CN112553318B - 基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明目的是针对现有缺失型α‑地中海贫血检测方法和检测位点的缺陷，提供一种基于Taqman探针的多重多色实时荧光PCR方法和检测试剂盒。本发明的方法可以检测缺失型α‑地贫(如中国常见的‑‑SEA、‑α3.7、‑α4.2和—THAI缺失)，通过检测基因型确定位点判断待检者α‑地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型，有利于临床遗传咨询。同时本发明的方法能有效的扩增高GC含量的长片段，结合优化的反应程序和反应体系，提供了一种适用于Taqman探针的实时荧光PCR检测方法和扩增体系。本发明的方法具有简单方便、不易污染，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性等特点，可以极大的缩短临床地中海贫血筛查与诊断的时间，提高临床效率。

Description

基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测方法，特别是涉及一种多重多色实时荧光PCR法同时检测缺失型α地中海贫血的试剂盒。
背景技术
地中海贫血简称地贫，又称海洋性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血，是由于珠蛋白基因发生缺陷，导致珠蛋白肽链的一种或几种不能合成或合成减少、链结构正常但比例失衡的遗传性溶血性血红蛋白病。
地中海贫血是全世界最常见的遗传病之一，主要分布于地中海地区、中东、印度、东南亚和非洲，地中海贫血也是中国南方地区最常见、危害最大的遗传病之一。按受累珠蛋白肽链对地中海贫血进行分类，可分为α-地中海贫血、β-地中海贫血、δ-地中海贫血等，其中最常见的是α-地中海贫血和β-地中海贫血，简称α-地贫和β-地贫。流行病学资料显示，α和β地贫的人群携带率,广西分别为17.6％和6.4％、广东分别为8.53％和2.54％、湖南分别为6.27％和2.13％。
α珠蛋白基因簇定位于16p13.3，每条染色体包含2个α基因，每对染色体共有4个α基因，因此正常人有4个α珠蛋白基因(αα/αα)。α-地贫最常见的原因是染色体中缺失一个(-α)或两个(--)α珠蛋白基因，也有少部分α-地贫由基因突变(αTα或ααT)导致，称为非缺失型α-地贫。我国常见的α-地贫基因变异包括-α3.7、-α4.2、--SEA、--THAI这4种缺失，以及HbQs、HbCs、HbWs这3种点突变。
随着血红蛋白病的深入研究，其基因突变谱不断更新，最近更新的人类异常血红蛋白和地中海贫血数据库(http://globin.bx.psu.edu/)显示：全世界共发现1816种珠蛋白基因变异，其中α珠蛋白变异893种，β珠蛋白变异933种。中国人群已明确的α-珠蛋白基因簇变异达117种，涉及基因缺失及重复达41种、点突变76种(包括25种无临床表型的异常血红蛋白)；β-珠蛋白基因簇变异已明确基因型约147种，以点突变最常见，占新发变异的72.7％，其它包括β-珠蛋白基因簇大片段缺失及重复约18种。血红蛋白病的临床表型由潜在的基因型决定，临床表型可能从沉默的携带者状态到轻度、中度或重度贫血不等，因此通过血红蛋白病筛查及基因诊断鉴定本地区基因突变谱，建立表型与基因型的相关性，并进行产前诊断或植入前胚胎诊断是预防重度地中海贫血的主要手段。通过群体筛查寻找携带者，并对携带同型基因的夫妇进行产前诊断有效阻断重型患儿的出生是目前主要的干预方式，同时也为携带者的遗传咨询提供必要的实验室依据。
地中海贫血是全球分布最广的一种单基因隐性遗传病，全世界地中海贫血基因携带者近2亿。地中海贫血目前尚无法治愈，输血和骨髓移植可改善患者生活质量，但给患者和家庭带来了沉重的经济负担和心理压力。目前我国在婚孕前、产前阶段筛查已全面开展，中重型地贫患儿出生率已有下降，但每年仍有大量地贫携带者出生。同时，我国南方部分地贫高发地区已经开展了新生儿地中海贫血筛查，主要采用血常规、血红蛋白电泳进行初筛，通过地中海贫血基因分析确诊。准确、高效的地中海贫血基因检测，不仅有利于临床地贫的诊疗，还能够引导患者及时进行产前诊断与遗传咨询，以避免重型地贫患儿的出生，对减缓家庭和社会压力以及实现优生优育具有重要的意义。
目前常用的缺失型α-地中海贫血基因检测技术有：PCR、MLPA、基因芯片、高通量测序等。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是检测缺失型地贫最常用的方法。多种以PCR为基础的分子检测技术可用于珠蛋白基因突变的检测，包括跨断裂位点-聚合酶链式反应(gap polymerase chain reaction，Gap-PCR)、反向斑点杂交技术(reverse dot blotting，RBD)、定量PCR(Quantitative real time polymerase chainreaction，qPCR)等。目前，Gap-PCR和RBD技术在临床实验室已得到广泛应用，优点是准确度较高，检测成本相对较低。但也存在一些缺点，例如实验过程易产生扩增产物污染，操作繁琐，自动化程度低等，无法检测未知突变类型。
多重连接探针扩增技术(mμltiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA)是一种探针依赖扩增技术，单管即可检测多达50个位点的拷贝数变异，主要应用于缺失型α-地贫的筛查。基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术，具有以下优点：1、高效：一次反应可以检测多个靶序列拷贝数的改变；2、特异：可以检测点突变；3、快速简便：一次实验可以在24小时内完成，不同的试剂盒操作基本相同，容易掌握。局限性：1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染；2、不能用于单个细胞的检测；3、MLPA用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型；4、不能检测染色体的平衡易位。
基因芯片技术的原理是将大量的寡核苷酸片段或DNA片段有序排列在固相载体上，称之为基因芯片或DNA阵列，同时提取待测样品DNA，与芯片杂交，然后扫描芯片的荧光强度，应用生物信息学方法分析结果，得到样品中基因序列和表达水平的相关信息。优点是相对于PCR技术来说，基因芯片技术通量更高，可以在一次实验中同时检测几百至几万个位点，并且标准化和自动化程度高，实验稳定，质控方便。缺点是基因芯片仍受限于探针设计，只能检测已知变异种类，且价格与高通量测序相比并不具有显著优势，这限制了其大规模推广应用。
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称为下一代测序(NextGeneration Sequencing,NGS)，可以在一次实验中对目标DNA进行全面分析，包括单碱基变异、短插入缺失、拷贝数变异和结构变异。目前，NGS测序成本已降至可承受范围之内，并且计算机处理能力与日俱增，该技术已在遗传病筛查领域得到较为广泛的应用。优点是可以一次检测基因组范围内点突变、插入缺失、拷贝数变异等各种类型突变，也可检测未知突变；缺点是操作复杂、需配套的仪器与试剂，对操作者的要求高，流程长、成本高。
国内已获批地贫检测试剂盒(基于DNA的检测)、检测方法与位点如下表：
Figure GDA0004191184190000031
Figure GDA0004191184190000041
从上表可以看出，检测4种缺失型α-地中海贫血基因(-α3.7、-α4.2、--SEA、--THAI)的试剂盒，采用的方法均是Gap-PCR法，这种方法是扩增后，进行凝胶电泳检测，很容易因扩增产物污染而导致假阳性，且电泳过程中，需要的染料具有一定毒性，也限制了电泳方法在临床检测中的应用。
导致缺失型α-地中海贫血的基因缺失是大片段缺失，其中-α3.7和-α4.2和两种缺失没有明确的断点，即断裂位点是不固定的，因此一般的实时荧光PCR的设计不能直接应用到长片段、无固定断裂位点的缺失基因的检测。有的试剂盒是通过比较等位基因拷贝数的变化来解决这个问题，如目前获批的缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒中，只有中山大学达安基因股份有限公司有一个产品是基于实时荧光PCR方法，但其试剂盒是利用实时荧光PCR技术，采用2-ΔΔCt值相对定量方式，同时分析ζ、α1、α2基因相对拷贝数，得知目的基因的缺失数目(内标基因拷贝数不变)，从而实现缺失型α-地中海贫血基因快速检测。该方法不是通过扩增曲线直接判断检测结果，而需要通过复杂的计算才能得到检测结果；同时对仪器和试剂精密度要求较高，容易导致假阴性。
上述的α-地中海贫血的分子诊断各种方法,准确性均较高,但包含的电泳检测步骤可引起扩增产物污染而导致假阳性结果；同时操作繁琐、费时费力、检测通量小、使用试剂或者仪器昂贵等缺陷；另外，大部分已获批的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒只检测3种缺失型(--SEA、-α3.7和-α4.2)，而随着临床研究的深入，发现中国人群中，也有一定比例的--THAI缺失型分布，因此，为了减少漏诊，有必要检测--THAI缺失型。
上述的α-地中海贫血的各种分子诊断方法和获批试剂盒,还没有一种是基于Taqman探针的实时荧光PCR检测方法，该方法根据扩增曲线即可实时判断待检样本的基因型。扩增完成后，没有电泳、融解曲线分析和杂交等检测步骤，极大的优化了检测和判断流程，缩短了检测时间，提高了检测通量，同时也极大的降低了使用者的操作难度，方便临床使用。
有鉴于此，本发明人针对现有技术中的上述缺陷进行深入研究，遂有本案产生。
发明内容
为解决上述技术问题，我们提出了一种基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测方法，针对现有缺失型α-地中海贫血基因检测方法存在的缺陷，可以实现单管单次闭管反应完成缺失型α-地中海贫血等位基因的检测，具有简便、快捷，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒，包括用于缺失型α-地中海贫血基因扩增的引物组合和用于缺失型α-地中海贫血基因检测的引物和探针组合，所述用于缺失型α-地中海贫血基因的扩增引物组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.1、SEQID No.2、ID No.6、SEQ ID No.7、ID No.11、SEQ ID No.12、ID No.16、SEQ ID No.17；所述用于缺失型α-地中海贫血基因的检测引物和探针组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ IDNo.3、SEQ IDNo.4、ID No.8、SEQ ID No.9、ID No.13、SEQ ID No.14、IDNo.18、SEQ IDNo.19；
用于一管法缺失型α-地中海贫血等位基因和内标基因检测的引物和探针组合，包括如下引物探针的组合：
-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
优选地，用于2管法缺失型α-地中海贫血等位基因和内标基因检测的引物组，一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点，缺失位点的扩增引物5-端可以添加tag序列，并用含有tag序列的通用引物作为各缺失位点的检测引物，包括如下引物探针的组合：
-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
内标基因位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；检测探针序列为SEQ ID NO.26所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX等，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
基因型确定位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；检测探针序列为SEQ ID NO.23所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
优选地，还包括内标基因位点引物探针组合，通过内标基因位点的扩增水平，判断所检测的DNA状态和试剂盒的性能状态；所述的内标基因位点的引物和探针组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.24、ID No.25、SEQ ID No.26；内标基因，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；检测探针序列为SEQ ID NO.26所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX。
优选地，各缺失位点的上游扩增引物5’端可以添加tag序列，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.5、ID No.10、SEQ ID No.15、ID No.20；对应的tag寡核苷酸序列为：SEQ IDNo.27。
优选地，含tag序列的引物作为各缺失位点通用检测引物，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.28。
优选地，通过检测基因型确定位点的存在与否，判断待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型；
所述的检测基因型确定位点的引物和探针组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ IDNo.21、ID No.22、SEQ ID No.23；以判断地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
优选地，其组份还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、PCR添加剂、镁离子、dNTPs组份组成的缓冲液，阳性对照物、阴性对照物、纯水。
优选地，所述PCR缓冲液中包含PCR添加剂，且PCR添加剂由DMSO、BSA、DTT和甜菜碱组成，DMSO浓度是2％-8％，BSA浓度5-15ug/ml，DTT浓度是1-5mM，甜菜碱浓度是0.4-0.8M。
各缺失位点扩增引物5’端标记的tag序列可以是一样的，也可以不同位点采用不同的tag序列。在本发明中，各缺失位点扩增引物的tag序列是一样的。在检测阶段，包含tag序列引物可以作为通用检测引物，与对应链的检测引物以及检测探针结合，完成检测阶段的扩增与检测。
α-地中海贫血是珠蛋白基因缺失或功能缺陷导致链合成受抑制。根据肽链缺失不同可分4型，其中α-地贫重型胎儿(--/--)多于妊娠28～34周早产、死产或生后不久死亡，是围产儿死亡的重要原因之一。夫妇双方均为α-地中海贫血基因杂合子者,其每次妊娠后代中约有25％的机会出生重型地贫儿(地贫基因纯合子)，因此产前筛查及基因诊断非常重要，确诊夫妇双方为地贫基因携带者均应行产前诊断，及早发现重型地贫儿。在地贫基因携带者筛查与产前诊断中，常用的标本为人外周血全血、绒毛组织、羊水、脐血等等。
人外周血全血、羊水、绒毛组织、脐血等含人体细胞的样本，均可以获得母体或胎儿地中海贫血相关的基因信息。目前临床地中海贫血的筛查与诊断，是以来源于人体的遗传物质(常见的遗传物质为DNA)为模板，用本发明所述的引物组进行PCR扩增，扩增过程中，根据探针标记荧光的信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型。
一种基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒检测缺失型α-地中海贫血的方法，首先采用引物组进行PCR扩增，在检测过程中，根据各位点探针标记荧光的信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型；
a珠蛋白基因簇具有GC含量高和序列高度同源两个特点，a珠蛋白基因序列组成特点是GC含量高。高GC含量，对扩增体系要求较高，一般的扩增体系扩增效率较低，并容易产生非特异扩增。GC含量高时，用普通PCR体系很难理想地扩增，因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，在常规变性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的GC丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难于结合到模板上，DNA聚合酶也难于延伸或停止延伸，结果常出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。在扩增高含量GC的基因时，对PCR条件进行如下几个方面操作：1、热启动(hotstart)PCR。使用热启动PCR，一方面通过扩增前的加热，使双链模板充分解链，另一方面，通过高温启动反应，促进引物的特异性复性与延伸；增加有效引物的长度，提高了反应的特异性与灵敏性，并减少了引物二聚体或多聚体的形成，从而能提高GC富集区的扩增效率。2、扩增体系中加入PCR添加剂。PCR添加剂能够有效降低高GC模板和具有复杂二级结构模板的解链温度，增加PCR反应的灵敏度和特异性，且兼容DNA聚合酶的扩增体系；添加剂有：DMSO、甘油、甲酰胺、硫酸铵、甜菜碱、BSA、DTT，以提高PCR的扩增效率；
a珠蛋白基因簇包含两个a珠蛋白基因和1个假基因，3个基因区段的序列高度同源，在高度同源区设计引物把假基因或其他同源序列扩增出来，降低了靶基因的扩增效率，通过一系列的序列比对，设计了特异性扩增目的基因的引物和检测探针，能很好的扩增并检测目的片段，避免非特异扩增。
为了保证检测灵敏度，一般的Taqman探针方法要求扩增片段不要大于200bp，因此目前还没有直接用Taqman探针方法检测缺失型α-地中海贫血的试剂盒，本发明结合优化的反应程序和反应体系，发明了一种适用于Taqman探针的实时荧光α-地中海贫血检测方法。
所述扩增体系中优选Taq酶为热启动Taq DNA聚合酶；Taq DNA聚合酶具有高的聚合活性，并具有5’-3’外切活性；扩增引物浓度0.04μM-0.1μM；扩增引物上下游的浓度比例是1-10；检测引物浓度0.04μM-0.1μM；检测探针浓度0.04μM-0.1μM；检测引物与野生型位点引物比例为1-10；检测引物与基因型确定位点引物比例为1-10；检测探针与野生型位点探针比例为1-10；检测探针与基因型确定位点探针比例为1-10；dNTPs浓度为0.1mM-0.5mM；镁离子浓度为1.5mM.5.5mM；DMSO浓度是2％-8％；甜菜碱浓度是0.4M-0.8M；BSA浓度5-15ug/ml；DTT浓度是1-5mM。
本发明提供了一种多重多色实时荧光PCR方法检测缺失型α-地中海贫血和内标基因的方法及其试剂盒。采用该试剂盒可以实现单次闭管反应完成常见缺失型α-地中海贫血等位基因的检测，具有简便、快捷，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
优化后的1管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000091
Figure GDA0004191184190000101
所优化的缺失位点扩增引物，可以在5’端带有tag序列，并用含有tag序列的通用引物完成检测过程，优化后的1管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000102
Figure GDA0004191184190000111
本发明所用的技术方案，也可以采用2管的检测方式，一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点。所述的基因型确定待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
优化后的2管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000112
Figure GDA0004191184190000121
所优化的缺失位点扩增引物，可以在5’端带有tag序列，并用含有tag序列的通用引物完成检测过程，优化后的2管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000122
Figure GDA0004191184190000131
所述的1管法缺失型α-地中海贫血检测试剂盒，除了PCR扩增体系和酶体系，还包括阳性对照、阴性对照、纯水。
所述的2管法缺失型α-地中海贫血检测试剂盒，除了PCR扩增体系和酶体系，还包括阳性对照、阴性对照、纯水。
结合引物探针设计，本发明对反应程序进行了优化，在高温反应阶段，体系能有效的扩增高GC含量的a珠蛋白基因，在低温反应阶段，对扩增的产物进行检测，通过Taqman探针荧光信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型。优化后的扩增反应程序如下：
Figure GDA0004191184190000132
Figure GDA0004191184190000141
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、针对现有缺失型α-地中海贫血基因检测方法存在的缺陷，本发明使用的多重多色实时荧光PCR检测方法和试剂盒，操作方便、流程短、结果判断直观、不会造成扩增产物污染，适用于临床样本大规模检测。
2、本发明所使用的方法和试剂盒可以在1管内检测4种常见的缺失型α-地中海贫血基因(-α3.7、-α4.2、--SEA、--THAI)和内标基因；使用2管法，可以确定待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型，为临床遗传咨询提供可靠信息。
3、本发明所使用的方法和试剂盒提供了一种优化的PCR扩增体系，能有效的扩增高GC含量的长片段，优化的体系同时也适用于Taqman探针的实时荧光检测。
4、本发明所使用的方法和试剂盒，直接通过Taqman探针在扩增过程中所产生的荧光信号，实时判断所检测的α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型，无需通过后续杂交或计算等过程，即可得到检测结果。
目前还没有直接用Taqman探针方法检测缺失型α-地中海贫血，本发明结合优化的反应程序和反应体系，在国内外首次发明了一种适用于Taqman探针的α-地中海贫血实时荧光检测方法和试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中a珠蛋白基因缺失示意图；
图2为本发明实施例中-α3.7缺失和内标基因扩增曲线示意图；
图3为本发明实施例中THAI缺失和内标基因扩增曲线示意图；
图4为本发明实施例中-α4.2缺失和内标基因扩增曲线示意图；
图5为本发明实施例中SEA缺失和内标基因扩增曲线示意图；
图6为本发明实施例中两管法，--SEA复合-α3.7缺失和内标基因扩增曲线示意图；
图7为本发明实施例中两管法，--SEA复合-α4.2缺失和内标基因扩增曲线示意图；
图8为本发明实施例中无缺失样本扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例
一种基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒，包括用于缺失型α-地中海贫血基因扩增的引物组合和用于缺失型α-地中海贫血基因检测的引物和探针组合，所述用于缺失型α-地中海贫血基因的扩增引物组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.1、SEQID No.2、ID No.6、SEQ ID No.7、ID No.11、SEQ ID No.12、ID No.16、SEQ ID No.17；所述用于缺失型α-地中海贫血基因的检测引物和探针组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ IDNo.3、SEQ IDNo.4、ID No.8、SEQ ID No.9、ID No.13、SEQ ID No.14、IDNo.18、SEQ IDNo.19；
用于一管法缺失型α-地中海贫血等位基因和内标基因检测的引物和探针组合，包括如下引物探针的组合：
-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
用于2管法缺失型α-地中海贫血等位基因和内标基因检测的引物组，一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点，缺失位点的扩增引物5-端可以添加tag序列，并用含有tag序列的通用引物作为各缺失位点的检测引物，包括如下引物探针的组合：
-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
内标基因位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；检测探针序列为SEQ ID NO.26所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX等，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；
基因型确定位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；检测探针序列为SEQ ID NO.23所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
为了进一步优化技术方案，还包括内标基因位点引物探针组合，通过内标基因位点的扩增水平，判断所检测的DNA状态和试剂盒的性能状态；所述的内标基因位点的引物和探针组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.24、ID No.25、SEQ ID No.26；内标基因，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；检测探针序列为SEQ IDNO.26所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX。
为了进一步优化技术方案，各缺失位点的上游扩增引物5’端可以添加tag序列，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.5、ID No.10、SEQ ID No.15、ID No.20；对应的tag寡核苷酸序列为：SEQ ID No.27。
为了进一步优化技术方案，含tag序列的引物作为各缺失位点通用检测引物，对应的寡核苷酸序列为：SEQ ID No.28。
为了进一步优化技术方案，通过检测基因型确定位点的存在与否，判断待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型；
所述的检测基因型确定位点的引物和探针组合，对应的寡核苷酸序列为：SEQ IDNo.21、ID No.22、SEQ ID No.23；以判断地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
为了进一步优化技术方案，其组份还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、PCR添加剂、镁离子、dNTPs组份组成的缓冲液，阳性对照物、阴性对照物、纯水。
为了进一步优化技术方案，所述PCR缓冲液中包含PCR添加剂，且PCR添加剂由DMSO、BSA、DTT和甜菜碱组成，DMSO浓度是2％-8％，BSA浓度5-15ug/ml，DTT浓度是1-5mM，甜菜碱浓度是0.4-0.8M。
各缺失位点扩增引物5’端标记的tag序列可以是一样的，也可以不同位点采用不同的tag序列。在本发明中，各缺失位点扩增引物的tag序列是一样的。在检测阶段，包含tag序列引物可以作为通用检测引物，与对应链的检测引物以及检测探针结合，完成检测阶段的扩增与检测。
α-地中海贫血是珠蛋白基因缺失或功能缺陷导致链合成受抑制。根据肽链缺失不同可分4型，其中α-地贫重型胎儿(--/--)多于妊娠28～34周早产、死产或生后不久死亡，是围产儿死亡的重要原因之一。夫妇双方均为α-地中海贫血基因杂合子者,其每次妊娠后代中约有25％的机会出生重型地贫儿(地贫基因纯合子)，因此产前筛查及基因诊断非常重要，确诊夫妇双方为地贫基因携带者均应行产前诊断，及早发现重型地贫儿。在地贫基因携带者筛查与产前诊断中，常用的标本为人外周血全血、绒毛组织、羊水、脐血等等。
人外周血全血、羊水、绒毛组织、脐血等含人体细胞的样本，均可以获得母体或胎儿地中海贫血相关的基因信息。目前临床地中海贫血的筛查与诊断，是以来源于人体的遗传物质(常见的遗传物质为DNA)为模板，用本发明所述的引物组进行PCR扩增，扩增过程中，根据探针标记荧光的信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型。
一种基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒检测缺失型α-地中海贫血的方法，首先采用引物组进行PCR扩增，在检测过程中，根据各位点探针标记荧光的信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型；
参阅图1，a珠蛋白基因簇具有GC含量高和序列高度同源两个特点，a珠蛋白基因序列组成特点是GC含量高。高GC含量，对扩增体系要求较高，一般的扩增体系扩增效率较低，并容易产生非特异扩增。GC含量高时，用普通PCR体系很难理想地扩增，因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，在常规变性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的GC丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难于结合到模板上，DNA聚合酶也难于延伸或停止延伸，结果常出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。在扩增高含量GC的基因时，对PCR条件进行如下几个方面操作：1、热启动(hot start)PCR。使用热启动PCR，一方面通过扩增前的加热，使双链模板充分解链，另一方面，通过高温启动反应，促进引物的特异性复性与延伸；增加有效引物的长度，提高了反应的特异性与灵敏性，并减少了引物二聚体或多聚体的形成，从而能提高GC富集区的扩增效率。2、扩增体系中加入PCR添加剂。PCR添加剂能够有效降低高GC模板和具有复杂二级结构模板的解链温度，增加PCR反应的灵敏度和特异性，且兼容DNA聚合酶的扩增体系；添加剂有：DMSO、甘油、甲酰胺、硫酸铵、甜菜碱、BSA、DTT，以提高PCR的扩增效率；
a珠蛋白基因簇包含两个a珠蛋白基因和1个假基因，3个基因区段的序列高度同源，在高度同源区设计引物把假基因或其他同源序列扩增出来，降低了靶基因的扩增效率，通过一系列的序列比对，设计了特异性扩增目的基因的引物和检测探针，能很好的扩增并检测目的片段，避免非特异扩增。
为了保证检测灵敏度，一般的Taqman探针方法要求扩增片段不要大于200bp，因此目前还没有直接用Taqman探针方法检测缺失型α-地中海贫血的试剂盒，本发明结合优化的反应程序和反应体系，发明了一种适用于Taqman探针的实时荧光α-地中海贫血检测方法。
所述扩增体系中优选Taq酶为热启动Taq DNA聚合酶；Taq DNA聚合酶具有高的聚合活性，并具有5’-3’外切活性；扩增引物浓度0.04μM-0.1μM；扩增引物上下游的浓度比例是1-10；检测引物浓度0.04μM-0.1μM；检测探针浓度0.04μM-0.1μM；检测引物与野生型位点引物比例为1-10；检测引物与基因型确定位点引物比例为1-10；检测探针与野生型位点探针比例为1-10；检测探针与基因型确定位点探针比例为1-10；dNTPs浓度为0.1mM-0.5mM；镁离子浓度为1.5mM.5.5mM；DMSO浓度是2％-8％；甜菜碱浓度是0.4M-0.8M；BSA浓度5-15ug/ml；DTT浓度是1-5mM。
本发明提供了一种多重多色实时荧光PCR方法检测缺失型α-地中海贫血和内标基因的方法及其试剂盒。采用该试剂盒可以实现单次闭管反应完成常见缺失型α-地中海贫血等位基因的检测，具有简便、快捷，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
优化后的1管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000191
所优化的缺失位点扩增引物，可以在5’端带有tag序列，并用含有tag序列的通用引物完成检测过程，优化后的1管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000192
Figure GDA0004191184190000201
本发明所用的技术方案，也可以采用2管的检测方式，一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点。所述的基因型确定待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
优化后的2管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000202
Figure GDA0004191184190000211
所优化的缺失位点扩增引物，可以在5’端带有tag序列，并用含有tag序列的通用引物完成检测过程，优化后的2管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000212
Figure GDA0004191184190000221
Figure GDA0004191184190000231
所述的1管法缺失型α-地中海贫血检测试剂盒，除了PCR扩增体系和酶体系，还包括阳性对照、阴性对照、纯水。
所述的2管法缺失型α-地中海贫血检测试剂盒，除了PCR扩增体系和酶体系，还包括阳性对照、阴性对照、纯水。
结合引物探针设计，本发明对反应程序进行了优化，在高温反应阶段，体系能有效的扩增高GC含量的a珠蛋白基因，在低温反应阶段，对扩增的产物进行检测，通过Taqman探针荧光信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型。优化后的扩增反应程序如下：
Figure GDA0004191184190000232
<一>、引物探针的设计是基于PCR扩增技术的基础，是试剂盒各项性能指标如灵敏度和特异性的保证。对于a珠蛋白基因，有两个特点，1是高GC含量，2是同源性高(两个a和一个假基因，序列高度同源)。这两个特点导致在该区域设计引物探针具有很大的挑战性，尤其是不同的缺失型，比如-α3.7、-α4.2这两种缺失型的断裂位点不固定，给引物探针的设计带来更大的困难。经过比较不同的设计，本发明优选了一组引物探针序列，能保证试剂盒的灵敏度和特异性。
本发明针对-α3.7、-α4.2、--SEA和—THAI缺失位点，在上游扩增引物的5’端，添加了一段tag序列，该序列不与已知人源序列同源，利用该序列作为检测阶段的通用扩增引物，与具体位点的检测下游引物和检测探针配合，也能有效的检出特异缺失。
Figure GDA0004191184190000241
<二>、本发明对Taq耐热DNA聚合酶(Taq酶)、引物探针浓度与比例、镁离子、PCR添加剂等组份进行了优化，提高了长片段、高GC含量DNA的扩增效率。优化后的1管法反应体系如下：
Figure GDA0004191184190000242
Figure GDA0004191184190000251
所优化的缺失位点扩增引物，可以在5’端带有tag序列，并用含有tag序列的通用引物完成检测过程，优化后的1管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000252
Figure GDA0004191184190000261
本发明所用的技术方案，也可以采用2管的检测方式，一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点。所述的基因型确定位点用于确定待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
优化后的2管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000262
Figure GDA0004191184190000271
所优化的缺失位点扩增引物，可以在5’端带有tag序列，并用含有tag序列的通用引物完成检测过程，优化后的2管法反应体系如下(反应体积25μl)：
Figure GDA0004191184190000272
Figure GDA0004191184190000281
Figure GDA0004191184190000291
结合引物探针设计，本发明对反应程序进行了优化，在高温反应阶段，体系能有效的扩增高GC含量的a珠蛋白基因，在低温反应阶段，对扩增的产物进行检测，通过Taqman探针荧光信号曲线即可实时获得所检测遗传物质α-地中海贫血基因型。优化后的反应程序如下：
Figure GDA0004191184190000292
<三>、本发明所检测的DNA可以来源于人类所有含有核酸的细胞及组织，如血液、精液、脐带血、羊水、血液中的游离DNA、绒毛组织、毛囊以及植入前的胚胎等。
具体检测步骤为：
1、取得待检组织后，根据不同的组织类型，采用不同的方法分离细胞，如羊水可以通过离心的方法收集细胞；
2、使用商品化核酸纯化提取试剂盒从细胞中提取待检测的DNA；
3、提取的DNA，按<二>的方法进行扩增检测；
4、判断标准：待检样本DNA内标对应的探针有扩增曲线，说明加入的DNA满足检测要求，在此基础上，根据各缺失位点对应探针的扩增曲线情况，判断是否有缺失。举例如下：
如SEA对应的探针出现扩增曲线，说明待检样本有SEA缺失；
如3.7对应的探针出现扩增曲线，说明待检样本有3.7缺失；
如4.2对应的探针出现扩增曲线，说明待检样本有4.2缺失；
如THAI对应的探针出现扩增曲线，说明待检样本有THAI缺失；
如3.7和SEA对应的探针同时出现扩增曲线，说明待检样本有3.7和SEA同时缺失，为复合缺失；
如4.2和SEA对应的探针同时出现扩增曲线，说明待检样本有4.2和SEA同时缺失，为复合缺失；
如只有内标探针的扩增曲线，没有缺失探针对应的扩增曲线，说明待检样本为野生型，无缺失。
收集临床确诊地贫患者外周血样本，经gap-PCR方法确认缺失类型，其中-α3.7缺失型2例、-α4.2缺失型2例、--SEA缺失型2例、--THAI缺失型1例、-α3.7复合--SEA缺失型1例、-α4.2复合--SEA缺失型1例、正常人1例。提取基因组DNA，按所述1管法反应体系、反应条件进行检测与结果判定如下表，具体扩增曲线见附图2-5及图8：
编号 gap-PCR 本发明方法检测结果
1 -α3.7缺失 -α3.7缺失
2 -α3.7缺失 -α3.7缺失
3 -α4.2缺失 -α4.2缺失
4 -α4.2缺失 -α4.2缺失
5 --SEA缺失 --SEA缺失
6 --SEA缺失 --SEA缺失
7 --THAI缺失 --THAI缺失
8 -α3.7复合--SEA缺失 -α3.7复合--SEA缺失
9 -α4.2复合--SEA缺失 -α4.2复合--SEA缺失
10 未检测到缺失突变 未检测到缺失突变
从检测结果看，两种方法结果一致，但本发明的方法无需电泳，避免了扩增产物污染的可能性；同时，本发明的方法操作简单，结果直观，更有利于临床应用的普及。
<四>、本发明所用的技术方案，也可以采用2管的检测方式，即一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点。所述的基因型确定位点用于确定待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
具体检测步骤为：
1、取得待检组织后，根据不同的组织类型，采用不同的方法分离细胞，如羊水可以通过离心的方法收集细胞；
2、使用商品化核酸纯化提取试剂盒从细胞中提取待检测的DNA；
3、提取的DNA，按<二>的方法进行扩增检测；
4、判断标准：待检样本DNA内标对应的探针有扩增曲线，说明加入的DNA满足检测要求，在此基础上，根据各缺失位点对应探针的扩增曲线情况，判断是否有缺失；
基因型确定位点对应的探针有扩增曲线，说明加入的DNA为野生型或杂合缺失型，根据各缺失位点对应探针的扩增曲线情况，判断是否有缺失以及是杂合缺失型还是纯合缺失型。举例如下：
如SEA和基因型确定位点对应的探针均出现扩增曲线，说明待检样本是SEA杂合缺失；
如只有SEA位点对应的探针出现扩增曲线，基因型确定位点对应的探针无扩增曲线，说明待检样本是SEA纯合缺失；
如3.7和基因型确定位点对应的探针均出现扩增曲线，说明待检样本是3.7杂合缺失；
如只有3.7位点对应的探针出现扩增曲线，基因型确定位点对应的探针无扩增曲线，说明待检样本是3.7纯合缺失；
如4.2和基因型确定位点对应的探针均出现扩增曲线，说明待检样本是4.2杂合缺失；
如只有4.2位点对应的探针出现扩增曲线，基因型确定位点对应的探针无扩增曲线，说明待检样本是4.2纯合缺失；
如THAI和基因型确定位点对应的探针均出现扩增曲线，说明待检样本是THAI杂合缺失；
如只有THAI位点对应的探针出现扩增曲线，基因型确定位点对应的探针无扩增曲线，说明待检样本是THAI纯合缺失；
如3.7和SEA对应的探针同时出现扩增曲线，基因型确定位点对应的探针无扩增曲线，说明待检样本为3.7和SEA同时缺失，为复合缺失；
如4.2和SEA对应的探针同时出现扩增曲线，基因型确定位点对应的探针无扩增曲线，说明待检样本为4.2和SEA同时缺失，为复合缺失；
如内标探针和基因型确定位点对应的探针均有扩增曲线，没有缺失探针对应的扩增曲线，说明待检样本为野生型，无缺失。
按所述2管法反应体系、反应条件对用<三>中提取的DNA进行检测，结果判定如下表，具体扩增曲线见附图6、附图7：
编号 gap-PCR 本发明方法检测结果 缺失状态
1 -α3.7缺失 -α3.7缺失 杂合缺失
2 -α3.7缺失 -α3.7缺失 杂合缺失
3 -α4.2缺失 -α4.2缺失 杂合缺失
4 -α4.2缺失 -α4.2缺失 纯合缺失
5 --SEA缺失 --SEA缺失 杂合缺失
6 --SEA缺失 --SEA缺失 纯合缺失
7 --THAI缺失 --THAI缺失 杂合缺失
8 -α3.7复合--SEA缺失 -α3.7复合--SEA缺失 杂合缺失
9 -α4.2复合--SEA缺失 -α4.2复合--SEA缺失 杂合缺失
10 未检测到缺失突变 未检测到缺失突变 野生型
从检测结果看，两种方法结果一致，但本发明的方法可以确定所检测的DNA是杂合缺失还是纯合缺失，在临床遗传咨询过程中，更有利于医生对携带者把缺失基因传递给下一代的机率进行判断。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、针对现有缺失型α-地中海贫血基因检测方法存在的缺陷，本发明使用的多重多色实时荧光PCR检测方法和试剂盒，操作方便、流程短、结果判断直观、不会造成扩增产物污染，适用于临床样本大规模检测。
2、本发明所使用的方法和试剂盒可以在1管内检测4种常见的缺失型α-地中海贫血基因(-α3.7、-α4.2、--SEA、--THAI)和内标基因；使用2管法，可以确定待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型，为临床遗传咨询提供可靠信息。
3、本发明所使用的方法和试剂盒提供了一种优化的PCR扩增体系，能有效的扩增高GC含量的长片段，优化的体系同时也适用于Taqman探针的实时荧光检测。
4、本发明所使用的方法和试剂盒，直接通过Taqman探针在扩增过程中所产生的荧光信号，实时判断所检测的α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型，无需通过后续杂交或计算等过程，即可得到检测结果。
目前还没有直接用Taqman探针方法检测缺失型α-地中海贫血，本发明结合优化的反应程序和反应体系，在国内外首次发明了一种适用于Taqman探针的α-地中海贫血实时荧光检测方法和试剂盒。本发明针对现有缺失型α-地中海贫血基因检测方法存在的缺陷，采用该试剂盒可以实现单管单次闭管反应完成缺失型α-地中海贫血等位基因的检测，具有简便、快捷，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。从而达到了设计新颖、工艺布局合理、且应用效果好的目的。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120> 基于Taqman 探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 28
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TTTATCCCAG AGCCAAGTTT GTTTATCTG
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CATGCCTGGC ACGTTTGCT
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CCTAGAGGTC GTGGTT
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
TATCCCAGAG CCAAGTTTGT T
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ACACCGTCGC GTCAATTTAT CCCAGAGCCA AGTTTGTTTA TCTG
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ATTTATCCAC ACCCTTCCCA GTTTACCC
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
CCGTTGGATC TTCTCATTTC CC
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
CACCAATGCT CTAGCTT
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
TATCCACACC CTTCCCAGTT
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ACACCGTCGC GTCAATTTAT CCACACCCTT CCCAGTTTAC CC
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ACATAGAGAG AGGAGCCGCT GTGAAAT
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
CGTGGCAGGC ACCTGTAGTC
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
GAGGGGCTCT CCACCA
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
CATAGAGAGA GGAGCCGCTG T
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ACACCGTCGC GTCAAACATA GAGAGAGGAG CCGCTGTGAA AT
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ATTAACTCCC CTGCCCTTCA CCCTC
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
TCGCTGATAG CACCCACAAC A
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
CCTCCTTCCC TCCAATAC
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
TTAACTCCCC TGCCCTTCAC
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ACACCGTCGC GTCATATTAA CTCCCCTGCC CTTCACCCTC
<210>21
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
CCTCGGTAGC CGTTCC
<210>22
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
AGGCTGCTGC CCACTC
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
TATTCAAAGA CCAGGAAGGG C
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ACTGCAGGGT CCGCACT
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
GCCTCCCGCA CTCTTACT
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
ACTCCGAGGA ACCGCTGC
<210>27
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CCACACCGTC GCGTCA
<210>28
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
CCACACCGTCGCGTCA

Claims (7)

1.一种一管法检测缺失型α-地中海贫血等位基因的引物和探针组合，包括如下引物探针的组合：-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，还包括内标基因位点引物探针组合，通过内标基因位点的扩增水平，判断所检测的DNA状态和试剂盒的性能状态；内标基因，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；检测探针序列为SEQID NO.26所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX。
3.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，其组份还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、PCR添加剂、镁离子、dNTPs组份、阳性对照物、阴性对照物、纯水；所述PCR添加剂由DMSO、BSA、DTT和甜菜碱组成，DMSO浓度是2%-8%，BSA浓度5-15ug/ml，DTT浓度是1-5mM，甜菜碱浓度是0.4-0.8M。
4.一种一管法检测缺失型α-地中海贫血等位基因的引物和探针组合，包括如下引物探针的组合：-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQID NO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；检测探针标记的报告检测荧光选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
5.根据权利要求4所述的引物和探针组合，其特征在于，其组份还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、PCR添加剂、镁离子、dNTPs组份、阳性对照物、阴性对照物、纯水；所述PCR添加剂由DMSO、BSA、DTT和甜菜碱组成，DMSO浓度是2%-8%，BSA浓度5-15ug/ml，DTT浓度是1-5mM，甜菜碱浓度是0.4-0.8M。
6.一种二管法检测缺失型α-地中海贫血等位基因的引物和探针组合，其特征在于，一管检测-α3.7、--THAI和内标基因，另一管检测-α4.2、--SEA和基因型确定位点，缺失位点的扩增引物5'-端添加tag序列，两管均使用含有tag序列的通用引物作为各缺失位点的检测引物，通用引物的序列为SEQ ID NO.28，所述引物和探针组合如下所示：-α3.7位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.2所示；检测引物和探针序列为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；-α4.2位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；--THAI位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.12所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；--SEA位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.17所示；检测引物和探针序列为SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19所示，检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；内标基因位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.24和SEQ IDNO.25所示；检测探针序列为SEQ ID NO.26所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX等，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2；基因型确定位点，上、下游扩增引物序列分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；检测探针序列为SEQ ID NO.23所示；检测探针标记的报告荧光素选自：6-FAM、HEX、VIC、Cy5、TAMRA、ROX，淬灭荧光素选自：BHQ1、BHQ2。
7.根据权利要6所述的引物和探针组合，其特征在于，通过检测基因型确定位点的存在与否，判断待检者α-地中海贫血等位基因是野生型、杂合缺失型还是纯合缺失型。
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