CN104178573A - 用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的引物；一条特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针，一条特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针，一条特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针，以及一条特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针。本发明所述试剂盒对α-地中海贫血珠蛋白基因缺失检测具有高度的灵敏性、稳定性、准确性及较高的特异性。

Description

用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。
背景技术
地中海贫血简称地贫，是最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫，分别由α-蛋白基因簇和β-珠蛋白基因簇异常表达引起。在我国，广西、广东和海南是地中海贫血的高发省份，其中广西α-地贫的发病率是15.5％。中国人群中，缺失型α-地贫的基因型常见基因型为--SEA、-α3.7和-α4.2，以及广西区内相对常见的泰国型缺失(--THAI)。
同源基因定量技术是一种根据基因的同源性，采用共同的扩增引物对同源基因进行扩增，最后采用荧光标记法或者探针法对基因的含量进行相对定量的方法。α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)由调控因子(HS-40)，α基因(α1和α2)，ζ基因(ζ2)，假基因(Ψζ1,Ψα2 and Ψα1)和θ组成，其排列顺序为:HS40–ζ2–Ψζ1–Ψα2–Ψα1–α2–α1–θ。α地中海贫血基因据其同源性，可划分为X1，X2，Y1，Y2，Z1和Z2区间，其中-α3.7(也称为右侧缺失)的形成源于Z1和Z2之间的同源重组，其DNA结构表现为仅仅包含一个α1区段，而-α4.2(也称为左侧缺失)则来源于X1和X2之间的同源重组，如图1所示，其DNA结构表现为存在一个α2-α1的融合基因。对-α3.7和-α4.2携带者而言，其表现型及危害相似。然而，由于-α3.7和-α4.2均由大区段同源基因重组产生，因而不同个体所携带的-α3.7或-α4.2基因序列并不一致，因此，目前常用的诊断方法为通过跨越断点式PCR(Gap-PCR)将其扩增出来，但因其区段长度较长，导致检测时间也较长。另一方面，由于-α3.7和-α4.2的危害相似，如果可以将其简并进行检测，则可以实现短区段快速扩增检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法。采用该试剂盒可以相对定量检测α-珠蛋白基因簇中α1和α2功能基因的拷贝数及拷贝数的变化。
本发明所述的用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，所述的扩增引物为：一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物A1A2-F和A1A2-R，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一对扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物THAI-F和THAI-R；所述的荧光探针为：一条特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob，一条特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob，一条特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob，以及一条特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob；
其中：
所述的可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物对中，
A1A2-F：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’；
A1A2-R：5’-GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3’；
所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物对中，
SEA-F：5’-CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3’；
SEA-R：5’-CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’；
所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物对中，
THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’；
THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；
所述的特异性检测特α1区段的征序列A1的荧光探针A1-Prob为：
A1-Prob：5’6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’BHQ-1；
所述的特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob为：
A2-Prob：5’ROX–CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’BHQ-2；
所述的特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为：
SEA-Prob：5’-HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’；
所述的的特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：
THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。
本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
上述技术方案中，所述α1区段的序列为：5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’；该α1区段的特征序列A1为：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3’。
上述技术方案中，所述α2区段的序列为：5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’；该α2区段的特征序列A2区段为：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3’。
本发明所述的用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP等，具体的，酶液即为DNA聚合酶，具体可采用康为世纪所生产的GoldStar Taq DNAPolymerase，缓冲液为与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液。
本发明还提供采用上述试剂盒进行快速检测常见缺失型α-地中海贫血(如--SEA、-α和—THAI)的方法，包括以下步骤：
1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
2)配制反应体系，具体为：
取可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段中的特征序列A2的引物A1A2-F和A1A2-R、扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R、扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物THAI-F和THAI-R；特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob、特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob、特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob、特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；
3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；
4)数据分析及结果判定：根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型样本为对照标本，按下述公式进行计算：
待检样本的基因ΔCq＝Cq_A2-Cq_A1；
待检样本的基因ΔΔCq＝ΔCq_待检样本-ΔCq_正常样本；
待检样本的A1和A2相对拷贝数比值R＝2-ΔΔCq；
根据R的值结合下述表1中进行结果判定：
表1：
其中，当R在1.8～2.5范围时，其结果匹配上表理论值中的“2”；当R在0.75～1.26范围时，其结果匹配上表理论值中的“1”；当R在0.37～0.55范围时，其结果匹配上表理论值中的“0.5”；若R的计算结果不在上述定义的R值范围内时，应采用其他方法进行辅助判断。表中“+”代表阳性，表示存在扩增产物；“-”代表阴性，即不存在该扩增产物。
本发明的基本原理是基于α-珠蛋白基因缺失是导致α-地贫根本原因的发病机制。本试剂盒设计的理论依据为正常个体的基因型为αα/αα，其A1＝A2，无SEA扩增产物且无THAI扩增产物；-α/αα基因型中，A1＝2A2，或者A2＝2A1无SEA和THAI扩增产物；-α/-α基因型中，有A1扩增产物，无A2扩增产物(由于-α/-α基因型系罕见基因型，而在-α基因型中，以A1为特征序列的为主，因此在-α/-α基因型中，同时出现A1和A2扩增曲线的样本相当罕见)，无SEA和THAI扩增产物；--SEA/--SEA基因型中，无A1扩增产物，无A2扩增产物，有SEA扩增产物但无THAI扩增产物；--THAI/--SEA基因型中，无A1扩增产物，无A2扩增产物，有SEA扩增产物且有THAI扩增产物；--THAI/--THAI基因型中，无A1扩增产物，无A2扩增产物，无SEA扩增产物但有THAI扩增产物。
本发明所述的试剂盒，即是采用四重TaqMan荧光定量技术，定量检测样本中A1、A2的拷贝数，以及SEA及THAI的有无，综合实现常见缺失型α-地贫的快速分子诊断。由于TaqMan荧光定量技术在使用时，其定量结果并不是遵循完美的理论值，其结果会在理论值的左右浮动，因此，本申请人在对大量已知基因型样本验证后统计才得以得出上述方法中所述的R的计算值与表1中理论值中的对应关系，如果R的计算结果不在上述定义的R值范围内时，应采用其他方法进行辅助判断。
上述方法的步骤1)中，采用现有常规方法制备DNA模板。
上述方法的步骤2)中：
所述的可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物对中，
A1A2-F：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’；
A1A2-R：5’-GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3’；
所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物对中，
SEA-F：5’-CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3’；
SEA-R：5’-CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’；
所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物对中，
THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’；
THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；
所述的特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob为：
A1-Prob：5’6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’BHQ-1；
所述的特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob为：
A2-Prob：5’ROX–CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’BHQ-2；
所述的特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为：
SEA-Prob：5’-HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’；
所述的的特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：
THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’；
上述荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
上述方法的步骤2)中，所述反应体系中各组分的浓度优选为：各引物：0.25～0.8μmol/L；DNA模板：20～200ng；镁离子：1.5～1.9mmol/L；反应体系的终体积优选为20μL。
上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95℃预变性8～10分钟，然后95℃15～30秒，60℃退火50～70秒，39～49个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。更优选的PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟，然后95℃15秒，60℃退火60秒，40个循环。
与现有技术相比，本发明的特点在于：
1、本发明所述试剂盒中需要定量的2条基因(A1和A2)只采用1组引物即可以扩增，最大限度保障了扩增效率的一致性及定量的准确性；
2、本发明所述试剂盒无需引入内参基因，采用相对定量方法，通过比值结果，以及结合SEA曲线及THAI曲线的有无即可准确判断基因型；
3、对α-地中海贫血珠蛋白基因缺失检测具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性；
4、采用本发明所述试剂盒可将-α3.7和-α4.2简并为-α检测。
附图说明
图1是-α3.7和-α4.2的分子生物学结构图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
1、试剂盒的组成：
(1)可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物对A1A2-F和A1A2-R：
A1A2-F：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’(SEQ ID NO：1)；
A1A2-R：5’-GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3’(SEQ ID NO：2)；
(2)扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物对SEA-F和SEA-R：
SEA-F：5’-CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3’(SEQ ID NO：3)；
SEA-R：5’-CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物对THAI-F和THAI-R：
THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’(SEQ ID NO：5)；
THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’(SEQ ID NO：6)；
(4)特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob为：
A1-Prob：5’6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’BHQ-1(SEQ ID NO：7)；
(5)特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob为：
A2-Prob：5’ROX–CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’BHQ-2(SEQ ID NO：8)；
(6)特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为：
SEA-Prob：5’-HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’(SEQ ID NO：9)；
(7)特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：
THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’(SEQ IDNO：10)。
上述各引物和荧光探针均是针对α-珠蛋白基因簇设计的，其中：
所述α1区段的序列为：
5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’(SEQ ID NO：11)；该α1区段的特征序列A1为：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3’(SEQ ID NO：12)。
所述α2区段的序列为：
5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’(SEQ ID NO：13)；该α2区段的特征序列A2为：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3’(SEQ ID NO：14)。
(8)其它组成成分：
GoldStar Taq DNA Polymerase、与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液和dNTPs均购自康为世纪，MgCl2购自Life Technology。
按下述表2配制PCR反应体系：
表2：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)
2、实施方法：
PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec+60℃1min，40个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
样本处理：采用Lab-Aid DNA mini extraction kid(Bio-V,Xiamen)试剂盒抽提DNA，以双蒸水稀释至20～200ng/μL备用。DNA样本也可采用其他常规DNA提取方法提取。
样本检测：将待检样本，以及3份正常基因型(αα/αα)样本，根据上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录Cq值。
3、样本来源：所有的样本(含待检样本和正常基因型样本)均来源自经常规Gap-PCR技术确定核型的DNA样本。
4、数据分析及结果判定：按本发明所述公式(ΔCq＝Cq_Y2-Cq_Y1)计算正常样本基因ΔCq和待检样本的基因ΔCq_待检样本；将上述3份正常基因型样本的平均ΔCq值作为ΔCq_正常样本，结果如下述表3所示；根据公式ΔΔCq＝ΔCq_待 检样本-ΔCq_正常样本计算ΔΔCq值，通过公式R＝2-ΔΔCq计算A1和A2的比值，并按其结果根据前述表1判断标准确定检测所获得的A1和A2的相对拷贝数，结果如下述表4所示：
表3：
表4：
注：表中“+”表示该通道有扩增曲线即阳性，“-”表示该通道无扩增曲线，即阴性。
由结果可见，本发明可通过数据可分析区分出--SEA/αα基因型、--THAI/αα基因型、-α/αα基因型(简并-α4.2/αα和-α3.7/αα)和αα/αα基因型；且检测的所有样本的基因型与其经常规Gap-PCR技术确定的基因型相同，说明本发明所述试剂盒在对已知基因型样本的检测时具有很好的准确性。
实施例2：本发明在随机基因型样本中的检测效果。
1、试剂盒的组成：
同实施例1。
2、实施方法：
同实施例1。
3、样本来源：
样本为58例随机样本(由济南馨月生物技术有限公司提供)，以双蒸水稀释至20～200ng，作为待检样本)，以及经Gap-PCR验证的3例正常样本。
4、数据分析及结果判定：
根据本发明所述的数据分析公式进行计算，并按其结果根据前述表1判断标准确定检测所获得的A1和A2的相对拷贝数，结果如下述表5和表6所示；在用本发明所述试剂盒及方法对上述样本进行检测的同时，采用现有的Gap-PCR方法进行验证，结果如下述表5和表6所示：
表5：
表6：
注：表中“+”表示该通道有扩增曲线即阳性，“-”表示该通道无扩增曲线，即阴性。
由上述结果可见，采用本发明所述的试剂盒结合本发明所述的方法在常见缺失型α-地中海贫血检测中，其结果与Gap-PCR法一致。

Claims (7)

1.用于检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于：
所述的扩增引物为：一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物A1A2-F和A1A2-R，一对扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一对扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物THAI-F和THAI-R；
所述的荧光探针为：一条特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob，一条特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob，一条特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob，以及一条特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob；
其中：
所述的可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物对中，
A1A2-F：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’；
A1A2-R：5’-GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3’；
所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物对中，
SEA-F：5’-CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3’；
SEA-R：5’-CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’；
所述的扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物对中，
THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’；
THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；
所述的特异性检测特α1区段的征序列A1的荧光探针A1-Prob为：
A1-Prob：5’6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’BHQ-1；
所述的特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob为：
A2-Prob：5’ROX–CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’BHQ-2；
所述的特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob为：
SEA-Prob：5’-HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’；
所述的的特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：
THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述α1区段的序列为：
5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’；
所述α2区段的序列为：
5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述α1区段的特征序列A1为：
5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3’；
所述α2区段的特征序列A2为：
5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3’。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP。
5.采用权利要求1所述试剂盒进行快速检测常见缺失型α-地中海贫血的方法，包括以下步骤：
1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
2)配制反应体系，具体为：
取可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段的特征序列A1和α2区段的特征序列A2的引物A1A2-F和A1A2-R、扩增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R、扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的Gap-PCR引物THAI-F和THAI-R；特异性检测α1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob、特异性检测α2区段的特征序列A2的荧光探针A2-Prob、特异性检测--SEA基因型扩增产物的荧光探针SEA-Prob、特异性检测--THAI基因型扩增产物的荧光探针THAI-Prob；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；
3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq；
4)数据分析及结果判定：根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型样本为对照标本，按下述公式进行计算：
待检样本的基因ΔCq＝Cq_A2-Cq_A1；
待检样本的基因ΔΔCq＝ΔCq_待检样本-ΔCq_正常样本；
待检样本的A1和A2相对拷贝数比值R＝2-ΔΔCq；
根据R的值结合下述表1中进行结果判定：
表1：
其中，当R在1.8～2.5范围时，其结果匹配上表理论值中的“2”；当R在0.75～1.26范围时，其结果匹配上表理论值中的“1”；当R在0.37～0.55范围时，其结果匹配上表理论值中的“0.5”；若R的计算结果不在上述定义的R值范围内时，应采用其他方法进行辅助判断。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中，PCR扩增条件为：95℃预变性8～10分钟，然后95℃15～30秒，60℃退火50～70秒，39～49个循环。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟，然后95℃15秒，60℃退火60秒，40个循环。
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