CN109750098B

CN109750098B - Atp7b基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN109750098B
Application number: CN201910085111.XA
Authority: CN
Inventors: 周冬虎; 黄坚; 贾思雨; 李潇瑾
Original assignee: Beijing Friendship Hospital
Current assignee: Beijing Friendship Hospital
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN109750098A

Abstract

本发明公开一种ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法，涉及生物检测鉴定领域。所述试剂盒包括分别针对ATP7B的5'UTR及21个外显子进行MLPA基因大片段缺失检测用的探针对及通用引物对；此外本发明还提供利用如上所述的探针对及通用引物对进行MLPA基因大片段缺失检测的检测方法。本发明提供的试剂盒及检测方法简单，成本低廉，可用于快速检测ATP7B基因大片段缺失突变。

Description

ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定领域。更具体地，涉及一种ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration，HLD)，即Wilson disease(WD)，是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病，ATP7B基因突变所致的铜离子大量沉积是其重要的致病因素，因此早期诊断和驱铜治疗对于患者的预后具有重要意义。目前，基于Sanger测序的ATP7B基因突变检测已成为肝豆状核变性分子诊断的重要参考指标。现有技术中针对ATP7B基因上的突变绝大多数仍采用一代测序的经典方法，该方法虽能够提供精确的检测结果，但无法检测ATP7B基因上可能存在的大片段缺失突变。

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA)为一种可对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测多达数十个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。其基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析并得出结论。

目前，利用MLPA技术检测ATP7B基因大片段缺失在国内并未得到广泛的应用，多数研究仅关注发生于外显子中的点突变，忽略了可能存在的大片段缺失突变；而少数利用MLPA技术的研究则均使用了国外商品化的检测试剂盒(SALSA

P098 kits,MRC-Holland)，但该试剂盒需配套专用的分析软件，且由于采用荧光标记等造成售价较高，且进口耗时长，因此限制了其在临床的广泛应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，该试剂盒的使用方法简单，成本低廉，可用于快速检测ATP7B基因大片段缺失突变。

本发明的另一个目的在于提供一种ATP7B基因大片段缺失的检测方法。

为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：

一种ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括分别针对ATP7B的5'UTR及21个外显子进行MLPA基因大片段缺失检测用的探针对及通用引物对；

其中，序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：48所示为分别针对ATP7B的5'UTR及21个外显子进行检测的探针对；序列SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：50所示为通用引物对。

此外，优选的方案是，每一组探针对均包括左探针和右探针，所述右探针的5'端进行磷酸化基团修饰。

此外，优选的方案是，所述左探针的5'端包括上游通用引物结合序列，所述右探针的3'端包括下游通用引物结合序列；所述通用引物对的两条引物分别靶向上游通用引物结合序列和下游通用引物结合序列。

此外，优选的方案是，所述试剂盒进一步包括完成MLPA基因大片段缺失检测所需的试剂和酶。

此外，优选的方案是，所述酶包括耐热高保真DNA连接酶。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

本发明还提供一种ATP7B基因大片段缺失的检测方法，所述检测方法利用如上所述的探针对及通用引物对进行MLPA基因大片段缺失检测。

本发明的有益效果如下：

本发明设计并研发了一种用于检测包括启动子区在内的ATP7B基因5'UTR区及全部21个外显子大片段缺失的多重连接探针扩增(MLPA)法检测探针及试剂盒。每个检测靶点设计一对MLPA探针，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列，在适宜条件下使用连接酶连接两部分探针。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，通过毛细管电泳分离扩增产物，根据扩增峰的改变即可判断靶序列是否存在大片段的缺失。

该试剂盒可填补目前基于一代测序的ATP7B基因突变检测方法的疏漏，有利于临床对疑似肝豆状核变性患者的精确诊断；而且，相比于国外同类试剂盒(SALSA

P098kits,MRC-Holland)，本发明将探针的填充序列分别包含于左、右探针中，从而可利用化学合成法制作探针，快速获得高纯度的探针溶液，且保证了探针磷酸化修饰的效率；选用商业化的耐热高保真DNA连接酶，避免了从MRC-Holland公司购买专用SALSA Ligase-65连接酶的不便，且成本大为降低；此外，本发明采用非荧光标记的引物，利用普通的毛细管电泳仪即可检测结果，降低了使用门槛及成本，因此提供了一种快速、简便、准确的检测方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明实施例2和实施例3中反应1的检测结果对照图。

图2示出本发明实施例2和实施例3中反应2的检测结果对照图。

图3示出本发明实施例2和实施例3中反应3的检测结果对照图。

图4示出本发明实施例2和实施例3中反应4的检测结果对照图。

具体实施方式

现有技术中，ATP7B基因的突变绝大多数仍采用一代测序的方法，该方法虽能够提供精确的检测结果，但无法检测ATP7B基因上可能存在的大片段缺失突变；少数利用MLPA技术的研究则均使用了国外商品化的检测试剂盒(SALSA

P098 kits,MRC-Holland)，但该试剂盒需配套专用的分析软件，且由于采用荧光标记等造成售价较高，进口耗时长，因此限制了其在临床的广泛应用。

本发明首先提供一种ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括分别针对ATP7B的5'UTR及21个外显子进行MLPA基因大片段缺失检测用的探针对及通用引物对；

其中，序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：48所示为分别针对ATP7B的5'UTR及21个外显子进行检测的探针对，其中，1号外显子和21号外显子各包括两对探针对；序列SEQ IDNO：49至SEQ ID NO：50所示为通用引物对。

本发明针对ATP7B基因5'UTR及21个外显子设计相关探针，每个位点包括一对探针，即左探针与右探针。左探针依次(5'-3')包括一段上游通用引物结合序列、长度不等的填充序列及靶点特异性序列；右探针依次(5'-3')包括一段靶点特异性序列、长度不等的填充序列及下游通用引物结合序列。探针均由化学合成制备，右探针在合成时于5'端进行磷酸化基团修饰，以便与左探针的3'端游离羟基完成连接反应。填充序列的作用是使扩增时产生不同长度的PCR产物，便于区分观察。

此外，优选的方案是，所述试剂盒进一步包括完成MLPA基因大片段缺失检测所需的试剂和酶，例如DEPC水、酶的缓冲溶液、耐热高保真DNA连接酶等，此处的耐热高保真DNA连接酶可以使用普通商业化的耐热DNA连接酶。本领域技术人员也可以在试剂盒中添加其它检测试剂盒所需的材料。

具体地，该方法可以包括以下步骤：

(1)化学合成本发明提供的探针，用DEPC水重悬为浓度100μM的溶液，在-20℃保存，探针溶液的工作浓度为5μM。

(2)化学合成通用引物对，分别靶向左探针的上游通用引物结合序列及右探针的下游通用引物结合序列，合成后用DEPC水重悬为浓度为100μM的溶液在-20℃保存，通用引物溶液的工作浓度为20μM。

(3)样品DNA提取

获取外周血DNA,利用血液基因组DNA提取试剂盒(例如天根生化科技编号DP348产品)，按照试剂盒说明书操作，提取基因组DNA。检测DNA的浓度及纯度，调整DNA浓度至20ng/μl。

(4)基因组DNA变性

每个检测样品分4管反应进行检测(每管检测6个位点)。每管反应取5μl DNA样品(100ng)于PCR仪上95℃孵育5分钟，迅速冷却至室温(25℃)，使基因组DNA变性为单链。

(5)探针与基因组DNA的杂交

于每个反应中加入1.5μl Taq高保真DNA连接酶(例如使用NEB公司货号为M0647S的产品)Buffer、6μl探针混合溶液(每种探针0.5μl)及2.5μl DEPC水，此时反应总体积为15μl。吹打混匀后于PCR仪内95℃孵育1分钟，并在60℃时孵育过夜(12-16h)。

(6)探针的连接反应

将反应在PCR仪中保持54℃孵育，于每个反应中加入1μl Taq高保真DNA连接酶，0.5μl Taq高保真DNA连接酶Buffer及3.5μl DEPC水，此时反应总体积为20μl。轻柔吹打混匀后于54℃孵育30分钟，98℃孵育5分钟以灭活Taq高保真DNA连接酶，并于4℃保存。

(7)PCR扩增反应

每个反应取2μl反应产物，加入10μl多重PCR mix(例如使用康为世纪公司的货号CW2648产品)、0.5μl的正向引物(20μM)、0.5μl的反向引物(20μM)及7μl DEPC水，配制成总体积为20μl的PCR反应体系。设置反应条件为95℃预变性2分钟；98℃变性20秒，65℃退火延伸90秒，共40个循环；72℃终末延伸5分钟；反应结束后于4℃孵育保存。

(8)扩增产物毛细管电泳检测

取PCR产物于Qsep100全自动核酸分析系统中进行检测，采用高分辨率进样夹(S1卡夹)，进样电压4KV，进样时间10秒，电泳电压6KV，同时加入20bp和1000bp的DNA marker。产物浓度由配套软件转换为电信号后给出峰图，导出后保存。

以上实验步骤中的具体参数，本领域技术人员在实际操作过程中可以进行适当的调整，本发明对此不做进一步限制。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例l

探针和引物设计

本发明针对ATP7B基因5'UTR启动子区域及21个外显子设计相关探针，每个位点包括一对探针，(左探针与右探针)。左探针依次(5'-3')包括一段上游通用引物结合序列、长度不等的填充序列及靶点特异性序列；右探针依次(5'-3')包括一段靶点特异性序列、长度不等的填充序列及下游通用引物结合序列。探针序列如表1所示。

表1 ATP7B基因大片段缺失检测探针序列

左右探针均由化学合成制备，右探针在合成时于5'端进行磷酸化基团修饰，以便与左探针的3'端游离羟基完成连接反应。合成的探针用DEPC水重悬为浓度为100μM的溶液在-20℃保存，工作浓度为5μM。

合成通用引物，分别靶向左探针的上游通用引物结合序列及右探针的下游通用引物结合序列，引物序列如下：

Fw:5'-ATTATGCTGAGTGATATCCCTCTG-3'(如SEQ ID NO：49所示)；

Rv:5'-GATCTTCCGTGTCAGCTCCG-3'(如SEQ ID NO：50所示)。

合成后用DEPC水重悬为浓度为100μM的溶液在-20℃保存，工作浓度为20μM。

实施例2

健康人样本ATP7B基因大片段缺失突变检测

(1)样品DNA提取

获取外周血DNA,利用血液基因组DNA提取试剂盒(例如天根生化科技编号DP348产品),按照试剂盒说明书操作，提取基因组DNA。检测DNA的浓度及纯度，调整DNA浓度至20ng/μl。

(2)基因组DNA变性

每个检测样品分4管反应进行检测，每管检测6个位点。每管反应取5μl DNA样品(100ng)于PCR仪上95℃孵育5分钟，迅速冷却至室温(25℃)，使基因组DNA变性为单链。

(3)探针与基因组DNA的杂交

于每个反应中加入1.5μl Taq高保真DNA连接酶(例如使用NEB公司货号为M0647S的产品)Buffer、6μl探针混合溶液(每种探针0.5μl，5μM)及2.5μl DEPC水，此时反应总体积为15μl。吹打混匀后于PCR仪内95℃孵育1分钟，并在60℃时孵育过夜(12-16h)。反应体系如下表2所示。

表2探针与基因组DNA杂交反应体系

其中，4组反应所用的4组探针混合溶液分别为：

反应1探针溶液[1]：探针混合溶液包括靶向1号外显子3'端、5号外显子、9号外显子、1号外显子5'端、3号外显子及16号外显子的左右探针溶液(5μM)各0.5μl；

反应2探针溶液[2]：探针混合溶液包括靶向8号外显子、19号外显子、13号外显子、6号外显子、21号外显子5'端及14号外显子的左右探针溶液(5μM)各0.5μl；

反应3探针溶液[3]：探针混合溶液包括靶向5'UTR区、15号外显子、17号外显子、11号外显子、21号外显子3'端及12号外显子的左右探针溶液(5μM)各0.5μl；

反应4探针溶液[4]：探针混合溶液包括靶向20号外显子、18号外显子、4号外显子、2号外显子、10号外显子及7号外显子的左右探针溶液(5μM)各0.5μl。

反应条件如下表3所示：

表3探针与基因组DNA杂交反应条件

(4)探针的连接反应

将反应在PCR仪中保持54℃孵育，于每个反应中加入1μl Taq高保真DNA连接酶，0.5μl Taq高保真DNA连接酶Buffer及3.5μl DEPC水，此时反应总体积为20μl。轻柔吹打混匀后于54℃孵育30分钟，98℃孵育5分钟以灭活Taq高保真DNA连接酶，并于4℃保存。反应体系如下表所示。

表4探针的连接反应体系

反应条件如下表5所示。

表5探针的连接反应条件

(5)PCR扩增反应

每个反应取2μl反应产物，加入10μl PCR mix(例如使用康为世纪公司的货号CW2648产品)、0.5μl的正向引物(20μM)、0.5μl的反向引物(20μM)及7μl DEPC水，配制成总体积为20μl的PCR反应体系。设置反应条件为95℃预变性2分钟；98℃变性20秒，65℃退火延伸90秒，共40个循环；72℃终末延伸5分钟；反应结束后于4℃孵育保存。PCR反应体系如下表6所示。

表6 PCR扩增反应体系

PCR反应条件如下表7所示。

表7 PCR扩增反应条件

(6)扩增产物毛细管电泳检测

取PCR产物于Qsep100全自动核酸分析系统中进行检测，采用高分辨率进样夹(S1卡夹)，进样电压4KV，进样时间10秒，电泳电压6KV，同时加入20bp和1000bp的DNA marker。产物长度介于101-154bp之间，产物浓度由配套软件转换为电信号后给出峰图，导出后保存。

实施例3

肝豆状核变性患者ATP7B基因大片段缺失突变检测

步骤(1)-(5)同实施例2。

(6)扩增产物毛细管电泳检测

取PCR产物于Qsep100全自动核酸分析系统中进行检测，采用高分辨率进样夹(S1卡夹)，进样电压4KV，进样时间10秒，电泳电压6KV，同时加入20bp和1000bp的DNA marker。产物浓度由配套软件转换为电信号后给出峰图，读取峰图纵坐标RFU值，与实施例2中健康对照的RFU值进行比较，若RFU值为对照组的50％或无数值，则可判断患者ATP7B基因相应位点存在杂合或纯合缺失。健康对照组与肝豆状核变性患者的检测对照结果如说明书附图1-图4所示。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京友谊医院

<120> ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法

<130> JLC19I0050E

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attatgctga gtgatatccc tctgtgtcct cctccgcggt ctcggccacc tcg 53

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctggtgcg ctccgacact gtactgggat ctcaccggag ctgacacgga agatc 55

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attatgctga gtgatatccc tctggctctc ctccaccgac caggtgacct tttgctct 58

<210> 4

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccagatc agagaagaat tcggtgtccg tgcgggtggt ggaattctgc cggagctgac 60

acggaagatc 70

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attatgctga gtgatatccc tctgcagatc acagccagag aaggggccag tc 52

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaaagtgag ttttgttccc ccgcgtccgc ggagctgaca cggaagatc 49

<210> 7

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

attatgctga gtgatatccc tctggtccag tgtggggcat gacttgccag tcatgtgtga 60

a 61

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtccattgag gacaggattt ccaatttgaa aggcatcatc agcgtggaat tctgccggag 60

ctgacacgga agatc 75

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attatgctga gtgatatccc tctgccagtg tggtgcagaa gtgcttctta cagatcaaag 60

gcat 64

<210> 10

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacctgtgca tcctgtgtgt ctaacataga aaggaatctg cagggaattc tgccggagct 60

gacacggaag atc 73

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attatgctga gtgatatccc tctggttctc tccgtgttgg ttgccttgat 50

<210> 12

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcaggaaag gcagagatca agtatgaccc agaggtcatc cgtggtggaa ttctgccgga 60

gctgacacgg aagatc 76

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attatgctga gtgatatccc tctgcgcgtc ctgtgtccac aacataga 48

<210> 14

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtccaaactc acgaggacaa atggcatcac ttatgcctcc ccggagctga cacggaagat 60

c 61

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

attatgctga gtgatatccc tctgcaagga aattggcttt catgcttccc tggccca 57

<210> 16

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagaaacccc aacgctcatc acttggacca caagatgcag tgtggtggaa ttctgccgga 60

gctgacacgg aagatc 76

<210> 17

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

attatgctga gtgatatccc tctgatccac tagtccagtg ctttccaggt ggaagaagtc 60

tttcctgtgc agcct 75

<210> 18

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggtgtttggc atccctgtca tggccttaat gatctatatg ctggtggtgg aattctgccg 60

gagctgacac ggaagatc 78

<210> 19

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

attatgctga gtgatatccc tctgtgttta ttctctggtc atcctggtgg ttgct 55

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtggctgaga aggcggagag gagccctgtg acggagctga cacggaagat c 51

<210> 21

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

attatgctga gtgatatccc tctggagcaa aacctcagaa gccctggcta aactca 56

<210> 22

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgtctctcca agccacagaa gccaccgttg tgaccattct gccggagctg acacggaaga 60

tc 62

<210> 23

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

attatgctga gtgatatccc tctgcactag tccagtgtgc gatatcgtca aggtggtccc 60

tgggggaaag tt 72

<210> 24

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tccagtggat gggaaagtcc tggaaggcaa taccatggct gtggaattct gccggagctg 60

acacggaaga tc 72

<210> 25

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

attatgctga gtgatatccc tctgctagtc cagtcattaa agctacccac gtgggcaatg 60

aca 63

<210> 26

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccactttggc tcagattgtg aaactggtgg aagaggctca gtggtggaat tctgccggag 60

ctgacacgga agatc 75

<210> 27

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

attatgctga gtgatatccc tctgccacta gtccaggaca tgatgatgat aaatgggaca 60

aaatatccac taaac 75

<210> 28

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cggtcagcca gctgctgaat gggtgcctat gaaaataaaa cactgtggtg gaattctgcc 60

ggagctgaca cggaagatc 79

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

attatgctga gtgatatccc tctggctttc cagacgtcca tcacggtgct 50

<210> 30

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtgcattgcc tgcccctgct ccctggggct ggtccagtgt ggtggaattc tgccggagct 60

gacacggaag atc 73

<210> 31

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

attatgctga gtgatatccc tctgggatcc actagtccat ccgcagtccc caccacagcc 60

agaaccttcc tga 73

<210> 32

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggggcagtgt ggccacatcc cccagcagga gcacccgcat ggtgtggtgg aattctgccg 60

gagctgacac ggaagatc 78

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

attatgctga gtgatatccc tctgtgagcg ccctttgagt gcaccggcca 50

<210> 34

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtcacctgaa tgaggctggc agccttcccg cagaaaagga attctgccgg agctgacacg 60

gaagatc 67

<210> 35

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

attatgctga gtgatatccc tctgcactag tccagtgtgc tgtcctttca tctcgtggtc 60

tgtcatagcg tc 72

<210> 36

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

actgacatcg ctagaaatgg ttaaaccgtt gcgcctcagc cgtggaattc tgccggagct 60

gacacggaag atc 73

<210> 37

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

attatgctga gtgatatccc tctggccaga gctattgcca cccaggtaca gccct 55

<210> 38

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ttaatgttgc aaactgtgta aagctcataa aagcagtgtg gtggaattct gccggagctg 60

acacggaaga tc 72

<210> 39

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

attatgctga gtgatatccc tctgtgcctt ccttttgtct taggttggca tcaa 54

<210> 40

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

caaagtcttt gcagaggtgc tgccttcgca caaggattct gccggagctg acacggaaga 60

tc 62

<210> 41

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

attatgctga gtgatatccc tctgtgattt gctggatgtg gtggctagca ttcacc 56

<210> 42

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tttccaagag gactgtccga aggatacgcg gaattctgcc ggagctgaca cggaagatc 59

<210> 43

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

attatgctga gtgatatccc tctgcctctg tgtctgtggt gctctcatcc ct 52

<210> 44

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gcagctcaag tggtgagtcc cctcaggtgg agcatcggag ctgacacgga agatc 55

<210> 45

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

attatgctga gtgatatccc tctgactagt ccagcagcta taagaagcct gacctggaga 60

ggtatga 67

<210> 46

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ggcacaggcg catggccaca tgaagcccct gacggcatcc tgtggtggaa ttctgccgga 60

gctgacacgg aagatc 76

<210> 47

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

attatgctga gtgatatccc tctgccacta gtccccttga atagaagttt tcctgataag 60

aataaacgag gaa 73

<210> 48

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

aaggtccttg cctcctggaa gaacaaatct accagagtgt ggtggaattc tgccggagct 60

gacacggaag atc 73

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

attatgctga gtgatatccc tctg 24

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gatcttccgt gtcagctccg 20

Claims

1.一种ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分别针对ATP7B的5'UTR及21个外显子进行MLPA基因大片段缺失检测用的探针对及通用引物对；

2.根据权利要求1所述的ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，其特征在于，针对每个检测位点的每一组探针对均包括左探针和右探针，所述左探针的5' 端包括上游通用引物结合序列，所述右探针的3' 端包括下游通用引物结合序列，所述右探针的5' 端进行磷酸化基团修饰；所述通用引物对的两条引物分别靶向上游通用引物结合序列和下游通用引物结合序列。

3.根据权利要求1所述的ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括完成MLPA基因大片段缺失检测所需的试剂。

4.根据权利要求3所述的ATP7B基因大片段缺失检测试剂盒，其特征在于，完成MLPA基因大片段缺失检测所需的试剂包括耐热高保真DNA连接酶。