CN113755568A - 利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂盒及应用 - Google Patents

利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂盒及应用。该引物探针如SEQ ID NO.1～4所示。本发明实现了利用一对引物和两条探针就可检测出所有α珠蛋白基因拷贝数缺失和重复类型，且能保证较高的有效液滴数生成，从而保证结果的准确性和稳定性。本发明不需要细胞培养，所需样本量少；检测周期短，整个检测过程可以在4个小时内完成；自动化程度高，重复性好，操作简单；具有灵敏度高、准确度高以及通量高等特点。

Description

利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂 盒及应用
技术领域
本发明涉及一种检测α珠蛋白拷贝数的方法，特别涉及一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂盒及应用。
背景技术
地中海贫血是我国南方各省发病率最高、影响最大的遗传病，我省育龄人群中α地中海贫血的基因携带率为11.31％，β地中海贫血的基因携带率为4.53％。α珠蛋白基因拷贝数变异包括α基因重复和α基因缺失，地中海贫血的临床表型与α珠蛋白基因拷贝数密切相关，α基因缺失会导致α地贫，而α基因重复合并β基因杂合突变时会导致中间型β地贫。绝大多数α地贫是由于α基因缺失所致，目前已报道的α基因缺失类型超过30种，而目前市面上的试剂盒通常只检测3种缺失类型，其他类型的α基因缺失会漏诊，建立α珠蛋白基因拷贝数变异的检测方法可以避免少见缺失型α地贫的漏诊。除此之外，对于育龄夫妇，如果一方为β地贫携带者，另外一方存在α基因重复，他们有1/4的机会生育中间型β地贫的患儿，因此，在进行孕前或产前检查时，如果检测到一方为β地贫携带者，就非常有必要获知配偶α珠蛋白基因拷贝数的情况，临床迫切需要一种检测α基因拷贝数变异的准确、快速、高通量的方法。
目前，用于α珠蛋白基因拷贝数变异检测的方法主要有多重PCR、多重连接探针扩增(MLPA)、实时荧光定量PCR等，但这些方法都存在一定的局限性。多重PCR方法成本较低，对仪器设备要求不高，但是都是有限范围特定重复或缺失类型的检测，α珠蛋白基因拷贝数变异类型复杂多样，多重gap-PCR方法必然会导致漏诊。MLPA操作繁琐、耗时长、设备要求高、成本高，主要用于个案未知类型的拷贝数变异检测和基因型的确认，不适合作为分子筛查方法大范围推广应用。荧光定量PCR需要建立标准曲线和Ct值进行拷贝数定量分析，不是直接定量，且荧光定量PCR在高拷贝数时准确性明显下降，也限制了该方法的应用。二代测序技术对于设备、人员要求高，成本高，目前不适合作为临床一线的筛查方法进行推广。
微滴数字PCR不需要依赖Ct值和标准曲线就可以直接计算目标基因的拷贝数，进行精确的绝对定量。拷贝数评估的的主要技术瓶颈是如何在统计置信度下有效区分连续的拷贝数，微滴数字PCR通过在成千上万个微滴中进行CNV特定片段的扩增反应，实现在可靠置信度下，对更高连续拷贝数(例如5或6)的区分。微滴数字PCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性等优点，除此之外，微滴数字PCR操作简单、通量高，适合在临床推广应用。近年来，微滴数字PCR在肿瘤基因检测、无创产前基因检测和目标基因拷贝数变异检测等方面被广泛应用。
2013年泰国的学者建立了微滴数字PCR检测东南亚型α缺失的方法，把微滴数字PCR方法应用到地中海贫血的基因检测，但是该方法只能检测一种类型的缺失，限制了临床应用。2016年马来西亚的学者建立了微滴数字PCR检测三联体和缺失的方法，证实微滴数字PCR是一种检测缺失和三联体的准确、快速的方法，检测结果稳定可靠，但是该方法检测一例样品需要同时进行4个PCR反应，在一定程度上降低了检测的通量且增加了检测成本。目前国内仅南方医科大学周万军教授团队在2017年建立了应用微滴数字PCR检测αααanti3.7的方法，但是该方法仅能检测一种类型的三联体，不能满足临床需要。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针。
本发明的另一目的在于提供一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供上述引物探针、试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针，包括检测引物对，检测探针；
检测引物对如下：
HBA-2上游引物：5’-GGTTGCGGGAGGTGTAGC-3’；
HBA-2下游引物：5’-GTGGCTTAGGAGCTGTGCAG-3’；
检测探针如下：
HBA1 Probe：5’-FAM-CCCTCGGCCCCACTGACCCTCTT-BHQ1-3’；
HBA2 Probe：5’-FAM-CCTGGGCCGCACTGACCCTCTTC-BHQ1-3’。
上述利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针，还包括内参基因的上游引物、内参基因的下游引物和内参基因的探针；内参基因的上游引物、内参基因的下游引物和内参基因的探针的作用是做为标准，用于对检测引物和检测探针得到的结果进行定量。
所述的内参基因优选为RPP30基因。
所述的内参基因的上游引物优选如下：
RPP30上游引物：5’-GATTTGGACCTGCGAGC-3’。
所述的内参基因的下游引物优选如下：
RPP30下游引物：5’-GGTTGGCCAGGCGCGAAG-3’。
所述的内参基因的探针优选如下：
RPP30 Probe：5’-VIC-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-3’。
一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的试剂盒，包括上述利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针。
所述的试剂盒还包括用于PCR的酶、dNTP和用于PCR的超纯水中的至少一种；更优选为包括含有用于PCR的酶和dNTP的预混液。
所述的含有用于PCR的酶和dNTP的预混液优选为2×ddPCR supermix for probe(no dUTP)。
所述的试剂盒中的各成分反应时的终浓度优选如下：HBA-2上游引物250nM、HBA-2下游引物250nM、HBA1 probe 250nM、HBA2 probe 250nM、1×ddPCR supermix for probe(no dUTP)。
所述的RPP30上游引物和RPP30下游引物在反应时的终浓度优选为250nM。
所述的RPP30 probe在反应时的终浓度优选为250nM。
上述引物探针或上述试剂盒可在非诊断和治疗目的的检测α珠蛋白基因拷贝数中的应用，如用于研究地贫机理；优选包括以下步骤：
(1)对待测样本提取基因组DNA；
(2)使用上述引物探针或上述试剂盒中的引物探针对HBA基因进行PCR扩增；特异性引物和荧光标记的探针对HBA基因进行PCR扩增，扩增的区域是位于HBA1基因转录起始位点下游+529bp-+615bp和HBA2：+529bp-+608bp；HBA1和HBA2具有高度同源性，但在该区域内两者存在几个碱基的区别，HBA1是CTCGGCCC，而HBA2在此处是G，根据这个特点设计分别针对HBA1和HBA2的探针；采用内参基因计算拷贝数；
(3)将步骤(2)得到的荧光标记的PCR产物放入微滴分析仪，分析每个样品的微滴的荧光信号；拷贝数计算方法如下：目的基因拷贝数＝(目的基因浓度值/参考基因浓度值)×内参基因拷贝数；内参基因拷贝数为2；目的基因拷贝数为0时，检测出来的拷贝数值为0；拷贝数值在0.6-1.3之间，则认为拷贝数为1；拷贝数值在1.5-2.2之间，则认为拷贝数为2；拷贝数值在2.5-3.2之间，则认为拷贝数为3；拷贝数值在3.5-4.2之间，则认为拷贝数为4；以此类推；介于这些区间的值无法判断时，则需重新进行实验。
上述应用还包括如下步骤：(4)对步骤(3)得到的结果进行评判。
步骤(2)中所述的PCR的扩增体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003231112380000031
步骤(2)中所述的PCR的扩增条件为：25℃3min，95℃10min；94℃30s、61℃30s、40个循环；98℃10min，4℃保存。整个过程温度升降速率设定为2℃/s。
步骤(3)中所述的液滴分析操作条件为Bio-rad QX200微滴式数字PCR用户标准操作程序。
根据拷贝数检测结果评判缺失或重复类型，中国南方地区常见的α缺失类型主要有东南亚型(--SEA)，3.7(-α3.7)和4.2(-α4.2)缺失，较罕见的香港型(HKαα)；α重复主要有三联体或者四联体。综合HBA1和HBA2的拷贝数进行缺失或重复类型的评判。步骤(4)中所述的评判的标准如表2所示：
表2 基因型拷贝数汇总
Figure BDA0003231112380000041
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用一对引物和两条探针就可检测出所有α珠蛋白基因拷贝数缺失和重复类型。且能保证较高的有效液滴数生成，从而保证结果的准确性和稳定性。
(2)本发明不需要细胞培养，所需样本量少，绒毛、羊水、脐血和外周血样品都可检测；检测周期短，整个检测过程可以在4个小时内完成。
(3)本发明借助于Bio-rad微滴数字PCR系统进行结果分析，自动化程度高，重复性好，操作简单。
(4)本发明具有灵敏度高、准确度高以及通量高等特点，适合在临床推广使用。
(5)本发明针对α珠蛋白基因设计引物和探针，可直接检测α珠蛋白基因拷贝数变异，实现初筛的目的。
附图说明
图1是不同的引物进行微滴数字PCR得到的结果图。
图2是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，正常人HBA1和HBA2基因拷贝数均为2。
图3是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为--SEA/αα的样本HBA1和HBA2的拷贝数均为1。
图4是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为--SEA/--SEA的样本HBA1和HBA2的拷贝数均为0。
图5是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为-α3.7/αα的样本HBA1的拷贝数为2，HBA2的拷贝数为1。
图6是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为--SEA/-α3.7的样本HBA1的拷贝数为1，HBA2的拷贝数为0。
图7是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为-α3.7/-α4.2的样本HBA1的拷贝数为2，HBA2的拷贝数为0。
图8是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为αααanti4.2/αα的样本HBA1的拷贝数为2，HBA2的拷贝数为3。
图9是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，基因型为HKαα/--SEA的样本HBA1和HBA2的拷贝数均为1。
图10是待检样本为模板进行微滴数字PCR得到的结果图；其中，16号染色体三体的样本HBA1和HBA2的拷贝数均为3。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
对孕妇的羊水样品进行检测，具体步骤如下：
(1)提取人基因组DNA：将羊水样本放入离心机，2000rpm离心5分钟；将标本上清倒入玻璃管中，剩下大概200μL沉淀，用带有滤芯的枪头吸取到1.5mL干净的离心管中准备提取DNA。采用DNA提取试剂盒(740951.250,MACHEREY-NAGEL,German)进行DNA提取获取基因组DNA。DNA浓度在4-30ng/μL之间，因数字PCR具有超高的灵敏度，对模板量要求不高，故浓度不宜过高。
(2)引物和探针的设计及优化：
1)在以往研究中，一般会将引物设计在基因侧翼区域，这种设计存在一个缺点就是如果要检测多种拷贝数变异，则需要多对引物和探针以及多个反应才能实现。而在本发明中为了实现一对引物便可涵盖所有的α-珠蛋白基因，我们将引物设计的范围控制在α-珠蛋白基因上，因为HBA1和HBA2具有高度同源性，所以可通过一对引物将HBA1和HBA2扩增出来。但要区分HBA1和HBA2的拷贝数变异，则需要利用探针的特异性。为了实现这一目的，我们在HBA的第二个内含子区+119位置发现HBA1和HBA2在此区域存在几个碱基的差异，HBA1是CTCGGCCC，而HBA2在此处是G，根据这个特点设计分别针对HBA1和HBA2的探针。HBA1探针序列包含CTCGGCCC，而HBA2探针包含G，根据探针的高度特异性特点，HBA1探针只会结合HBA1，而HBA2探针只能结合HBA2，这样便可实现HBA1和HBA2的区分。而刚好引物也可在这附近设计，如此便能实现只利用一对引物和两条探针便可覆盖所有的α-珠蛋白基因拷贝数变异的检测，不但提高了检测通量，且有效节约了检测成本。因此我们在此区域设计了三对备选引物，备选引物和探针见表3。引物和探针合成后，通过温度梯度PCR进行引物条件的优化，通过琼脂糖凝胶电泳最后确定最佳退火温度是61℃。随后利用荧光定量PCR进行引物和探针浓度的优化，根据扩增效率最后确定引物和探针的最优终浓度均为250nM。
表3 备选的引物和探针
Figure BDA0003231112380000061
表中的HBA、HBA-2和HBA-3均表示用于扩增HBA1和HBA2的备选引物。
2)虽然三对引物均可以特异性扩增HBA1和HBA2，但为了实现对整个数字PCR过程的优化，包括PCR反应时间、液滴数生成等，我们比较了三种PCR产物片段大小是否会影响有效液滴数的生成。在三个反应中分别加入三对引物，以RPP30作为内参，DNA模板为已经通过常规方法验证的--SEA/αα的羊水标本，其他操作保持一致(反应体系参考表4，PCR反应过程参见第(4)点)。结果表明，PCR产物大于200bp时，生成的有效液滴数大约为8000，PCR产物大小为179bp的有效液滴数大约在12000，而87bp的有效液滴数可以达到16000(如图1所示)，这个结果提示我们PCR产物片段大小需要控制在100bp以内才能达到较理想的有效液滴数，造成这种结果可能是因为片段太大不利于液滴里的动态反应。因此，我们最后选定了PCR产物为87bp的引物HBA-2，PCR延伸时间也缩短为30秒，这样不仅保证了有效液滴数的生成从而保证结果的准确性和稳定性，也缩短了PCR反应时间，节约了时间成本。
(3)使用上述特异性引物和荧光标记的探针对HBA基因进行PCR扩增，优化的扩增体系如下表4所示，DNA模板稀释10倍之后取0.5μL。
表4 优化的PCR反应体系
Figure BDA0003231112380000062
(4)在进行PCR反应之前需按照Bio-rad QX200微滴式PCR标准操作流程进行液滴发生反应，将产生的微滴转移至干净的200μl PCR管中，转移过程需轻柔，切勿吹打。随后进行PCR反应，PCR反应条件为：25℃3min，95℃10min；94℃30s、61℃30s，40个循环；98℃10min，4℃保存。整个过程温度升降速率设定为2℃/s。
(5)将PCR产物放置微滴读取仪中进行产物分析，按照Bio-rad QX200标准操作流程进行。
(6)结果判断标准：
拷贝数计算方法如下：目的基因拷贝数＝(目的基因浓度值/参考基因浓度值)×内参基因RPP30拷贝数。RPP30拷贝数默认为2。目的基因拷贝数为0时，检测出来的拷贝数值为0；拷贝数值在0.6-1.3之间，则认为拷贝数为1；拷贝数值在1.5-2.2之间，则认为拷贝数为2；拷贝数值在2.5-3.2之间，则认为拷贝数为3；拷贝数值在3.5-4.2之间，则认为拷贝数为4；以此类推。介于这些区间之间的值无法判断时，则需重新进行实验。
检测结果：
①正常人的结果如图2所示，HBA1和HBA2的拷贝数均为2。
②--SEA/αα基因型的结果如图3所示，HBA1的拷贝数约为1(0.86±0.17)，HBA2的拷贝数约为1(0.86±0.16)。
③--SEA/--SEA基因型的结果如图4所示，HBA1的拷贝数为0(0.01±0.00)，HBA2的拷贝数为0(0.01±0.01)。
④-α3.7/αα基因型的结果如图5所示，HBA1的拷贝数约为2(1.75±0.19)，HBA2的拷贝数约为1(0.97±0.33)。
⑤--SEA/-α3.7和--SEA/-α4.2基因型的结果如图6所示，HBA1的拷贝数约为1(0.88±0.14)HBA2的拷贝数为0(0.02±0.02)。
⑥-α3.7/-α4.2基因型的结果如图7所示，HBA1的拷贝数约为2(2.03±0.22)，HBA2的拷贝数为0(0.03±0.02)。
⑦αααanti4.2/αα基因型的结果如图8所示，HBA1的拷贝数约为2(2.11±0.12)，HBA2的拷贝数为3(2.56±0.36)。
⑧HKαα/--SEA基因型的结果如图9所示，HBA1的拷贝数约为1，HBA2的拷贝数为1。
⑨16号染色体三体的结果如图10所示，HBA1的拷贝数约为3(2.91±0.21)，HBA2的拷贝数为3(2.75±0.45)。
经验证，本发明所述的方法准确率高达100％，且对多拷贝的检出灵敏度高，可见，本发明所述的方法能快速定量α珠蛋白基因拷贝数，准确率高，方便快捷，且只需要两个反应就能覆盖所有α-珠蛋白基因拷贝数变异的检测，这个优势使得其能大规模进行筛查，对我国的地贫防控和出生缺陷防控具有重大意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省妇幼保健院
<120> 利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂盒及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA-2上游引物
<400> 1
ggttgcggga ggtgtagc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA-2下游引物
<400> 2
gtggcttagg agctgtgcag 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA1 Probe
<220>
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<220>
<222> (23)..(23)
<223> BHQ1修饰
<400> 3
ccctcggccc cactgaccct ctt 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA2 Probe
<220>
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<220>
<222> (23)..(23)
<223> BHQ1修饰
<400> 4
cctgggccgc actgaccctc ttc 23
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RPP30上游引物
<400> 5
gatttggacc tgcgagc 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RPP30下游引物
<400> 6
ggttggccag gcgcgaag 18
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RPP30 Probe
<220>
<222> (1)..(1)
<223> VIC修饰
<220>
<222> (1)..(1)
<223> MGB修饰
<400> 7
ctgacctgaa ggctct 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA上游引物
<400> 8
ggttgcggga ggtgtagc 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA下游引物
<400> 9
gtgctcacag aagccaggaa c 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA-3上游引物
<400> 10
gagcgatctg ggtcgagg 18
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBA-3下游引物
<400> 11
gtgctcacag aagccaggaa c 21

Claims (10)

1.一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针，其特征在于：包括检测引物对，检测探针；
检测引物对如下：
HBA-2上游引物：5’-GGTTGCGGGAGGTGTAGC-3’；
HBA-2下游引物：5’-GTGGCTTAGGAGCTGTGCAG-3’；
检测探针如下：
HBA1 Probe：5’-FAM-CCCTCGGCCCCACTGACCCTCTT-BHQ1-3’；
HBA2 Probe：5’-FAM-CCTGGGCCGCACTGACCCTCTTC-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针，其特征在于：还包括内参基因的上游引物、内参基因的下游引物和内参基因的探针。
3.根据权利要求2所述的利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针，其特征在于：所述的内参基因为RPP30基因。
4.根据权利要求3所述的利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针，其特征在于：所述的内参基因的上游引物如下：
RPP30上游引物：5’-GATTTGGACCTGCGAGC-3’；
所述的内参基因的下游引物如下：
RPP30下游引物：5’-GGTTGGCCAGGCGCGAAG-3’；
所述的内参基因的探针如下：
RPP30 Probe：5’-VIC-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-3’。
5.一种利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～4任一项所述的利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括用于PCR的酶、dNTP和用于PCR的超纯水中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：包括2×不含dUTP的ddPCR supermixfor probe。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中的各成分反应时的终浓度如下：HBA-2上游引物250nM、HBA-2下游引物250nM、HBA1 probe 250nM、HBA2 probe250nM、1×不含dUTP的ddPCR supermix for probe。
9.权利要求1～4任一项所述的引物探针或权利要求5～8任一项所述的试剂盒在非诊断和治疗目的的检测α珠蛋白基因拷贝数中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)对待测样本提取基因组DNA；
(2)使用上述引物探针或上述试剂盒中的引物探针对HBA基因进行PCR扩增；特异性引物和荧光标记的探针对HBA基因进行PCR扩增，扩增的区域是位于HBA1基因转录起始位点下游+529bp-+615bp和HBA2：+529bp-+608bp；HBA1和HBA2具有高度同源性，但在该区域内两者存在几个碱基的区别，HBA1是CTCGGCCC，而HBA2在此处是G，根据这个特点设计分别针对HBA1和HBA2的探针；采用内参基因计算拷贝数；
(3)将步骤(2)得到的荧光标记的PCR产物放入微滴分析仪，分析每个样品的微滴的荧光信号；拷贝数计算方法如下：目的基因拷贝数＝(目的基因浓度值/参考基因浓度值)×内参基因拷贝数；内参基因拷贝数为2；目的基因拷贝数为0时，检测出来的拷贝数值为0；拷贝数值在0.6-1.3之间，则认为拷贝数为1；拷贝数值在1.5-2.2之间，则认为拷贝数为2；拷贝数值在2.5-3.2之间，则认为拷贝数为3；拷贝数值在3.5-4.2之间，则认为拷贝数为4；以此类推；介于这些区间的值无法判断时，则需重新进行实验。
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