CN110628898B - Baz1b易感snp位点检测试剂及其制备的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与KFS相关的BAZ1B易感SNP突变位点,并提供一种检测BAZ1B易感SNP位点基因型的试剂。进一步,本发明公开了一种KFS辅助诊断的试剂盒。本发明筛选了KFS相关的易感基因的SNP位点并提供其在KFS诊断中的应用,阐述SNP对于KFS进展的影响,揭示其在诊断、治疗中价值。因此,本发明可开发出利用SNP基因型对KFS的诊断进行检测的试剂盒和生物制剂,不仅能够快速有效的做到早期诊断,其精确度大大提高,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及BAZ1B易感SNP位点检测试剂及其制备的试剂盒。
背景技术
先天性颈椎融合畸形(Klippel-Feil Syndrome,KFS)是一种先天性的颈椎椎体发育畸形,发病率约为1/40000-1/42000,其临床典型特点为:颈部短粗、后发际低、颈部活动受限;但只有不到50%的患者同时具有三项表现。
KFS多合并多种先天性疾病和其他系统畸形,患者的神经压迫症状从神经根病到四肢麻痹、死亡等均可出现,还可造成严重的身心问题,给家庭和社会造成极大负担。
目前,因缺乏早期预测手段,KFS患者多在出现颈椎严重畸形时才被发现,治疗方法仅能通过支具或手术矫形来控制颈椎畸形的进展,但对其他系统畸形病变无法改善。因此,探索早期预测、诊断方法和病因治疗靶点是当前KFS的研究热点。但目前KFS病因未明,近年的研究表明KFS的病因可能与基因突变、环境因素以及发育异常相关,其中尤以基因突变最为密切。基因突变在KFS的发生、发展过程中起着非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的是针对解决上述技术问题,提出一种与KFS疾病相关的基因易感SNP位点及其在制备检测KFS疾病试剂盒和/或试剂中的应用。
本发明的第二目的是提供一种检测BAZ1B易感SNP位点基因型的试剂。
本发明的第三个目的是提供一种KFS辅助诊断的试剂盒。
发明人收集KFS患者血液样本通过全外显子水平寻找基因的致病性突变,并通过小量样本进行基因型验证,进一步证实新突变是有害的,可以作为KFS诊断标志物,为预测疾病发展和指导临床早期干预提供理论依据,早日实现KFS的个体化早期诊断和治疗。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
首先,本发明提供了一种BAZ1B易感SNP位点,所述BAZ1B基因的SNP位点是位于人类第7号染色体第72892427位碱基由G到A的SNP位点突变,所述位点突变具体信息为NM_032408.3:c.1364G>A(p.Arg455Gln)。
进一步地,本发明还提供了一种检测BAZ1B易感SNP位点基因型的试剂,所述试剂包括用于扩增所述SNP位点的引物对,或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶,所述BAZ1B基因的SNP位点是位于人类第7号染色体第72892427位碱基由G到A的SNP位点突变。
优选的,扩增所述SNP位点的引物对具有SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。
优选的,所述引物对扩增的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
更进一步地,本发明提供了检测BAZ1B易感SNP位点基因型的试剂在制备KFS辅助诊断的试剂盒中的应用,所述BAZ1B易感SNP位点是位于人类第7号染色体第72892427位碱基由G到A的SNP位点突变。
优选的,所述试剂盒包括用于扩增所述SNP位点的引物对,或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶。
优选的,所述引物对具有SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。
优选的,所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
有益效果
本发明通过对患者血液DNA进行全外显子测序筛选了BAZ1B基因的易感SNP位点并提供了其在KFS早期诊断中的应用,阐述SNP对于KFS进展的影响,揭示其在早期诊断中的价值。因此,本发明通过检测SNP基因型来诊断KFS是否发生,并进一步开发KFS的诊断试剂盒和生物制剂,能够快速有效的做到早期诊断、为患者争取最好的早期干预时间。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的技术方案具体包括:采集符合标准的血液样本,提取DNA;基因型检测:选择KFS病例、与KFS病例年龄匹配的健康对照,利用外显子测序,找出与KFS相关的SNP;进一步采用基因分型进行检测,验证其应用于临床诊断的可重复性;KFS检测试剂盒的研制:根据KFS病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发KFS早期检测试剂盒。
数据分析中各数值表示如下:
1、ljb23_sift:SIFT分值(version 2.3),表示该变异对蛋白序列的影响,包含三个值,一是SIFT初始分值,二是转换后的值(1-SIFT),三是T或者D。当该变异同时影响多个蛋白序列时,对每条蛋白序列有一个SIFT值,取最小值。SIFT分值越小越“有害”,表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大;D:Deleterious(sift<=0.05);T:tolerated(sift>0.05);
2、ljb23_pp2hvar:利用PolyPhen2基于HumanVar数据库预测该变异对蛋白序列的影响,用于单基因遗传病。该列包含两个值,第一个是PolyPhen2分值,数值越大越“有害”,表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大;第二个是D或P或B(D:Probably damaging(>=0.909),P:possibly damaging(0.447<=pp2_hvar<=0.909);B:benign(pp2_hvar<=0.446));
3、ljb23_pp2hdiv:利用PolyPhen2基于HumanDiv数据库预测该变异对蛋白序列的影响,用于复杂疾病。该列包含两个值,第一个是PolyPhen 2分值,数值越大越“有害”,表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大;第二个是D或P或B(D:Probably damaging(>=0.957),P:possibly damaging(0.453<=pp2_hdiv<=0.956);B:benign(pp2_hdiv<=0.452));
4、ljb23_mt:Mutation Taster分值(version 2.3),表示该变异对蛋白序列的影响,包含三个值,一是Mutation Taster初始分值,二是转换后的值,三是A、D、N或者P。第二个值越大越“有害”,表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大,其中"A"("diseasecausing automatic");"D"("disease causing");"N"("polymorphism");"P"("polymorphism automatic")。
实施例1外周血DNA的提取和纯化
1、样品收集
收集了2016年1月到2019年3月北京协和医院骨科收治的散发KFS患者血液样本,共38例,KFS患者中男20例,女18例,诊断时最大年龄45岁,最小年龄6岁,平均14.7岁。所有KFS患者均经过X线颈椎正侧位,颈部CT或MRI平扫确定诊断,其共同特征是颈椎椎体形成障碍或者分节不良导致的融合畸形。
2、DNA的提取
在上述符合条件的38例KFS患者和15例健康对照,两组年龄均衡可比。
具体步骤为:
(1)向储存于2mL冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液,40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20mL混合后,用TrisHcl溶液定容至2000mL,下同),颠倒混匀后完全转入。
(2)去除红细胞:用溶血试剂将5mL离心管补至4mL,颠倒混匀,4000rpm离心10分钟,弃上清。向沉淀中加入4mL溶血试剂,再次颠倒混匀清洗一次,4000rpm离心10分钟,弃上清。
(3)抽提DNA:向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有122.5mL0.2M氯化钠,14.4mL0.5M乙二胺四乙酸,15mL10%十二烷基硫酸钠,148.1mL双蒸水,下同)和8μL蛋白酶K,振荡器上充分振荡混匀,37℃水浴过夜。
(4)去除蛋白质:加1mL饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5mL离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇=24:1,v/v,下同),充分混匀后(手摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清(分入两个1.5mL的离心管)。
(5)DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸钠60μL,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇,上下轻摇,可见白色絮状沉淀物,再以12000rpm离心10min。
(6)DNA洗涤:在沉淀中加入冰无水乙醇1mL,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
(7)测量浓度:通常能得到20-50ng/μLDNA,纯度(紫外2600D:2800D)在1.8-2.0。
实施例2全外显子测序
将实施例1中两组人群经全外显子芯片检测获得相关结果。
1、文库构建
北京诺禾致源科技股份有限公司采用Agilent的液相芯片捕获系统,对人的全外显子区域DNA进行高效富集,然后在Illumina Hiseq平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human All ExonV5试剂盒,严格使用说明书推荐的试剂和耗材,并参照最新的经过优化的实验流程进行操作。
实验基本流程:将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180-280bp的片段,经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库pooling后与多达543,872个生物素标记的探针进行液相杂交,再使用带链霉素的磁珠将20,965个基因的334,378个外显子捕获下来,经PCR线性扩增后进行文库质检,合格即可进行上机测序。
2、库检
文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/μL,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM),以保证文库质量。
3、上机测序
库检合格,根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina Hiseq平台测序。
4、数据分析与处理
经过数据筛选、深度加工和生物信息学序列比对,最终确定“KFS病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的13个SNP位点为优选敏感级位点。
其中,位于BAZ1B基因的SNP突变:
人类第7号染色体第72892427位碱基由G到A的SNP位点突变,所述位点突变具体信息为NM_032408.3:c.1364G>A(p.Arg455Gln)。
所述位点变异对蛋白影响值如表1所示:
表1 BAZ1B基因SNP突变位点变异对蛋白影响值
SNP突变 | ljb23_sift | ljb23_pp2hvar | ljb23_pp2hdiv | ljb23_mt |
c.1364G>A | 0.09,T | 0.084,B | 0.93,P | 0.779,N |
所述位点经过生物信息学分析,BAZ1B基因SNP突变位点变异可能是有害的,可以确认为KFS候选标志物。
实施例3利用危险度评分方法进一步分析SNP与KFS的发病风险
本发明人通过对2组样品(“KFS病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较,选择阳性关联的SNP,以全外显子扫描样本中单个SNP回归系数为权重,进一步求得危险分值,绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性,进而诊断这些SNP对KFS发病的判断能力。对所有SNP标志物的分析发现,位于BAZ1B基因的SNP突变,其灵敏度和特异度都达到65%以上。
因此,本发明人证明了所述位点标志物能够很好地将健康对照和KFS患者区分。
实施例4单个SNP的基因分型
1、取6例KFS患者和6例健康对照DNA样本同实施例1;
2、PCR扩增
利用NCBI网站提供的在线引物设计软件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHo meAd分别对BAZ1B基因的SNP设计特异性扩增引物如表2所示。
表2引物序列
PCR反应体系如表3所示。PCR扩增程序为:95℃预变性10min,94℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸30s,进行30个循环,最后72℃延伸30min,于4℃保存,过夜需放置-20℃冷冻。
表3反应体系
组分 | 加入量 |
2×mix | 25μL |
上游引物(10uM) | 3.0μL |
下游引物(10uM) | 3.0μL |
模板 | 5μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至50μL |
3、测序
PCR扩增结束后,取5μL扩增产物,1%琼脂糖凝胶电泳,电泳30min,染色20min,然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察,根据比对Marker的片段大小情况,初步判断扩增片段是否正确。进而对符合要求的扩增产物进行纯化:采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit试剂盒,并按试剂盒要求进行操作。上样测序:采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒,并按试剂盒要求进行操作;用ABI公司3730型测序仪进行测序。
4、结果分析
通过Chromas序列分析软件,将测序结果与标准序列进行比对,寻找SNP位点,通过分析SNP位点处碱基的类型,就可以得到SNP位点的基因型。BAZ1B基因结果显示:6例KFS患者测序得到107bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其在第39位碱基为GA、AA;而6例健康对照测序得到107bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,其在第39位碱基为GG;证实了该位点为GA、AA基因型时判断为KFS的易感基因型,该位点为GG基因型时判断为KFS的非易感基因型。从而进一步确认所述BAZ1B:NM_032408.3:c.1364G>A(p.Arg455Gln)的SNP位点可用于KFS的检测、治疗、诊断等辅助诊断。
实施例5用于KFS辅助诊断SNP试剂盒的制作
基于实施例4得到的引物组,组装本发明所述的用于KFS的试剂盒,所述试剂盒包括用于扩增所述SNP位点的特异性引物,所述试剂盒还可以有相应PCR技术所需的常用试剂,如:dNTPs,MgCl2,双蒸水,Taq酶等,这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的,另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品,通过最精简和特异的引物对检测SNP,再通过SNP谱辅助判断KFS,不仅稳定,检测方便,且精确,大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,因此将此试剂盒投入实践,可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> P190313
<130> BAZ1B 易感SNP 位点检测试剂及其制备的试剂盒
<141> 2019-10-23
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggcacgca gaagatgaca cgagccccac ggaattctag gggtacacct aggacctcta 60
gtaaacctca taaacatctg cctcctgcag ccctacacct cattgca 107
<210> 2
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggcacgca gaagatgaca cgagccccac ggaattctgg gggtacacct aggacctcta 60
gtaaacctca taaacatctg cctcctgcag ccctacacct cattgca 107
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggcacgca gaagatgaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcaatgagg tgtagggctg 20
Claims (3)
1.检测BAZ1B易感SNP位点基因型的引物对在制备先天性颈椎融合畸形辅助诊断的试剂盒中的应用,其特征在于,所述BAZ1B易感SNP位点是位于人类第7号染色体第72892427位碱基由G到A的突变,所述SNP位点突变具体信息为NM_032408.3:c.1364G>A。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述引物对具有SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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