标志物的区域上的测序数据结果；

比对模块，用于将测序数据结果比对至参考基因组，获取每个甲基化标志物的区域上的甲基化率数值；

判定模块，用于将各个甲基化标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肺癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肺癌的预测。

所述的比对模块中，通过在甲基化标志物的区域中的CpG位点上的发生甲基化的reads数除以CpG位点的总reads数计算得到甲基化率。

提取模块中包含cfDNA提取试剂盒，用于进行cfDNA提取。

所述的分类器是H2O算法分类器。

一种计算机可读取介质，其记载有可以运行对肺癌进行诊断的计算机程序；所述的计算机程序包括执行以下步骤：

将甲基化标志物的区域上的测序数据结果比对至参考基因组，获取每个甲基化标志物的区域上的甲基化率数值；

将各个甲基化标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肺癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肺癌的预测。

有益效果

本发明首次提供了一种用于肺癌筛查的液体活检甲基化生物标志物诊断模型，该模型能够诊断出早期肺癌，具有通量高、检测特异性和敏感性高的优点。

附图说明

图1示出了本专利的流程图；

图2示出了本专利提取及建库方法测序获得的插入片段分布图；

图3示出了肺癌人群和正常人群血浆游离DNA的633个DMR热图；

图4示GLM模型下最佳建模DMR组合筛选；

图5示出了最佳29个甲基化标志物在肺癌血浆和正常血浆样本中的箱型图。

图6A示出了29个甲基化标志物在训练集的受试者工作特征曲线（ROC）和相关曲线下面积（AUC）；

图6B示出了29个甲基化标志物在验证集的受试者工作特征曲线（ROC）和相关曲线下面积（AUC）。

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明提供的从血浆中获得游离DNA的磁珠提取方法，可以较好地从血浆中获得适合于甲基化文库构建的DNA，这种提取方法主要是通过裂解消化、磁珠结合的方法获得了血浆中的游离DNA。

血浆样本来源于肺癌患者和健康人，训练集与验证集按照3:1进行划分，肺癌血浆中晚期患者数为27例，早期患者数为30例。

表1 数据集样本类型及数量

从样本中提取血浆游离DNA，血浆样本提取试剂盒以及提取步骤如下：

1）将样本置于离心机中离心获得含有游离DNA的血浆。

2）利用裂解结合液、蛋白酶K和磁珠对已离心的血浆样本进行裂解结合处理，获得裂解释放的DNA，以便磁珠与DNA结合，得到磁珠-DNA结合产物。裂解结合液的组成包括： 1-5mol/L的Tris-HCl；100-500mmol/L的NaCl；100-500mmol/L的EDTA；3-5mol/L的异硫氰酸胍；15％-20％的异丙醇；1%-5％的TritonX-100。其中蛋白酶K使用量为100-200mg。优选地，裂解液组成：2.5mol/L的Tris-HCl；300mmol/L的NaCl；250mmol/L的EDTA； 4mol/L的异硫氰酸胍；16％的异丙醇；2.5％的TritonX-100，以及蛋白酶K 150mg。

3）使用洗涤液1、洗涤液2及无水乙醇分别对磁珠DNA结合产物进行清洗，以便回收纯化DNA。其中洗涤液1的组成：1-5mol/L的Tris-HCl；100-500mmol/L的NaCl；100-500mmol/L的EDTA； 3-5mol/L的异硫氰酸胍；50％-60％的乙醇；1%-5％的TritonX-100。根据本发明的具体示例，该结合液优选：2.5mol/L的Tris-HCl；300mmol/L的NaCl；250mmol/L的EDTA；3mol/L的异硫氰酸胍；50％的乙醇；2.5％的TritonX-100。其中洗涤液2的组成：1-5mol/L的Tris-HCl；70-80%的乙醇。根据本发明的具体示例，该结合液优选：2.5mol/L的Tris-HCl；80%乙醇。

4）使用无核酸酶水从磁珠上将DNA进行洗脱，以便得到纯化的DNA。

操作步骤如下：

1）肺癌患者血浆和健康人血浆进行离心处理。4℃离心10min，获得上清。

2）取2mL已处理血浆样本，体积不足可以使用PBS补齐，向其中向加入2mL裂解结合液、200μL蛋白酶K和2.5mg磁珠，涡旋振荡30s，室温孵育10min。

3）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除上清。

4）从磁力架上取下，加入3mL洗涤缓冲液1，涡旋混匀10s，室温孵育2min。

5）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除上清。

6））从磁力架上取下，加入3mL洗涤缓冲液2，涡旋混匀10s，室温孵育2min。

7）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除上清。

8）从磁力架上取下，加入3mL 100%乙醇，涡旋混匀10s，室温孵育2min。

9）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除2mL上清。

10）余1mL上清液用1mL移液枪混匀后转移至新的1.5ml 离心管中，置于磁力架上静置2min，静置1min时上下颠倒一次样本管，静置后吸弃上清液（注意：将液体全部吸出，避免残留）。

11）室温开盖干燥45-55min（注意观察磁珠干燥状态，干燥时间根据实际情况调整）。

12）待磁珠干燥后将样本管从磁力架上取下，沿着管壁向磁珠上方加入30μL无核酸酶水，涡旋混匀，使磁珠从管壁上分离，完全混匀于无酶水中，室温孵育5min。

13）将样本管置于磁力架上静置2min，静置完成后，小心转移上清液至新的1.5mL离心管中。

实施例2

用实施例1中所述提取方法获得的cfDNA后，将提取的cfDNA样本中添加内部对照后进行文库构建，文库构建是为测序片段添加接头的过程。文库构建主要包括以下几个步骤：

1）末端修补及加碱基A。

将cfDNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行。利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cfDNA 5’突出粘末端补平以及3’突出粘末端打平，产生平末端。在进行末端修复的同时在cfDNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的cfDNA片段，用于后续的接头连接。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。反应在PCR扩增仪中进行，20℃-30分钟，65℃-30分钟。反应体系如下表：

表2 DNA末端修补反应液组成

2）加甲基化接头

利用T4连接酶将甲基化接头连接到cfDNA片段两端，用于后续文库扩增。

表3 加接头反应液组成

3）文库转化及纯化

对于已加接头的预文库使用使用Axygen® AxyPrep^TM FragmentSelect-I Kit(Axygen公司)进行磁珠法纯化，纯化后的预文库NEBNext® Enzymatic Methyl-seqConversion Module（NEB公司）试剂盒进行转化，具体转化步骤参见试剂盒操作说明书。

4）DNA文库扩增

将转化后的文库使用Axygen磁珠纯化，然后进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，并在两端加上特异性的识别标签。在PCR扩增仪中进行，反应程序：98℃预变性45秒，98℃变性15秒，65℃退火30秒，72℃ 延伸30秒，共循环6～8次。最后72℃延伸1分钟。反应体系如下表：

表4 文库扩增反应液组成

5）文库纯化。

将扩增的文库DNA片段利用Axygen磁珠纯化出来，用于测序上机。

实施例3

用实施例2中所述方法得到的血浆游离DNA文库，采用Illumina公司Novaseq测序仪进行全基因组甲基化测序，测序完成下机后，使用bcl2fastq生成fastq文件。用FastQC软件对数据进行质量控制，可以观察到使用上述提取及建库方案可以保持血浆样本完整的片段（图2），Trimmomatic软件去除接头和低质量序列，得到的cleanData使用bismark进行基因组（hg19）的比对。比对后得到全基因组每个CpG位点甲基化的reads数和未甲基化的reads数。然后使用甲基化软件Methylkit鉴定差异甲基化区域（differentialmethylation regions，DMRs）。在一个DMR区域内含有一个或多个CpG位点，并将在这个DMR区域内所有CpG位点甲基化reads数之和除以在这个DMR区间内所有CpG位点甲基化与未甲基化总reads数之和，得到DMR的甲基化率。通过以上的测序和数据处理步骤，可以获得每个cfDNA样本中的每个DMR区域的甲基化率。

从健康人和肺癌患者中分别选取30例和42例作为训练集，剩余10例和15例作为验证集，将训练集样本通过对比健康人和肺癌患者的甲基化值，比较肺癌血浆和健康人血浆样本，筛选出有显著性差异的DMRs共633个（图3）。对比健康人与肺癌可以看到显著差异，且在早期肺癌中也观察到明显的差异甲基化信号。

实施例4：

采用广义线性模型机器学习方法（glm）创建分类器，对上述筛选得到的633个DMR的预测能力（判断发生肺癌）进行排序，对训练集执行了10次交叉验证计算，然后按10次交叉验证重要性总名次从前到后对候选DMR进行排名（表5和图4），即：首先将全部的DMR区域按照对分类器贡献程度由高到低排序，再按照这个排名逐个取前n个作为新的输入向量进行预测性能评估。最终筛选出模型预测准确性最高的且使用个数最少的，用于肺癌诊断的29个最优DMRs（表5和图5）。29个最优DMRs的基因组位置及碱基序列分别如表6所示。采用上述29个DMRs作为诊断肺癌cfDNA的甲基化标记物，用H2O方法建立诊断回归模型，对验证集和训练集肺癌血浆和健康人血浆样本进行诊断评分。如图6A和图6B所示，区分肺癌与健康人，训练集结果显示能够稳定达到100%准确，验证集结果显示能够稳定达到99.3%准确。

表5 最佳DMRs个数确定

表6 29个DMRs基因组位置及碱基组成

以上实施例是用于对本发明的说明，并不构成对本发明的限制。

序列表

<110> 南京世和医疗器械有限公司

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tgctggagct gctggtgctg gagcagtttc tgagcgcgct gccagccgac acgcaggcct 60

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gggtga 126

<210> 25

<211> 119

<212> DNA

<213> Human

<400> 25

atatccttat ggccacagag aagctgagac ctggggaagg gctacctcta atgcactccg 60

aggaccccaa gctttagtga gtaagagtgg atcccttata gagtatagta ggtggggtt 119

<210> 26

<211> 119

<212> DNA

<213> Human

<400> 26

accccacgca gatccagcca cacacgcaac cgcctgcaga tacccaccac agccctttaa 60

gttaacccaa agccccgtac aggcgcactg cccctacatg cgcagcccca cggccccac 119

<210> 27

<211> 119

<212> DNA

<213> Human

<400> 27

catatacaca caaccgcaca caggcgcaat cccacccacg cagtacctca cggagtcaca 60

caacccccct ataaacaatc gcacagacac agccccacgc agcgccacat cattcagtc 119

<210> 28

<211> 119

<212> DNA

<213> Human

<400> 28

ttcttcatcc atatgtaggt gcaaataact aataaaacct catgctacca ttttcaaggt 60

tatctgcttt gtaattaaat gatgacgaag ttttggacat caggaaccaa gtaggaatt 119

<210> 29

<211> 119

<212> DNA

<213> Human

<400> 29

ctgcctcctt gatctaccag agaactgatc actaattaac aaagcccagc atcagattct 60

cttcacgctg ccaaagcaca agcaaaaact taaaaattcc ctctgtcatc cacatggga 119

Claims (10)

1.用于检测甲基化标志物的试剂在用于制备对肺癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的甲基化标志物，包括29个甲基化区域，所述的甲基化区域在基因组上的位置如下所示：chr1:16846957-16847076，chr1:147789828-147790115，chr1:202694171-202694290，chr1:209632977-209633096，chr2:88313308-88313427，chr2:174129371-174129490，chr3:23979298-23979417，chr3:24031011-24031130，chr3:140935671-140935790，chr3:171146299-171146418，chr4:29681671-29681790，chr4:111475706-111475825，chr5:2261571-2261690，chr5:96338471-96338590，chr5:153859895-15386001，chr6:113416071-113416190，chr7:27184678-27184797，chr7:112529894-112530013，chr8:49595550-49595669，chr8:52783811-52783930，chr8:101177686-101177805，chr9:32891311-32891430，chr11:70672332-70672451，chr15:59157379-59157505，chr16:55729777-55729896，chr17:17626292-17626411，chr17:17626493-17626612，chr18:58744011-58744130，chr20:37854411-37854530。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断试剂是用血浆游离DNA作为样本。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括如下步骤：

S1：获取肺癌和健康人血浆样本，提取cfDNA，构建文库及酶促转化，获得扩增文库产物并进行甲基化测序；

S2：测序数据对比至参考基因组，获得甲基化标志物的区域上的测序数据结果；

S3：获取每个甲基化标志物的区域上的甲基化率数值；

S4：将各个甲基化标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肺癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肺癌的预测。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S3中，甲基化率是通过在甲基化标志物的区域中的CpG位点上的发生甲基化的reads数除以CpG位点的总reads数计算得到。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的参考基因组是hg19版。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的分类模型是以发生肺癌的概率作为输出值。

7.一种用于对肺癌早筛诊断装置，其特征在于，包括：

测序模块，用于从血浆样本中提取cfDNA并进行甲基化测序，获得权利要求1所述的甲基化标志物的区域上的测序数据结果；

比对模块，用于将测序数据结果比对至参考基因组，获取每个甲基化标志物的区域上的甲基化率数值；

判定模块，用于将各个甲基化标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肺癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肺癌的预测。

8.根据权利要求7所述的用于对肺癌早筛诊断装置，其特征在于，所述的比对模块中，通过在甲基化标志物的区域中的CpG位点上的发生甲基化的reads数除以CpG位点的总reads数计算得到甲基化率。

9.根据权利要求7所述的用于对肺癌早筛诊断装置，其特征在于，提取模块中包含cfDNA提取试剂盒，用于进行cfDNA提取；所述的分类器是H2O算法分类器。

10.一种计算机可读取介质，其记载有可以运行对肺癌进行诊断的计算机程序；所述的计算机程序包括执行以下步骤：

将权利要求1所述的甲基化标志物的区域上的测序数据结果比对至参考基因组，获取每个甲基化标志物的区域上的甲基化率数值；

将各个甲基化标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肺癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肺癌的预测。

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