CN113699231A - 一种α-地中海贫血相关基因检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑地中海贫血相关基因的检测试剂盒。本发明提供了针对检测α珠蛋白Fusion gene的α‑地中海贫血检测引物组，具体为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示引物，并基于此构建了检测试剂盒，操作简单，成本低，特异性高，结果判读直观，易于推广，适用于多种场合使用。而且，该引物组还具有非常好的多体系通用优势，可以与其他检测引物组配进行多重PCR检测，如核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的引物或核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物，能够一次性检测多种类型α‑地中海贫血。本发明提供的技术方案对开展地中海贫血人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。

Description

一种α-地中海贫血相关基因检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种α-地中海贫血相关基因检测试剂盒。

背景技术

地中海贫血是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺失，使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，而导致的一种常染色体隐性遗传溶血性疾病，轻者可无临床表现，重者以溶血性贫血为主要特征。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，地中海贫血可以分为α-地中海贫血、β-地中海贫血、δ-地中海贫血、γ-地中海贫血、δβ-地中海贫血和εγδβ-地中海贫血等。另外，临床上，该病又分轻型（地中海贫血基因携带者）、中间型和重型3个类型。

α珠蛋白基因位于人类第16号染色体短臂末端的α珠蛋白基因簇中，该基因包括二个重复的α基因（α2和α1）、一个胚胎期类α基因（ζ2）、三个假基因（Ψζ1、Ψα2和Ψα1）和一个功能未知的基因（θ1），其排列顺序为：5′-ζ2-Ψζ1-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ1-3′，全长约30 kb。所以α-地中海贫血基因型中除常见类型：--^SEA、-α^3.7和-α^4.2缺失，以及QS、CS和WS点突变外，仍存在许多罕见缺失或未知突变。

α-地中海贫血的表型严重程度随着功能性α-珠蛋白基因的减少而加重：（1）1个α-基因缺失或点突变（-α/αα或αα^T/αα或α^Tα/αα），称为静止型α-地贫，通常不贫血，血液学表现为小细胞低色素；（2）2个α-基因缺失或复合-α基因点突变，或点突变，其基因型为--/αα或-α/-α或-α/αα^T或α^Tα/-α或α^Tα/α^Tα，称为轻型α-地贫，临床表现为不贫血或轻度贫血，血液学检查有小细胞低色素特征；（3）3个α-基因缺失或复合α基因点突变，基因型为--/-α或--/α^Tα，称为中间型α-地贫，又称Hb H病，患者有轻至重度贫血。某些基因型为α^Tα/α^Tα的病例（如α^CSα/α^CSα、α^QSα/α^QSα和α^CSα/α^QSα）也表现为Hb H病。通常，--/α^Tα的非缺失型Hb H病较单纯缺失型Hb H病（--/-α）的临床表现更为严重，特别是基因型为--/α^CSα或--/α^QSα的Hb H病患者，贫血程度较为严重；（4）4个α-基因缺失，其基因型为--/--，称为重型α-地贫，又称HbBart’s胎儿水肿综合征，此类个体一般无法存活到出生或分娩后半小时内死亡。若仅是一条染色体上的1个α-基因缺失或缺陷，则α-链的合成部分受抑制，称为α⁺地贫；若有一条染色体上的2个α-基因缺失或缺陷，称为α⁰地贫；

基因重组被认为是一种可以通过不平等交叉或基因转换导致人类珠蛋白基因簇发生突变的机制。α珠蛋白基因簇包含的ζ2-珠蛋白和ψζ1-珠蛋白基因之间以及α1-珠蛋白和α2-珠蛋白基因之间由于序列同源性较高，两个ζ和两个α基因之间常常发生不平等的同源重组，导致珠蛋白基因结构发生改变。大多数具有轻微表型症状的病例是由于不平等的同源重组导致人类血红蛋白基因拷贝的增加或减少。α-珠蛋白的同源重组通常出现在减数分裂期间，等位基因之间发生单次交叉。两个错位的野生型α基因簇之间的重组可能导致单个α-珠蛋白基因缺失，如-α^4.2和-α^3.7，从而导致α⁺-地中海贫血。轻度缺失型α⁺-地中海贫血在世界热带和亚热带地区发生的频率极高。α⁰地中海贫血(--^SEA/)在南亚和东南亚地区有较高的发病率，我国华南地区有4.1～7.8%的人口出现α⁰地中海贫血。在中国人群中，主要的α⁺地中海贫血（包括缺失型和非缺失型）是-α^4.2、-α^3.7、α^CSα、α^QSα、α^WSα，在目前的很多试剂盒可以检测出这些携带率高的主要地中海贫血基因型。然而，稀有地中海贫血基因型会在诊断检查中被遗漏。

大多数Hb H疾病的个体是α⁺和α⁰地中海贫血的杂合子。有一种新的融合基因Fusion gene，该融合基因是由α2基因和ψα1基因发生同源重组而成，通过对比α2基因、Ψα1基因与融合基因的一代测序结果，可以发现融合基因3’端非编码区域与α2基因相比存在7个突变位点（nt34527 T>C，nt34531 A>C，nt34534G>A，nt34537 C>A，nt34545 G>A，nt34556A>G，nt34561 T>C），经过序列对比分析发现这7个突变位点序列与Ψα1基因对应的碱基序列相同。α2基因和ψα1基因发生同源重组导致α珠蛋白基因的结构发生改变，进而导致α⁺地中海贫血。Fusion gene是一种新的α⁺地中海贫血，当融合基因和α⁰地中海贫血的复合杂合子也会导致Hb H病。

在传统的地中海贫血筛查过程中，如果一个人携带有融合基因Fusion gene是无法被检测出来的，如果这个人与带有α⁰地中海贫血基因的配偶生育小孩，应用传统的检测试剂盒就可能导致错误的产前诊断结果，导致Hb H病患儿的出生。

目前现有α-地中海贫血检测产品专利技术中，均只出现--^SEA、--^THAI、-α^21.9、-α^4.2、-α^3.7、α^CSα、α^QSα、α^WSα等的检测技术及方法和试剂盒，未见直接进行α珠蛋白融合基因Fusiongene的检测。因此，为解决临床上因α2和ψα1基因发生同源重组重组导致漏检α-地中海贫血的情况，亟需建立Fusion gene的检测方法，这对开展地中海贫血人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。

发明内容

为解决临床上因α2基因和ψα1基因发生同源重组导致漏检α-地中海贫血的情况，本发明的一个目的是提供一种用于检测α-地中海贫血新型相关基因--融合基因Fusiongene的引物组。

本发明的另一目的是提供一种检测α-地中海贫血基因的试剂盒。

另外上述引物组还可与其他类型α-地中海贫血基因检测引物组配进行多重PCR检测，能够一次性检测多种类型α-地中海贫血。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种用于检测α-地中海贫血相关基因的引物组，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物。

该引物是在α2基因和ψα1基因重组片段的上游5’端和下游3’端保守区分别设计的引物Fusion gene-F和Fusion gene-R，Fusion gene-F结合于α2基因上游5’端区域，Fusiongene-R结合于ψα1基因3’端非编码区域。

而且，本发明上述提供的核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物具有非常好的多体系通用优势，能够与其他多种引物组合适用于其他扩增体系，比如核苷酸序列如SEQID NO：4～5所示的引物或核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物。

因此，优选地，上述引物组还包含核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的引物或核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物。

核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的引物用于检测东南亚缺失型α-地中海贫血；核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物用于检测泰国缺失型α-地中海贫血。利用该复合引物组可一次性检测多种α-地中海贫血类型。

进一步地，本发明基于上述引物组构建了包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物的一种用于检测α-地中海贫血基因的试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述试剂盒还可包括核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的引物或核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物。

进一步地，试剂盒还包含PCR反应试剂。

本发明所述试剂盒适用检测的样品DNA包含外周血、羊水细胞、绒毛或血斑卡的DNA。

优选地，所述试剂盒适用的反应体系中，样品DNA的浓度为5～100 ng/μL，每条引物的浓度均为0.1～1μM，MgCl₂的浓度为1.0～5.0 mM，dNTPs的浓度为100～500μM，DNA聚合酶的浓度为0.5U～4.0U/反应。

更优选地，所述试剂盒适用的反应体系中，样品DNA的浓度为10～100 ng/μL，每条引物的浓度均为0.4 μM，MgCl₂的浓度为1.5 mM，dNTPs的浓度为400 μM，DNA聚合酶的浓度为1 U/反应。

本发明以待测样本DNA作为模板，利用引物进行普通PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳看是否有出现目的条带，可直观判断待测样本是否有α珠蛋白融合基因Fusion gene以及其他靶点。

优选地，所述PCR反应的条件为：95°C 15 min；97°C变性30～60 s、55～65°C退火30～70 s、72°C延伸1～3 min，共35～40个循环；72°C延伸10 min。

更优选地，所述PCR反应的条件为：95°C 15 min；97°C变性50 s、60°C退火1 min、72°C延伸2 min，共35个循环；72°C延伸10 min。

优选地，所述判断待测样本含有α珠蛋白融合基因Fusion gene的标准为：琼脂糖凝胶电泳出现单一的长度为908 bp的电泳条带。

本发明基于该引物还构建了包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的引物的一种用于检测α-地中海贫血基因的试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。该试剂盒适用上述反应体系及PCR反应条件。

本发明还构建了包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物的一种用于检测α-地中海贫血基因的试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。该试剂盒适用上述反应体系及PCR反应条件。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的方案可以直接检测出α珠蛋白Fusion gene的α-地中海贫血基因缺陷。本发明使用琼脂糖凝胶电泳法即可检测α珠蛋白Fusion gene，操作简单，成本低，特异性高，结果判读直观，易于推广，适用于多种场合使用。

而且，本发明的引物组具有非常好的多体系通用优势，还可以与其他检测α-地中海贫血引物组配进行多重PCR检测，能够一次性检测多种类型α-地中海贫血。本发明方案对开展地中海贫血人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。

附图说明

图1为融合基因Fusion gene的形成过程及引物设计示意图。其中X、Y、Z盒为α基因的同源区段，αα等位基因上的α2基因与-α^4.2等位基因上的ψα1基因发生同源重组，形成Fusion gene；在α2基因上游5’端区域设计上游引物Fusion gene-F，在ψα1基因3’端非编码区域设计下游引物Fusion gene-R。

图2为含融合基因Fusion gene样品的电泳检测结果。Marker为DL2000，Fusiongene为含有融合基因的待测样本。

图3为含融合基因与东南亚型α珠蛋白基因缺失样本的检测结果。泳道M为DL2000Marker，泳道1～2为阴性对照，泳道3为融合基因Fusion gene阳性对照，泳道4为融合基因Fusion gene样本，泳道5为东南亚型α珠蛋白基因缺失阳性对照，泳道6为东南亚型α珠蛋白基因缺失样本，泳道7为融合基因Fusion gene复合东南亚型α珠蛋白基因缺失阳性对照，泳道8为融合基因Fusion gene复合东南亚型α珠蛋白基因缺失样本。

图4为含融合基因与泰国型α珠蛋白基因缺失样本的检测结果。泳道M为DL2000Marker，泳道1～2为阴性对照，泳道3为融合基因Fusion gene阳性对照，泳道4为融合基因Fusion gene样本，泳道5为泰国型α珠蛋白基因缺失阳性对照，泳道6为泰国型α珠蛋白基因缺失样本，泳道7为融合基因Fusion gene复合泰国型α珠蛋白基因缺失阳性对照，泳道8为融合基因Fusion gene复合泰国型α珠蛋白基因缺失样本。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 检测α珠蛋白融合基因的引物设计及筛选

由于α基因簇之间的高度同源性和高GC含量，采用通常的PCR扩增是很困难的，常常得不到预期产物，特异性差，特别是扩增高GC含量重复序列的大片段尤其困难。其原因可能是由于此类片段作为模板时，引物与模板在退火时容易形成稳定的二级结构阻碍DNA聚合酶在模板上的前进，同时模板上可能存在多个非特异的引物局部复性位点，导致非特异的扩增，而高GC含量的重复序列扩增又进一步加大非特异性扩增的产生。

为了避免上述情况的发生，本发明对α珠蛋白融合基因的PCR引物和PCR程序进行优化。

一、实验方法

1、样本来源

临床阳性样本均来源于广州凯普医学检验所临床诊断基因型为Fusion gene/αα的人群的静脉血。临床阴性样本均来源于广州凯普医学检验所临床诊断基因型为αα/αα、β^N/β^N的人群的静脉血。

以临床阳性样本作为阳性对照，临床阴性样本作为阴性对照进行引物筛查及PCR程序的优化。

2、引物设计

如图1所示，以未发生α2基因和ψα1基因同源重组的α珠蛋白基因（基因号：NG_000006.1）为模板，在α2基因的上游5’端区域（NG_000006.1 33589～NG_000006.1 33689）设计PCR上游引物Fusion gene-F，长度为15～30bp；在ψα1基因3’端非编码区域（NG_000006.1 30269～NG_000006.1 31146）设计PCR下游引物Fusion gene-R，长度为15～30bp。

在发生α2基因和ψα1基因同源重组的α珠蛋白基因中，上述引物可扩增出核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合基因Fusion gene。

根据上述设计方法，分别设计7条引物如表1所示。

表1 7条引物的名称以及碱基序列

设计试验，分组如表2所示。试验每组试验采用3个阴性对照与3个阳性对照重复3次进行实验。

通过琼脂糖凝胶电泳检测是否有出现目的条带，可直观判断待测样本是否有α珠蛋白融合基因Fusion gene：没有Fusion gene，引物无法扩增目的条带；有Fusion gene，引物才能扩增出目的片段。所以引物筛选原则为：阴性对照没有出现条带，阳性对照出现条带且为单一条带。

表2 试验组合与结果对比

二、实验结果

经过对比筛选，得到编号9与编号10两对可用引物，但由于编号9阳性对照扩增出的非特异条带比编号10多，故最后确定编号10的引物对是可以特异性扩增出α珠蛋白融合基因Fusion gene的引物，即Fusion gene-F：5’-CAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGG-3’（SEQ IDNO：2）和Fusion gene-R：5’-GCTGCCTACTCGGACTTCATT-3’（SEQ ID NO：3）。

实施例2 检测α珠蛋白融合基因的PCR扩增体系

使用实施例1所用临床阳性样本作为融合基因阳性样本，使用实施例1所用临床阴性样本作为阴性样本。

使用引物Fusion gene-F（SEQ ID NO：2）和Fusion gene-R（SEQ ID NO：3），设计多组试验以确定最佳的PCR扩增体系。

设定引物终浓度范围为0.1～1 μM、MgCl₂终浓度范围为1.0～5.0 mM、dNTPs终浓度范围为100～500 μM；DNA聚合酶终浓度范围为0.5～4 U/反应。

一、初步确定引物、MgCl₂、dNTPs、DNA聚合酶终浓度对扩增效率与特异性的影响

1、引物终浓度对扩增效率与特异性的影响

（1）实验方法

采用固定DNA模板的用量为2 μL（浓度为10～100 ng/μL），固定10×PCR Buffer的用量为2 μL，固定5×Q-solution的用量为2.8 μL，MgCl₂终浓度为2 mM，dNTPs终浓度为500μM，DNA聚合酶终浓度为2U/反应。改变引物浓度，设置浓度梯度为0.1 μM、0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM、0.6 μM、0.7 μM、0.8 μM、0.9 μM、1 μM进行试验，考察引物终浓度对扩增效率与特异性的影响。

（2）实验结果

综合扩增效率和特异性的优劣的排布顺序，得到最佳的引物终浓度为0.5 μM，次之为0.4 μM和0.6 μM，故选择3个参数的最佳浓度范围0.4 μM、0.5 μM、0.6 μM进行后续试验。每组试验采用3个阴性对照与3个阳性对照重复3次进行实验。

2、MgCl₂终浓度对扩增效率与特异性的影响

（1）实验方法

采用固定DNA模板量为2 μL（浓度为10～100 ng/μL），固定10×PCR Buffer的用量为2 μL，固定5×Q-solution的用量为2.8 μL，引物终浓度为上述最佳浓度0.5 μM，dNTPs终浓度为500 μM，DNA聚合酶终浓度为2U/反应。改变MgCl₂终浓度，设置浓度梯度为1 mM、1.5mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM进行试验，考察MgCl₂终浓度对扩增效率与特异性的影响。

（2）实验结果

综合扩增效率和特异性的优劣的排布顺序，得到最佳的MgCl₂终浓度为1.5 mM，次之为1.0 mM、2.0 mM，故选择3个参数的最佳浓度范围1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM进行后续试验，每组试验采用3个阴性对照与3个阳性对照重复3次进行实验。

3、dNTPs终浓度对扩增效率与特异性的影响

（1）实验方法

采用固定DNA模板量为2 μL（浓度为10～100 ng/μL），固定10×PCR Buffer的用量为2 μL，固定5×Q-solution的用量为2.8 μL，引物终浓度为上述最佳浓度0.5 μM，MgCl₂终浓度为上述最佳浓度1.5 mM，DNA聚合酶终浓度为2U/反应。改变dNTPs终浓度，设置浓度梯度为100 μM、150 μM、200 μM、250 μM、300 μM、350 μM、400 μM、450 μM、500 μM进行试验，考察dNTPs终浓度对扩增效率与特异性的影响。

（2）实验结果

综合扩增效率和特异性的优劣的排布顺序，得到最佳的dNTPs终浓度为400 mM，次之为350 μM、450 μM，故选择3个参数的最佳浓度范围：350 μM、400 μM、450 μM进行后续试验。每组试验采用3个阴性对照与3个阳性对照重复3次进行实验。

4、DNA聚合酶终浓度对扩增效率与特异性的影响

（1）实验方法

采用固定DNA模板量为2 μL（浓度为10～100 ng/μL），固定10×PCR Buffer的用量为2 μL，固定5×Q-solution的用量为2.8 μL，引物终浓度为上述最佳浓度0.5 μM，MgCl₂终浓度为上述最佳浓度1.5 mM，dNTPs终浓度为上述最佳浓度400 mM。改变DNA聚合酶终浓度，设置浓度梯度为0.5 U/反应、1 U/反应、1.5 U/反应、2 U/反应、2.5 U/反应、3 U/反应、3.5U/反应、4 U/反应进行试验，考察DNA聚合酶终浓度对扩增效率与特异性的影响。

（2）实验结果

综合扩增效率和特异性的优劣的排布顺序，得到最佳浓度为1 U/反应，次之为1U/反应、1.5 U/反应，故选择3个参数的最佳浓度范围：0.5 U/反应、1 U/反应、1.5 U/反应进行后续试验。每组试验采用3个阴性对照与3个阳性对照重复3次进行实验。

二、确定最佳扩增体系

1、实验方法

在上述试验的基础上，以DNA模板量为2 μL（浓度为10～100 ng/μL）为不变条件，选用引物终浓度、MgCl₂终浓度、dNTPs终浓度、DNA聚合酶终浓度为考察因素，进行3水平4因素的试验，以全面研究这四个因素的正交作用对扩增效率与特异性的影响，从而确定最佳扩增体系。试验因素水平如表3所示。每组试验采用3个阴性对照与3个阳性对照重复3次进行实验。

表3试验因素及水平

2、实验结果

试验的设计与结果如表4所示。以下“+”表示扩增效果的良好程度，“+++”表示最好；“++”表示中等；“+”表示一般。

表4 试验设计和结果

通过上述试验，最终确定最佳的PCR反应体系如表5所示，前期实践表明使用终浓度为0.7×的5×Q-solution也可以达到良好的PCR扩增效果。

表5最佳PCR反应体系

实施例3 检测α珠蛋白融合基因的PCR扩增条件的确定

一、实验方法

采用常规PCR体系，反应条件分以下步骤优化，如表6所示：

表6 PCR扩增条件的优化

PCR扩增条件的确定与PCR扩增体系的确定使用同样的方法，先经过初步试验，得到试验因素水平如表7所示。

表7试验因素及水平

再在上述初步试验的基础上，选用变性时间、退火温度、退火时间、延伸时间为考察因素，进行3水平4因素的试验，以全面研究这四个因素的正交作用对扩增效率与特异性的影响，从而确定最佳扩增条件。

二、实验结果

试验的设计与结果如表8所示。以下“+”表示扩增效果的良好程度，“+++”表示最好；“++”表示中等；“+”表示一般。

表8试验设计和结果

通过上述试验，最终确定最佳的扩增条件如表9所示。

表9 PCR扩增条件

上述反应条件的优化结果显示，退火温度对PCR反应的扩增效率和特异性的影响较大。退火温度偏低时会出现较多非特异性扩增条带，以及导致假阳性结果，退火温度偏高则影响其扩增效率，扩增效率下降，同时灵敏度也下降。通过控制好退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高。

实施例4 一种检测α珠蛋白融合基因的试剂盒

一、组成

试剂盒主要成分如表10所示。

表10试剂盒主要成分

二、适用仪器

PCR基因扩增仪：如博日PCR仪TC-96/G/H(b)、ABI 2720 PCR仪等；电泳仪：双稳定时电泳仪电源（DYY-6C）；凝胶成像系统：BIO-RAD（Gel DocTM XR+）。

三、使用方法

1、待测样本DNA的提取及PCR扩增

（1）DNA提取：

本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法（酚-氯仿抽提法）或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用凯普生物科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）。若采用凯普生物科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）。直接按说明书操作，若用酚-氯仿抽提法或其他方法提取DNA则要测定DNA浓度，必要时进行浓缩或稀释，将DNA浓缩调整至10～100 ng/µL后才能进行检测实验。

（2）PCR扩增：

设置阴性对照、阳性对照和待测样本三管，阴性对照的PCR扩增模板为实施例1所述的阴性样本基因组DNA，阳性对照的PCR扩增模板为实施例1所述的阳性样本基因组DNA。

按照实施例1所述最佳PCR扩增体系配制各管的PCR反应体系，即10×PCR Buffer2 µL，5× Q-solution 2.8 µL，25 mM MgCl₂ 1.2 µL，25 mM dNTPs 0.32 µL，100 μMFusion gene-F（SEQ ID NO：2）0.08 µL，100 μM Fusion gene-R（SEQ ID NO：3）0.08 µL，灭菌注射水11.32 µL，DNA聚合酶0.2 µL，样品DNA 2 µL。每个管中的体系总量均为20 μL。

按照实施例1所述最佳PCR扩增条件进行反应，即95℃ 15 min；97℃ 50 s、60℃60 s、72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。

2、琼脂糖凝胶电泳法进行检测

（1）配2%胶：称琼脂糖加入1×TAE电泳液，琼脂糖与TAE的质量体积百分比为2%，混匀后在微波炉中加热至无悬浮颗粒。加入Goldview染料（100 μL1×TAE+5μL Goldview）混匀后倒入凝胶板中，室温下待胶冷却凝固。

（2）加样本：10×Loading Buffer（1 μL）+PCR产物（5 μL），吹打混匀后进行点样，同时用DL2000作为DNA Marker（4 μL）。

（3）在电压为150 V，电流为30 mA进行电泳25 min。

（4）分析结果并记录：电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中，打开ImageLab软件，调整胶的位置，运行，调亮度，裁剪胶，输出原始jpg格式图片，加标注（标号、箭头），输出编辑后的jpg格式。

（5）电泳条带与基因型的对应关系如表11所示。

表11电泳条带与基因型的对应关系

（6）、结果判读

融合基因Fusion gene扩增出的条带长度为908 bp，正常基因型无法扩增出该条带。如图2所示，阴性对照无条带，阳性对照有且仅有一条908 bp的条带。如果待测样本没有出现与阳性对照相同的电泳条带，表明待测样本无融合基因Fusion gene；如果电泳结果出现与阳性对照相同的电泳条带，表明待测样本有融合基因Fusion gene。

实施例5 α珠蛋白融合基因检测试剂盒的准确性和特异性

一、实验方法

使用实施例4试剂盒，对120份临床样本DNA进行检测，其中包括76份外周血DNA样本、5份羊水细胞DNA样本、2份绒毛膜DNA样本、37份血斑卡DNA样本，DNA浓度均在10～100ng/μL。120份样本中共包括24例阳性样本，96例阴性样本。

根据本发明实施例4的检测方法，在博日基因扩增仪上PCR扩增，然后进行电泳，对测试品进行检测，其检测结果与金标准的一代测序的结果进行对比，判断准确率和特异性。

二、实验结果

检测结果如表12所示。

表12 120份临床样本检测结果

由检测结果可知，本发明试剂盒检测120份临床样本，其结果与金标准的一代测序结果对比，准确率为100%，阳性符合率和阴性符合率均为100%，特异性为100%。

实施例6 α珠蛋白融合基因检测试剂盒的检测灵敏度

一、实验方法

选用3个不同批次实施例4试剂盒对10份实施例1中的临床阳性样本（编号1～10）进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度（100 ng/μL、80 ng/μL、60 ng/μL、40 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL），每份样本测试20次。

二、实验结果

灵敏度的检测结果如表13所示。注：以下“+”表示各阳性结果的条带亮度程度，“+++”表示条带亮度正常；“++”表示相对较弱。“-”表示完全没有条带。

表13 灵敏度的实验结果

如上表所示结果，在设计的7个浓度梯度中，浓度为100 ng/μL、80 ng/μL、60 ng/μL、40 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL的样本结果电泳条带亮度正常清晰，准确率为100%；而5ng/μL的样本部分结果电泳条带亮度较弱，甚至没有条带，准确率为95%，因此本试剂盒确定能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10 ng/μL。

实施例7 α珠蛋白融合基因检测试剂盒的重复性

一、实验方法

选用3个不同批次的实施例4的试剂盒，选用浓度分别为30 ng/μL、20 ng/μL、10ng/μL的实施例1中的阴性样本及阳性样本作为参考品，选用不同人（2人：甲/乙）进行操作，一天做2次，共做2天，每个试验每个参考品重复3次检测。

二、实验结果

重复性实验结果如表14所示。

表14重复性实验结果

如上表结果显示，在不同实验条件下不同的操作者能多次重复稳定地检测α-地中海贫血基因型，结果显示一致，说明本试剂盒具有很好的重复性，能够稳定地检出融合基因Fusion gene。

实施例8 α-地中海贫血基因多重PCR检测试剂盒的构建

一、多重PCR引物的设计与筛选

针对其他类型α-地中海贫血相关基因设计引物，与SEQ ID NO：2～3所示融合基因Fusion gene的引物对进行组合使用，开发多重PCR方案。

利用Gap-PCR原理，在α珠蛋白基因的缺失片段两端设计一对引物，正常情况下这种引物的扩增产物很长，超出了PCR扩增的范围，不能扩增出目的片段，而只有当存在缺失片段的时候才能出现特异性的扩增条带。

（1）检测东南亚缺失型α-地中海贫血的引物

东南亚缺失型α-地中海贫血是由于人的α珠蛋白基因（基因编号为：NG_000006.1）序列的NG_000006.1:g.26264_45564发生断裂缺失造成的，缺失长度为19.301 kb的片段。在缺失片段上游5’端区域NG_000006.1 26064～NG_000006.1 20260位之间设计长度为15～30 bp的PCR上游引物SEA-F；在缺失片段下游3’端区域NG_000006.1 46570～NG_000006.1 46870位之间设计长度为15～30 bp的PCR下游引物SEA-R。

经过大量实验对比筛选得到一组可以检测出东南亚缺失型α-地中海贫血的引物，具体引物序列如下：

SEA-F（SEQ ID NO：4）：AGTTCCTGCCCTGACTCCAA；

SEA-R（SEQ ID NO：5）：CTCACACTCATCACCCAGGCAG。

（2）检测泰国缺失型α-地中海贫血的引物

泰国缺失型α-地中海贫血是由于人的α珠蛋白基因（基因编号为：NG_000006.1）序列的NC_000016.10:g.149863_183312发生断裂缺失造成的，缺失长度为33.449 kb的片段。在缺失片段上游5’端区域NG_000006.1 10600～NG_000006.1 10800位之间设计长度为15～30 bp的PCR上游引物THAI-F；在断裂点下游3’端区域NG_000006.1 44500～NG_000006.144750位之间设计长度为15～30 bp的PCR下游引物THAI-R。

经过大量实验对比筛选得到一组可以检测泰国缺失型α-地中海贫血的引物，具体引物序列如下：

THAI-F（SEQ ID NO：6）：CACGCCTGTAATCCCAGCACT；

THAI-R（SEQ ID NO：7）：GTGCAGATCCAAGGGAGCAGG。

（3）检测-α^3.7缺失型α-地中海贫血的引物

-α^3.7缺失型α-地中海贫血是由于人的α珠蛋白基因（基因编号为：NG_000006.1）序列的NG_000006.1:g.34164_37967发生断裂缺失造成的，缺失长度为3.804 kb的片段。在缺失片段上游5’端区域NG_000006.1 32730～NG_000006.1 32930位之间设计长度为15～30bp的PCR上游引物3.7-F；在缺失片段下游3’端区域NG_000006.1 38400～NG_000006.138600位之间设计长度为15～30 bp的PCR下游引物3.7-R。

经过大量实验对比筛选得到一组可以检测出-α^3.7缺失型α-地中海贫血的引物，具体引物序列如下：

3.7-F（SEQ ID NO：8）：TCCACCCCTTCCTTCCTCA；

3.7-R（SEQ ID NO：9）：CTAGAGTGCTTTGAGGATGC。

（4）检测-α^4.2缺失型α-地中海贫血的引物

同理，-α^4.2-缺失型α-地中海贫血是由于人的α珠蛋白基因发生4.2 kb的片段缺失造成的。在缺失片段上游5’端区域NG_000006.1 30070～NG_000006.1 30210位之间设计长度为15～30 bp的PCR上游引物4.2-F；在缺失片段下游3’端区域NG_000006.1 35910～NG_000006.1 36110位之间设计长度为15～30 bp的PCR下游引物4.2-R。

经过大量实验对比筛选得到一组可以检测出-α^4.2缺失型α-地中海贫血的引物，具体引物序列如下：

4.2-F（SEQ ID NO：10）：GCTAGAGCATTGGTGGTCATG；

4.2-R（SEQ ID NO：11）：TGCCCAAGGCAGCTTACCCTGG。

二、多重PCR引物的组合筛选

将筛选到的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的SEA-F/SEA-R引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的THAI-F/THAI-R引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示的3.7-F/3.7-R引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO：10～11所示的4.2-F/4.2-R引物对，分别与核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的融合基因Fusion gene-F/Fusion gene-R的引物对进行组合使用。

（1）PCR扩增：

按照实施例1所述最佳PCR扩增体系配制各管的PCR反应体系，即10× PCR Buffer2 µL，5× Q-solution 2.8 µL，25 mM MgCl₂ 1.2 µL，25 mM dNTPs 0.32 µL，100 μMFusion gene-F（SEQ ID NO：2）0.08 µL，100 μM Fusion gene-R（SEQ ID NO：3）0.08 µL，100 μM上述筛选到上游引物SEA-F（SEQ ID NO：4）/THAI-F（SEQ ID NO：6）/3.7-F（SEQ IDNO：8）/4.2-F（SEQ ID NO：10）0.08 µL，100 μM上述筛选到下游引物SEA-R（SEQ ID NO：4）/THAI-R（SEQ ID NO：6）/3.7-R（SEQ ID NO：8）/4.2-R（SEQ ID NO：10）0.08 µL，灭菌注射水11.16 µL，DNA聚合酶0.2 µL，样品DNA 2 µL。每个管中的体系总量均为20 μL。

按照实施例1所述最佳PCR扩增条件进行反应，即95℃ 15 min；97℃ 50 s、60℃60 s、72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。

（2）琼脂糖凝胶电泳法检测：

按照实施例1所述用琼脂糖凝胶电泳法进行检测与分析。

（3）筛选结果：

经过筛选，共得到两组可与SEQ ID NO：2～3所示引物组搭配使用的多重PCR引物组：

引物组1包括：（1）核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的Fusion gene-F/Fusiongene-R；（2）核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的SEA-F/SEA-R；

引物组2包括：（1）核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的Fusion gene-F/Fusiongene-R：序列如SEQ ID NO：2～3所示；（2）核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的THAI-F/THAI-R。

三、一种α-地中海贫血基因多重PCR检测试剂盒：

（一）多重PCR同时检测α珠蛋白融合基因及东南亚型α珠蛋白基因缺失的试剂盒

（1）组成：

试剂盒主要成分如表15所示。

表15同时检测α珠蛋白融合基因及东南亚型α珠蛋白基因缺失的试剂盒主要成分

（2）适用仪器：

PCR基因扩增仪：如博日PCR仪TC-96/G/H(b)、ABI 2720 PCR仪等；电泳仪：双稳定时电泳仪电源（DYY-6C）；凝胶成像系统：BIO-RAD（Gel DocTM XR+）。

（3）试剂盒的使用方法：

1、待测样本DNA的提取及PCR扩增

①按照实施例4的方法提取待测样本DNA。

②PCR扩增：

设置阴性对照、阳性对照和待测样本三管，阴性对照的PCR扩增模板为实施例1所述的阴性样本基因组DNA，融合基因阳性对照的PCR扩增模板为实施例1所述的阳性样本基因组DNA，东南亚型α珠蛋白基因缺失的阳性对照的PCR扩增模板来源于广州凯普医学检验所临床诊断基因型为--^SEA/αα、β^N/β^N的人群的静脉血，融合基因Fusion gene复合东南亚型α珠蛋白基因缺失阳性对照PCR扩增模板来源于广州凯普医学检验所临床诊断基因型为--^SEA/Fusion gene、β^N/β^N的人群的静脉血。

按照实施例1所述最佳PCR扩增体系配制各管的PCR反应体系，即10× PCR Buffer2 µL，5× Q-solution 2.8 µL，25 mM MgCl₂ 1.2 µL，25 mM dNTPs 0.32 µL，100 μMFusion gene-F（SEQ ID NO：2）0.08 µL，100 μM Fusion gene-R（SEQ ID NO：3）0.08 µL，100 μM SEA-F（SEQ ID NO：4）0.08 µL，100 μM SEA-R（SEQ ID NO：5）0.08 µL，灭菌注射水11.16 µL，DNA聚合酶0.2 µL，样品DNA 2 µL。每个管中的体系总量均为20 μL。

按照实施例1所述最佳PCR扩增条件进行反应，即95℃ 15 min；97℃ 50 s、60℃60 s、72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。

2、按照实施例4的方法进行琼脂糖凝胶电泳法检测

电泳条带与基因型的对应关系如表16所示。

表16电泳条带与基因型的对应关系

结果判读：融合基因Fusion gene扩增长度为909 bp，东南亚缺失扩增长度为1600bp，正常基因型无法扩增出这两条条带。如图3所示，阴性对照无条带，融合基因Fusiongene的阳性对照有且仅有一条908 bp的条带，东南亚型α珠蛋白基因缺失的阳性对照有且仅有一条1600 bp的条带，融合基因Fusion gene复合东南亚型α珠蛋白基因缺失的阳性对照有一条908 bp的条带和一条1600 bp的条带。如果电泳结果没有出现条带，表明检测样本无融合基因Fusion gene也无东南亚型α珠蛋白基因缺失；如果电泳结果仅出现一条908 bp的条带，表明检测样本有融合基因Fusion gene但没有东南亚型α珠蛋白基因缺失；如果电泳结果仅出现一条1600 bp的条带，表明检测样本有东南亚型α珠蛋白基因缺失但没有融合基因Fusion gene；如果电泳结果既有一条908 bp的条带又出现一条1600 bp的条带，表明检测样本既有融合基因Fusion gene又复合有东南亚型α珠蛋白基因缺失。

（二）多重PCR同时检测α珠蛋白融合基因及泰国型α珠蛋白基因缺失的试剂盒

（1）组成：

试剂盒主要成分如表17所示。

表17同时检测α珠蛋白融合基因及泰国型α珠蛋白基因缺失的试剂盒主要成分

（2）适用仪器：

PCR基因扩增仪：如博日PCR仪TC-96/G/H(b)、ABI 2720 PCR仪等；电泳仪：双稳定时电泳仪电源（DYY-6C）；凝胶成像系统：BIO-RAD（Gel DocTM XR+）。

（3）试剂盒的使用方法：

1、待测样本DNA的提取及PCR扩增

①按照实施例4的方法提取待测样本DNA。

②PCR扩增：

设置阴性对照、阳性对照和待测样本三管，阴性对照的PCR扩增模板为实施例1所述的阴性样本基因组DNA，融合基因阳性对照的PCR扩增模板为实施例1所述的阳性样本基因组DNA，泰国型α珠蛋白基因缺失阳性对照的PCR扩增模板来源于广州凯普医学检验所临床诊断基因型为--^THAI/αα、β^N/β^N的人群的静脉血，融合基因Fusion gene复合泰国型α珠蛋白基因缺失阳性对照PCR扩增模板来源于广州凯普医学检验所临床诊断基因型为--^THAI/Fusion gene、β^N/β^N的人群的静脉血。

按照实施例1所述最佳PCR扩增体系配制各管的PCR反应体系，即10× PCR Buffer2 µL，5× Q-solution 2.8 µL，25 mM MgCl₂ 1.2 µL，25 mM dNTPs 0.32 µL，100 μMFusion gene-F（SEQ ID NO：2）0.08 µL，100 μM Fusion gene-R（SEQ ID NO：3）0.08 µL，100 μM THAI-F（SEQ ID NO：6）0.08 µL，100 μM THAI-R（SEQ ID NO：7）0.08 µL，灭菌注射水11.16 µL，DNA聚合酶0.2 µL，样品DNA 2 µL。每个管中的体系总量均为20 μL。

按照实施例1所述最佳PCR扩增条件进行反应，即95℃ 15 min；97℃ 50 s、60℃60 s、72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。

2、按照实施例4的方法进行琼脂糖凝胶电泳法检测

电泳条带与基因型的对应关系如表18所示。

表18电泳条带与基因型的对应关系

结果判读：融合基因Fusion gene扩增长度为909 bp，东南亚缺失扩增长度为202bp，正常基因型无法扩增出这两条条带。如图4所示，阴性对照无条带，融合基因Fusiongene的阳性对照有且仅有一条908 bp的条带，泰国型α珠蛋白基因缺失的阳性对照有且仅有一条202 bp的条带，融合基因Fusion gene复合泰国型α珠蛋白基因缺失的阳性对照有一条908 bp的条带和一条202 bp的条带。如果电泳结果没有出现条带，表明检测样本无融合基因Fusion gene也无泰国型α珠蛋白基因缺失；如果电泳结果仅出现一条908 bp的条带，表明检测样本有融合基因Fusion gene但没有泰国型α珠蛋白基因缺失；如果电泳结果仅出现一条202 bp的条带，表明检测样本有泰国型α珠蛋白基因缺失但没有融合基因Fusiongene；如果电泳结果即出现一条908 bp的条带又出现一条202 bp的条带，表明检测样本既有融合基因Fusion gene又有泰国型α珠蛋白基因缺失。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广州凯普医药科技有限公司

广东凯普生物科技股份有限公司

潮州凯普生物化学有限公司

<120> 一种α-地中海贫血相关基因的检测试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 908

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cagccaatga gcgccgcccg gccgggcgtg cccccgcgcc ccaagcataa accctggcgc 60

gctcgcgggc cggcactctt ctggtcccca cagactcaga gagaacccac catggtgctg 120

tctcctgccg acaagaccaa cgtcaaggcc gcctggggta aggtcggcgc gcacgctggc 180

gagtatggtg cggaggccct ggagaggtga ggctccctcc cctgctccga cccgggctcc 240

tcgcccgccc ggacccacag gccaccctca accgtcctgg ccccggaccc aaaccccacc 300

cctcactctg cttctccccg caggatgttc ctgtccttcc ccaccaccaa gacctacttc 360

ccgcacttcg acctgagcca cggctctgcc caggttaagg gccacggcaa gaaggtggcc 420

gacgcgctga ccaacgccgt ggcgcacgtg gacgacatgc ccaacgcgct gtccgccctg 480

agcgacctgc acgcgcacaa gcttcgggtg gacccggtca acttcaaggt gagcggcggg 540

ccgggagcga tctgggtcga ggggcgagat ggcgccttcc tctcagggca gaggatcacg 600

cgggttgcgg gaggtgtagc gcaggcggcg gctgcgggcc tgggccgcac tgaccctctt 660

ctctgcacag ctcctaagcc actgcctgct ggtgaccctg gccgcccacc tccccgccga 720

gttcacccct gcggtgcacg cctccctgga caagttcctg gcttctgtga gcaccgtgct 780

gacctccaaa taccgttaag ctggagcctc ggtagccgtt cctcctgccc gctgggcctc 840

ccaacgggcc ctcctcccct ccctgcccca gcacttcctg atctttgaat gaagtccgag 900

taggcagc 908

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cagccaatga gcgccgcccg gccgg 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gctgcctact cggacttcat t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

agttcctgcc ctgactccaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

ctcacactca tcacccaggc ag 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

cacgcctgta atcccagcac t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

gtgcagatcc aagggagcag g 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

tccacccctt ccttcctca 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

ctagagtgct ttgaggatgc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

gctagagcat tggtggtcat g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

tgcccaaggc agcttaccct gg 22

Claims (10)

1.一种用于检测α-地中海贫血相关基因的引物组，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQID NO：2～3所示的引物。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包含核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的引物。

3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包含核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示的引物。

4.一种用于检测α-地中海贫血相关基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应试剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系中，每条引物的浓度均为0.1～1μM。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系中，样品DNA的浓度为5～100 ng/μL。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系中，dNTPs的浓度为100～500μM，所述PCR反应试剂的反应体系中，MgCl₂的浓度为1.0～5.0 mM，DNA聚合酶的浓度为0.5U～4.0U/反应。

9.根据权利要求4～8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系中，样品DNA的浓度为10～100 ng/μL，每条引物的浓度均为0.4 μM，MgCl₂的浓度为1.5 mM，dNTPs的浓度为400 μM，DNA聚合酶的浓度为1 U/反应。

10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR反应程序为：95°C 15 min；97°C变性30～60 s、55～65°C退火30～70 s、72°C延伸1～3 min，共35～40个循环；72°C延伸10min。

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