CN112029850A - 检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测地中海贫血基因的引物对和探针,包括β‑地中海贫血CD41/42和α‑地中海贫血‑SEA的引物对及探针;所述β‑地中海贫血CD41/42的引物对为序列1和序列2,探针为序列3和序列4;所述α‑地中海贫血‑SEA的引物对为序列5和序列6或者序列5和序列7,探针为序列8和序列9;本发明还提供检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,包括以下步骤:S1收集样品并提取DNA;S2利用一种引物对和探针进行扩增反应;S3检测荧光强度,确定基因型;S4利用另外一种引物对和探针重复上述过程;本发明的有益效果是:通过设计的引物对及探针,和同种两类引物对,增强荧光检测准确性;通过采提取孕妇血浆和囊胚培养基的游离DNA,实现快速准确无害检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体是检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法。
背景技术
地中海贫血是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病,包括α地中海贫血和β地中海还贫血两种。我国以南方地区多见,尤以广东、广西和海南最多,是长江以南各省份发病率最高,影响最大的单基因疾病。我们将研究重点放在最常见的突变上,β-地中海贫血中的β-珠蛋白基因的突变即密码子41/42处的四个核苷酸(–CTTT)缺失,HBB:c.126delcttt(CD41/42)。CD41/42突变在中国广西、广东、海南和四川等地的所有β地中海贫血突变中发病率最高,分别占所有β地中海贫血等位基因的36.4%、42.5%、73.7%和33.33%。α-地中海贫血中的α-珠蛋白的SEA-缺失突变,SEA缺失突变占所有α-地中海贫血突变中的最高比例,约为68.06%。目前地贫尚无有效的治疗方法,重度α地贫儿一般在出生的24~48小时之内死亡,重度β地贫儿和部分中间型α地贫儿在出生后3-6个月开始出现贫血症状并进行性加重,严重者必须依靠输血和联合铁螯合剂的长期治疗,但治疗价格昂贵,而骨髓移植又需要严格的供体,因此目前并没有理想的治疗方法。地中海贫血的防治工作十分重要,故在地贫高发地区对夫妻双方携带同种地贫基因的孕妇进行产前诊断是预防重度患儿出生的首选方法。而地中海贫血的常规产前诊断采用羊膜穿刺术或绒毛膜取样(CVS),这是有创性的,有一定的宫内感染的风险和0.5-1%的流产风险。胚胎地贫基因的检测基于常规卵裂球活检或囊胚滋养层细胞活检取样获得胚胎DNA,活检取样是有创的,会对胚胎造成一定的细胞损伤。人类胚胎活检的长期安全性还没有完全评估,但动物研究表明胚胎活检可能导致表观遗传修饰改变,对胚胎神经和肾上腺发育产生负面影响,同时还可能影响卵巢功能。如何安全、无创、准确、简便,对胎儿或者胚胎进行早期地贫基因检查一直是一个热点问题。母血浆中胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA)结合二代测序技术的无创产前诊断技术检测胎儿非整倍性已广泛应用于临床。胚胎培养基中存在的胎儿游离DNA性质和母血浆中胎儿游离DNA性质,片段大小接近且均是母体DNA和胎儿DNA的混合物。胚胎培养基中胚胎游离DNA结合二代测序技术无创产前诊断技术检测胚胎的非整倍性已经有大量报道,但是准确性范围波动广,无创产前诊断单基因疾病的报道较少,需要更加灵敏准确的技术进行无创产前诊断单基因疾病的检测。
微滴数字PCR(ddPCR)是一种与qPCR不同的全新的定量核酸检测技术,ddPCR中单个核酸分子被分配到体积极小(0.5fL~0.5nL)的油包水微滴中,使大部分微滴中的核酸分子数目为1或0,这允许在1μL的乳化剂中形成大约百万个反应,然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目,再根据泊松分布和阳性比例来计算出样本中的核酸分子数。ddPCR对检测目标的定量无需标准曲线,就可以实现核酸绝对定量分析。相比现有的常规和实时定量PCR,ddPCR的反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力极大地提高,微滴离散技术同时可以规避样品PCR抑制物的影响,从而提高了检测灵敏度。数字PCR能够在复杂样本中进行基因检测,包括石蜡包埋样本、血液、粪便、食品、土壤、淤泥等。ddPCR现在比较多用于转基因食品中检测,但用于单基因疾病的产前诊断上并未见到有应用。数字PCR具有高灵敏度的特点,在野生型基因大量存在的情况下可以精准的检测低含量突变基因,同时具有高精准度的特点,可以精确计算定量目标基因和参照基因,并计算其比值。数字PCR的高灵敏性特点使得将母血浆和胚胎培养基中微量基因捕捉出来成为可能,同时高精准度使得即使在血浆和培养基有大量母体DNA和颗粒细胞污染的情况下能够通过相对突变计量的数学分析方法来分析胎儿和胚胎基因型。数字PCR技术自身的优势能够解决以往无创产前检测技术研究中遇到的瓶颈问题。因此若能将ddPCR应用到单基因疾病产前诊断的检测之中,将提供一种更加安全、无创、准确、简便,能对胎儿或者胚胎进行早期地贫基因检查。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法,以至少达到快速准确无害的检测早期的地中海贫血基因的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
检测地中海贫血基因的引物对和探针,包括β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针;所述的β-地中海贫血CD41/42的引物对为:
HBB上游引物:5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(序列1);
HBB下游引物:5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(序列2);
对应的所述的β-地中海贫血CD41/42的探针为:
野生型β-珠蛋白:VIC-CAGAGGTTCTTTGAGTCCT-MGBNFQ(序列3),
突变CD41/42缺失型:FAM-AGAGGTTGAGTCCTT-MGBNFQ(序列4);
所述的α-地中海贫血-SEA的引物对为:
HBA上游引物:5’-TCGGTCGTCCCCACTGT-3’(序列5);
HBA下游引物Ⅰ:5’-GGACTGCTCCGCTCCAC-3’(序列6);
HBA下游引物Ⅱ:5’-CAGCCTTGAACTCCTGGACTTAA-3’(序列7);
对应的所述的α-地中海贫血-SEA的探针为:
野生型α-珠蛋白:FAM-TCTAGCCCCTGA GCACCG-MGBNFQ(序列8);
突变SEA缺失型:VIC-CTCCAAGTGAACCTCC-MGBNFQ(序列9)。
优选的,为了进一步实现准确测量的目的,所述的HBA下游引物Ⅰ为设计的野生型α-珠蛋白的引物;所述的HBA下游引物Ⅱ为设计的突变SEA缺失型的引物;所述的HBA下游引物Ⅰ与所述的HBA上游引物构成HBA野生型α-珠蛋白的引物对,对应的所述的HBA下游引物Ⅱ与所述的HBA上游引物构成HBA突变SEA缺失型的引物对了;通过采用两个不同的下游引物组成的两种引物对,从而能将正常的DNA和SEA缺失型的DNA能分别被大量扩增,从而与探针结合,产生足够的荧光强度,进而能被准确的检测到。
本发明还提供检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,包括以下步骤:
S1收集包括孕妇外周血浆以及囊胚移植后弃置的囊胚培养基为待检测样品,先将囊胚培养基进行预处理,再分别提取外周血浆和囊胚培养基中的游离DNA;
S2将提取后的DNA按照来源分为血浆中的游离DNA以及囊胚培养基中的游离DNA,采用β-地中海贫血CD41/42的引物对和探针,以血浆的游离DNA以及囊胚培养基的DNA为模板分别进行微滴数字PCR的扩增反应,得到扩增后的产物;
S3将得到的扩增产物进行检测荧光强度,确定基因型;
S4采用α-地中海贫血-SEA的引物对及探针重复上述S2-S3的过程,即为引物对和探针的使用方法。
优选的,为了进一步实现快速准确无害检测的目的,所述的囊胚培养基的预处理,包括以下步骤:
(1)囊胚培养基的裂解
a)取囊胚培养基,冷冻凝固后进行溶解并瞬时离心,得到上清液;
b)在上清液中分别加入裂解液以及裂解酶,混匀,在50℃条件下反应50min后,升温到80℃条件下继续反应10min,降温到4℃并维持,即得到囊胚培养基的裂解产物;
(2)囊胚培养基裂解产物的预扩增
将得到的囊胚培养基的裂解产物进行预扩增反应体系处理,得到预扩增产物,再进行提取囊胚培养基中的游离DNA;所述的预扩增体系包括:Super mix:25μl;上游引物终浓度:45nmol/l;下游引物终浓度:45nmol/l;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃10min;94℃15s,60℃4min,11个循环;99℃10min,和4℃维持;
所述的提取囊胚培养基中的游离DNA包括以下步骤:
a)囊胚培养基预处理后的预扩增产物中加入900μl的ACB裂解缓冲液,冰上孵育5min;
b)将吸附柱插入到QIAvac24 plus上的真空连接器上,在吸附柱上插入开口的20ml的扩管器;
c)将步骤a)所得ACB裂解缓冲液混合物加入到吸附柱的扩管器中,打开真空泵,当所有的裂解液都完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar,小心打开并丢弃扩管器;
d)向含有初步吸附的囊胚培养基DNA的吸附柱中加入600μl缓冲液ACW1,吸附柱管盖敞开,打开真空泵,当ACW1缓冲盐完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar;
e)向含有二次吸附的囊胚培养基DNA的吸附柱中加入750μl缓冲液ACW2,吸附柱管盖敞开,打开真空泵,当ACW2缓冲盐完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar;
f)向含有三次吸附的囊胚培养基DNA的吸附柱中加入750μl 96-100%乙醇溶液,吸附柱管盖敞开,打开真空泵,当乙醇溶液完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar;
g)关闭吸附柱管盖,将吸附柱从真空歧管上拿下,丢弃真空连接器,将吸附柱返给2ml的收集柱里面,14000rpm离心3min;
h)将吸附柱放入新的2ml收集管里面,打开盖子,56℃孵育10min让膜完全干燥;
i)将吸附柱放入干净的1.5ml洗脱管中,丢掉h)步骤中的收集管,小心地加入50μlAVE缓冲液加入到吸附柱膜的中间部位,关闭管盖室温下孵育3min;
j)14000rpm离心1min洗脱吸附柱上的核酸,得到纯化后的囊胚培养基预扩增产物中的游离DNA;
通过采用囊胚培养基的预处理,从而能得到纯化后的囊胚培养基预扩增产物,方便后期的扩增检测,并且没有其他杂质干扰,避免了直接对胎儿或胚胎早期检测的损害,也间接的提高后期荧光强度的检测效果,从而实现快速准确无害检测的目的。
优选的,为了进一步实现快速检测的目的,所述的微滴数字PCR的扩增反应包括血浆游离DNA的扩增反应以及囊胚培养基游离DNA的扩增反应;所述的血浆游离DNA的扩增反应体系包括:模板:6μl;Super mix:25μl;上游引物终浓度:900nmol/l;下游引物终浓度:900nmol/l;探针终浓度:200nmol/l;稳定剂:2μl;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃10min;94℃15s,60℃1min,45个循环;98℃10min,梯度升降温速0.5℃/s,和12℃维持;
优选的,为了进一步实现快速检测的目的,所述的母血浆中游离DNA和囊胚培养基中的游离DNA的扩增反应体系均包括:模板:6μl;Super mix:25μl;上游引物终浓度:900nmol/l;下游引物终浓度:900nmol/l;探针终浓度:200nmol/l;稳定剂:2μl;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃10min;94℃15s,60℃1min,45个循环;98℃10min,梯度升降温速0.5℃/s,和12℃维持;通过采用通用的扩增反应体系,使母血浆中游离DNA和囊胚培养基中的游离DNA均能大量的扩增,从而得到充足的游离DNA片段,进而实现快速检测的目的。
优选的,为了进一步实现检测的准确性,所述的使用方法还包括新生儿中口腔细胞DNA的提取,包括以下步骤:
1)用无菌棉签在新生儿口腔里面轻柔的擦拭脸颊内侧,保证较丰富的唾液粘附与棉签上,采集婴儿口腔脱落细胞样本;
2)截取采集后的棉签端,放入干净的EP管中,加入400μl GA缓冲液和40μl蛋白酶K振荡混匀,得到组织混合液;
3)将得到的组织混合液在56℃放置16-18h,直至组织混合液溶解,弃去棉签,简短离心去除管盖内壁的水珠,得到混合液;
4)在混合液中加入400μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液变清亮后,简短离心以去除管盖内壁的水珠,得到预混液;
5)在预混液中加入400μl无水乙醇,充分振荡混匀15s,出现絮状沉淀,简短离心去除管盖内壁的水珠,得到清凉的沉淀液;
6)将上一步所得沉淀液和絮状沉淀都加入到同一个吸附柱CB3中,同时吸附柱放入收集管中,以12000rpm转速、13400×g离心力离心30s,倒掉废液,并将吸附柱CB3放回收集管中,得到初步吸附DNA;
7)向含有初步吸附的DNA的吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD,以12000rpm、13400×g离心力了离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中,得到二次吸附DNA;
8)向含二次吸附DNA的吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW以12000rpm转速、13400×g离心力离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中,得到三次吸附DNA;
9)重复操作步骤8),得到四次吸附DNA;
10)降含有四次吸附DNA的吸附柱CB3放回收集管中,以12000rpm转速、13400×g离心力离心2min,倒掉废液,随后将吸附柱CB3置于室温放置10-30min,彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液,得到干燥的吸附柱CB3;
11)将干燥的吸附柱CB3转入干净的离心管中,向吸附柱CB3中吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min,以12000rpm、13400×g离心力离心2min,将溶液收集到离心管中,即得到新生儿中口腔细胞DNA的提取;
用qPCR方法检测新生儿地中海贫血基因型,采用β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针进行检测,具体的扩增体系为:DNA模板:2μl;Mix:10μl;上游引物终浓度:0.4μl;下游引物终浓度:0.4μl;Probe:0.40μl RNase Free水:补充至20μl;反应条件:95℃3min;95℃3s,60℃30,40个循环;60℃1min,和4℃维持;通过提取新生儿口腔细胞的DNA,从而反向验证孕妇外周血血浆和囊胚培养基中游离DNA检测的优越性,也拓宽了检测方法和对象,进而实现准确检测的目的。
本发明的有益效果是:
1.通过设计的β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针,同时在α-地中海贫血-SEA的引物对中的下游引物上设计两种不同的引物,从而利用不同引物扩增不同的目的DNA片段,从而增强后续的荧光检测准确性,进而利用设计的引物对和探针,实现准确检测的目的。
2.通过采用两个不同的下游引物组成的两种引物对,从而能将正常的野生型α-珠蛋白基因和SEA缺失型α-珠蛋白基因能分别被大量扩增,从而与探针结合,产生足够的荧光强度,进而能被准确的检测到。
3.通过采用囊胚培养基的预处理,从而能得到纯化后的囊胚培养基预扩增产物,方便后期的扩增检测,并且没有其他杂质干扰,避免了直接对胎儿或胚胎早期检测的损害,也间接的提高后期荧光强度的检测效果,从而实现快速准确无害检测的目的。
4.通过将母血浆游离DNA和囊胚培养基中游离DNA分别进行扩增,同时针对囊胚培养基中得到的游离DNA进行预扩增以及微滴数字PCR扩增,从而先将扩增引物进行富集和放大,再正式的参与到微滴数字PCR扩增中,方便迅速的扩增,从而间接的缩短扩增时间,实现快速检测的目的。
5.通过提取新生儿口腔细胞的DNA,从而反向验证孕妇外周血血浆和囊胚培养基中游离DNA检测的优越性,也拓宽了检测方法和对象,进而实现准确检测的目的。
附图说明
图1为本发明检测孕妇外周血浆中游离DNA的β-地中海贫血CD41/42基因的结果图,
图中,VIC是野生型β-珠蛋白等位基因微滴数,FAM是突变型CD41/42缺失等位基因微滴数,X轴和Y轴分别表现的是FAM和VIC荧光信号强度,A-L随机外周血浆样品;
图2为本发明检测新生儿口腔细胞的β-地中海贫血CD41/42基因的qPCR结果图
图中,VIC是野生型β-珠蛋白等位基因扩增曲线,FAM是突变型CD41/42缺失等位基因扩增曲线,A中CT(VIC)<35且CT(FAM)>35,样本来自为健康成年人对照;B中CT(VIC)<35且CT(FAM)<35,样本来自为携带者新生儿;C中CT(VIC)<35且CT(FAM)>35,样本来自为健康新生儿;中CT(VIC)>35且CT(FAM)>35,样本来自为阴性对照;
图3为利用本发明检测的囊胚培养基中游离DNA和相应的新生儿口腔细胞中β-地中海贫血CD41/42基因的结果图,
图中,A为空白胚胎培养基,B为囊胚培养基,C为新生儿口腔细胞,VIC是野生型β-珠蛋白等位基因微滴数,FAM是突变型CD41/42缺失等位基因微滴数,X轴和Y轴分别表现的是FAM和VIC荧光信号强度;
图4为本发明检测的囊胚培养基中游离DNA的α-地中海贫血-SEA基因的结果图,
图中,VIC是突变型SEA-缺失型等位基因微滴数,FAM是野生型α-珠蛋白等位基因微滴数,X轴和Y轴分别表现的是FAM和VIC荧光信号,A-F均为随机样品;
图5为本发明检测新生儿口腔细胞的α-地中海贫血-SEA基因的qPCR结果图,
图中,VIC是突变型SEA-缺失型等位基因扩增曲线,FAM是野生型α-珠蛋白等位基因增曲线,A中CT(FAM)<35且CT(VIC)>35,样本来自为健康成年人对照;B中CT(FAM)<35且CT(VIC)>3,样本来自为健康新生儿;C中CT(FAM)<35且CT(VIC)<35,样本来自为携带者新生儿;D中CT(FAM)>35且CT(VIC)>35,样本来自为阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
所述的VIC和FAM均为荧光基团,波长分别为552nm和517nm;所述的MGBNFQ为无荧光的猝灭基团。
检测地中海贫血基因的引物对和探针,包括β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针;所述的β-地中海贫血CD41/42的引物对为:
HBB上游引物:5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(序列1);
HBB下游引物:5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(序列2);
对应的所述的β-地中海贫血CD41/42的探针为:
野生型β-珠蛋白:VIC-CAGAGGTTCTTTGAGTCCT-MGBNFQ(序列3),
突变CD41/42缺失型:FAM-AGAGGTTGAGTCCTT-MGBNFQ(序列4);
所述的α-地中海贫血-SEA的引物对为:
HBA上游引物:5’-TCGGTCGTCCCCACTGT-3’(序列5);
HBA下游引物Ⅰ:5’-GGACTGCTCCGCTCCAC-3’(序列6);
HBA下游引物Ⅱ:5’-CAGCCTTGAACTCCTGGACTTAA-3’(序列7);
对应的所述的α-地中海贫血-SEA的探针为:
野生型α-珠蛋白:FAM-TCTAGCCCCTGA GCACCG-MGBNFQ(序列8);
突变SEA缺失型:VIC-CTCCAAGTGAACCTCC-MGBNFQ(序列9)。
为了进一步实现准确测量的目的,所述的HBA下游引物Ⅰ为设计的野生型α-珠蛋白的引物;所述的HBA下游引物Ⅱ为设计的突变SEA缺失型的引物;所述的HBA下游引物Ⅰ与所述的HBA上游引物构成HBA野生型α-珠蛋白的引物对,对应的所述的HBA下游引物Ⅱ与所述的HBA上游引物构成HBA突变SEA缺失型的引物对了;通过采用两个不同的下游引物组成的两种引物对,从而能将正常的DNA和SEA缺失型的DNA能分别被大量扩增,从而与探针结合,产生足够的荧光强度,进而能被准确的检测到。
检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,包括以下步骤:
S1收集包括孕妇外周血浆以及囊胚移植后弃置的囊胚培养基为待检测样品,先将囊胚培养基进行预处理,再分别提取外周血浆和囊胚培养基中的游离DNA;
S2将提取后的DNA按照来源分为血浆中的游离DNA以及囊胚培养基中的游离DNA,采用β-地中海贫血CD41/42的引物对和探针,以血浆的游离DNA以及囊胚培养基的DNA为模板分别进行微滴数字PCR的扩增反应,得到扩增后的产物;
S3将得到的扩增产物进行检测荧光强度,确定基因型;
S4采用α-地中海贫血-SEA的引物对及探针重复上述S2-S3的过程,即为引物对和探针的使用方法;
所述的确定基因型为,通过荧光信号强度的累计读取阳性微滴数目,再根据相对突变剂量法确定基因型;所述的相对突变剂量法为,根据下列公式1:
式中,Z表示基因型的阈值范围,
NN为野生型的基因拷贝数,
NM为突变型的基因拷贝数,
NT=NM+NN;
当公式1中的Z取值范围为-2<Z<2时,即为野生型的基因拷贝数NN和突变型的基因拷贝数NM之间的差别不大,即此时检测到的基因拷贝数来源于胚胎或者胎儿的基因,且胚胎或者胎儿基因拷贝数为NM=NN,可以认为检测到的胎儿或胚胎的基因型为携带者;
当公式1中的Z取值范围为Z>2时,即为野生型的基因拷贝数NN远小于突变型的基因拷贝数NM,并且当Z取值的置信区间为95%时,此时检测到的基因拷贝数为NM-NN,来自母本污染的基因拷贝数为NN,则可认为检测到的胎儿或胚胎的基因型为致病基因型;
当公式1中的Z取值范围为Z<-2时,即为野生型的基因拷贝数NN远大于突变型的基因拷贝数NM,并且当Z取值的置信区间为95%时,此时检测到的基因拷贝数为NN-NM,来自母本污染的基因拷贝数为NM,则可认为检测到的胎儿或胚胎的基因型为健康基因型;
建立不确定区,Z的取值范围为-2<Z<-1.5或1.5<Z<2时,因此时小范围内的野生型的基因拷贝数NN和突变型的基因拷贝数NM之间无法对应上关系,因此需要重新进样检测;
上述即为所述的相对突变剂量法,其本质是针对母本是否携带致病基因的计算和推测,但当研究父本是否携带致病基因时,因母本属于不含有突变基因的野生纯合子,因此当孕妇外周血中提取的游离DNA或囊胚培养基中的游离DNA检测不到突变基因型,则说明了胎儿或者胚胎是野生型纯合子,但是当孕妇外周血中提取的游离DNAA和囊胚培养基中的游离DNA检测出了突变型基因,并且突变型占比超过了0.5%,则说明胚胎或者胎儿是携带突变基因的杂合子;
所述的孕妇外周血浆中游离DNA的提取,包括以下步骤:
a)将EDTA抗凝的孕中晚期孕妇外周血于4℃条件下1600×g离心力离心10min后,取上清液,再12000×g离心力离心10min,取上清液加入干净的EP管中,-80℃保存,再取保存后的血浆样本400μl,加入760μl的裂解液和40μl的蛋白酶以及25~30μl的磁珠,漩涡振荡15s,于室温在翻转摇匀仪(50rpm)上吸附10min,再漩涡振荡15s后,将离心管置于磁力架上,同时反复颠倒磁力架,将留存在管盖部分的磁珠冲刷至管内溶液中,静置磁力架磁吸1min或至溶液澄清,弃去管盖和管内上清液,得到混匀液;
b)在混匀液中加入洗涤液BW1,漩涡振荡后1min后,将离心管置于磁力架上,反复颠倒磁力架,将留存在管盖部分的磁珠冲刷至管内溶液中静置磁力架磁吸1min或至溶液澄清,弃去管盖和管内上清液,得到粗品的提取液;
c)在粗品提取液中加入1ml的质量分数为80%的乙醇溶液,按照步骤b)进行两次洗涤,得到均质液;
d)在得到的均质液加入20μl洗脱液TE后,漩涡振荡混匀后,室温孵育10min至出现上清液,孵育阶段中再振荡混匀一次,使磁珠混匀,磁吸1min后,吸取上清液,即为孕妇外周血浆中游离DNA提取液。
优选的,为了进一步实现快速准确无害检测的目的,所述的囊胚培养基的预处理,包括以下步骤:
(1)囊胚培养基的裂解
a)取囊胚培养基,冷冻凝固后进行溶解并瞬时离心,得到上清液;
b)在上清液中分别加入裂解液以及裂解酶,混匀,在50℃条件下反应50min后,升温到80℃条件下继续反应10min,降温到4℃并维持,即得到囊胚培养基的裂解产物;
(2)囊胚培养基裂解产物的预扩增
将得到的囊胚培养基的裂解产物进行预扩增反应体系处理,得到预扩增产物,再进行提取囊胚培养基中的游离DNA;所述的预扩增体系包括:Super mix:25μl;上游引物终浓度:45nmol/l;下游引物终浓度:45nmol/l;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃10min;94℃15s,60℃4min,11个循环;99℃10min,和4℃维持;
所述的提取囊胚培养基中的游离DNA包括以下步骤:
a)囊胚培养基预处理后的预扩增产物中加入900μl的ACB裂解缓冲液,冰上孵育5min;
b)将吸附柱插入到QIAvac24 plus上的真空连接器上,在吸附柱上插入开口的20ml的扩管器;
c)将步骤a)所得ACB裂解缓冲液混合物加入到吸附柱的扩管器中,打开真空泵,当所有的裂解液都完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar,小心打开并丢弃扩管器;
d)向含有初步吸附的囊胚培养基DNA的吸附柱中加入600μl缓冲液ACW1,吸附柱管盖敞开,打开真空泵,当ACW1缓冲盐完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar;
e)向含有二次吸附的囊胚培养基DNA的吸附柱中加入750μl缓冲液ACW2,吸附柱管盖敞开,打开真空泵,当ACW2缓冲盐完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar;
f)向含有三次吸附的囊胚培养基DNA的吸附柱中加入750μl 96-100%乙醇溶液,吸附柱管盖敞开,打开真空泵,当乙醇溶液完全通过吸附柱后,关闭真空泵,将压力释放到0mbar;
g)关闭吸附柱管盖,将吸附柱从真空歧管上拿下,丢弃真空连接器,将吸附柱返给2ml的收集柱里面,14000rpm离心3min;
h)将吸附柱放入新的2ml收集管里面,打开盖子,56℃孵育10min让膜完全干燥;
i)将吸附柱放入干净的1.5ml洗脱管中,丢掉h)步骤中的收集管,小心地加入50μlAVE缓冲液加入到吸附柱膜的中间部位,关闭管盖室温下孵育3min;
j)14000rpm离心1min洗脱吸附柱上的核酸,得到纯化后的囊胚培养基预扩增产物中的游离DNA;
通过采用囊胚培养基的预处理,从而能得到纯化后的囊胚培养基预扩增产物,方便后期的扩增检测,并且没有其他杂质干扰,避免了直接对胎儿或胚胎早期检测的损害,也间接的提高后期荧光强度的检测效果,从而实现快速准确无害检测的目的。
优选的,为了进一步实现快速检测的目的,所述的微滴数字PCR的扩增反应包括血浆游离DNA的扩增反应以及囊胚培养基游离DNA的扩增反应;所述的血浆游离DNA的扩增反应体系包括:模板:6μl;Super mix:25μl;上游引物终浓度:900nmol/l;下游引物终浓度:900nmol/l;探针终浓度:200nmol/l;稳定剂:2μl;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃10min;94℃15s,60℃1min,45个循环;98℃10min,梯度升降温速0.5℃/s,和12℃维持;
优选的,为了进一步实现快速检测的目的,所述的母血浆中游离DNA和囊胚培养基中的游离DNA的扩增反应体系均包括:模板:6μl;Super mix:25μl;上游引物终浓度:900nmol/l;下游引物终浓度:900nmol/l;探针终浓度:200nmol/l;稳定剂:2μl;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃10min;94℃15s,60℃1min,45个循环;98℃10min,梯度升降温速0.5℃/s,和12℃维持;通过采用通用的扩增反应体系,使母血浆中游离DNA和囊胚培养基中的游离DNA均能大量的扩增,从而得到充足的游离DNA片段,进而实现快速检测的目的。
图1所示,针对本发明的微滴数字PCR技术检测孕妇外周血浆中游离DNA的β-地中海贫血CD41/42的基因,其检测情况如表1所示:
表1微滴数字PCR技术检测孕妇外周血浆中游离DNA的β-地中海贫血CD41/42的基因的情况表
表1中B为对照组的未怀孕的女性。
为了进一步实现检测的准确性,所述的使用方法还包括新生儿中口腔细胞DNA的提取,包括以下步骤:
1)用无菌棉签在新生儿口腔里面轻柔的擦拭脸颊内侧,保证较丰富的唾液粘附与棉签上,采集婴儿口腔脱落细胞样本;
2)截取采集后的棉签端,放入干净的EP管中,加入400μl GA缓冲液和40μl蛋白酶K振荡混匀,得到组织混合液;
3)将得到的组织混合液在56℃放置16-18h,直至组织混合液溶解,弃去棉签,简短离心去除管盖内壁的水珠,得到混合液;
4)在混合液中加入400μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液变清亮后,简短离心以去除管盖内壁的水珠,得到预混液;
5)在预混液中加入400μl无水乙醇,充分振荡混匀15s,出现絮状沉淀,简短离心去除管盖内壁的水珠,得到清凉的沉淀液;
6)将上一步所得沉淀液和絮状沉淀都加入到同一个吸附柱CB3中,同时吸附柱放入收集管中,以12000rpm转速、13400×g离心力离心30s,倒掉废液,并将吸附柱CB3放回收集管中,得到初步吸附DNA;
7)向含有初步吸附的DNA的吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD,以12000rpm、13400×g离心力了离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中,得到二次吸附DNA;
8)向含二次吸附DNA的吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW以12000rpm转速、13400×g离心力离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中,得到三次吸附DNA;
9)重复操作步骤8),得到四次吸附DNA;
10)降含有四次吸附DNA的吸附柱CB3放回收集管中,以12000rpm转速、13400×g离心力离心2min,倒掉废液,随后将吸附柱CB3置于室温放置10-30min,彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液,得到干燥的吸附柱CB3;
11)将干燥的吸附柱CB3转入干净的离心管中,向吸附柱CB3中吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min,以12000rpm、13400×g离心力离心2min,将溶液收集到离心管中,即得到新生儿中口腔细胞DNA的提取;
用qPCR方法检测新生儿地中海贫血基因型,采用β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针进行检测,具体的扩增体系为:DNA模板:2μl;Mix:10μl;上游引物终浓度:0.4μl;下游引物终浓度:0.4μl;Probe:0.40μl RNase Free水:补充至20μl;反应条件:95℃3min;95℃3s,60℃30,40个循环;60℃1min,和4℃维持;通过提取新生儿口腔细胞的DNA,从而反向验证孕妇外周血血浆和囊胚培养基中游离DNA检测的优越性,也拓宽了检测方法和对象,进而实现准确检测的目的。
如图2所示,针对本发明的qPCR技术检测新生儿口腔细胞DNA的β-地中海贫血CD41/42的基因。
如图3所示,针对囊胚培养基中游离DNA和相应的新生儿口腔细胞中β-地中海贫血CD41/42基因,其检测结果如表2所示:
表2微滴数字PCR技术检测囊胚培养基中游离DNA和相应的新生儿口腔细胞中β-地中海贫血CD41/42基因的情况表
如图4所示,针对囊胚培养基中游离DNA的α-地中海贫血-SEA基因,其检测结果如表3所示:
表4微滴数字PCR技术检测囊胚培养基中游离DNA的α-地中海贫血-SEA基因的情况表
如图5所示,针对本发明的qPCR技术检测新生儿口腔细胞DNA的α-地中海贫血-SEA的基因。
由上述各表和附图可知,采用本发明的引物对和探针以及使用方法能够无创无害精准的检测,并利用相对突变剂量法推导出胎儿或胚胎的相关基因型,从而判断出是否有地中海贫血的基因携带或者致病情况,实际使用中发现,其在孕妇外周血浆的检测灵敏度可达到3copies/μl,而在囊胚培养基上的灵敏度检测可达到1copies/well,在低拷贝数的情况下,能规避囊胚培养基中抑制物的影响,降低了假阴性的风险,同时不会对孕妇或胎儿产生直接创伤和伤害。
综上所述,本发明采用的β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的引物对及探针,同时针对妇外周血浆中游离DNA的提取以及囊胚培养基中的游离DNA的检测和判定,采用预处理和预扩增的方式进行拷贝数的确定,再通过相对剂量法,以阈值范围推断基因型,检测准确度能达到98%以上,并且在孕妇外周血浆的检测灵敏度可达到3copies/μl,而在囊胚培养基上的灵敏度检测可达到1copies/well,体现了本发明的优越性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 成都锦欣生殖医学与遗传学研究所
<120> 检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法
<130> 2020.08.26
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ttttcccacc cttaggctgc 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acagcatcag gagtggacag atc 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cagaggttct ttgagtcct 19
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
agaggttgag tcctt 15
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tcggtcgtcc ccactgt 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ggactgctcc gctccac 17
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cagccttgaa ctcctggact taa 23
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tctagcccct gagcaccg 18
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ctccaagtga acctcc 16
Claims (10)
1.检测地中海贫血基因的引物对和探针,其特征在于:包括β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针;所述的β-地中海贫血CD41/42的引物对为:
HBB上游引物:5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(序列1);
HBB下游引物:5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(序列2);
对应的所述的β-地中海贫血CD41/42的探针为:
野生型β-珠蛋白:VIC-CAGAGGTTCTTTGAGTCCT-MGBNFQ(序列3),
突变CD41/42缺失型:FAM-AGAGGTTGAGTCCTT-MGBNFQ(序列4);
所述的α-地中海贫血-SEA的引物对为:
HBA上游引物:5’-TCGGTCGTCCCCACTGT-3’(序列5);
HBA下游引物Ⅰ:5’-GGACTGCTCCGCTCCAC-3’(序列6);
HBA下游引物Ⅱ:5’-CAGCCTTGAACTCCTGGACTTAA-3’(序列7);
对应的所述的α-地中海贫血-SEA的探针为:
野生型α-珠蛋白:FAM-TCTAGCCCCTGA GCACCG-MGBNFQ(序列8);
突变SEA缺失型:VIC-CTCCAAGTGAACCTCC-MGBNFQ(序列9)。
2.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针,其特征在于:所述的HBA下游引物Ⅰ为设计的野生型α-珠蛋白的引物;所述的HBA下游引物Ⅱ为设计的突变SEA缺失型的引物;所述的HBA下游引物Ⅰ与所述的HBA上游引物构成HBA野生型α-珠蛋白的引物对,对应的所述的HBA下游引物Ⅱ与所述的HBA上游引物构成HBA突变SEA缺失型的引物对。
3.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒包括权利要求1~2任一项所述的探针组和引物对,以及其他试剂;所述的其他试剂包括水、dNTPs、DNA聚合酶、数字PCR反应缓冲液、微滴生成油、阳性参考品、阴性参考品和标准品中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1收集包括孕妇外周血浆以及囊胚移植后弃置的囊胚培养基为待检测样品,先将囊胚培养基进行预处理,再分别提取外周血浆和囊胚培养基中的游离DNA;
S2将提取后的DNA按照来源分为血浆中的游离DNA以及囊胚培养基中的游离DNA,采用β-地中海贫血CD41/42的引物对和探针,以血浆的游离DNA以及囊胚培养基的DNA为模板分别进行微滴数字PCR的扩增反应,得到扩增后的产物;
S3将得到的扩增产物进行检测荧光强度,确定基因型;
S4采用α-地中海贫血-SEA的引物对及探针重复上述S2-S3的过程,即为引物对和探针的使用方法。
5.根据权利要求4所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:所述的囊胚培养基的预处理,包括以下步骤:
(1)通过裂解液以及裂解酶进行囊胚培养基的裂解,得到囊胚培养基的裂解产物;(2)利用β-地中海贫血CD41/42的引物对或α-地中海贫血-SEA的引物对进行囊胚培养基裂解产物的预扩增,得到预扩增产物。
6.根据权利要求5所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:所述的提取囊胚培养基中的游离DNA包括以下步骤:
a)利用ACB裂解缓冲液处理囊胚培养基预处理后的预扩增产物,形成混合物;
b)装载吸附柱;
c)利用吸附柱吸附混合物,得到初步吸附柱;
d)缓冲液ACW1冲洗初步吸附的吸附柱,得到二次吸附柱;
e)缓冲液ACW2冲洗二次吸附柱,得到三次吸附柱;
f)乙醇溶液冲洗三次吸附柱;
g)处理后的吸附柱置于收集柱内离心;
h)干燥吸附柱内的吸附柱膜;
i)AVE缓冲液洗脱干燥后的吸附柱膜的中间部位并孵育;
j)离心洗脱吸附柱上的核酸,得到纯化的囊胚培养基预扩增产物中的游离DNA。
7.根据权利要求4所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:所述的提取孕妇外周血浆中的游离DNA,包括以下步骤:
a)取血浆样本,加入裂解液和蛋白酶以及磁珠,进行磁力颠倒摇匀,得到混匀液;
b)在混匀液中加入洗涤液,漩涡振荡后,静置,弃去上清液,得到粗品的提取液;
c)在粗品提取液中加入乙醇溶液,按照步骤b)进行多次洗涤,得到均质液;
d)在得到的均质液加入洗脱液后,漩涡振荡后,室温孵育至出现上清液,孵育阶段中再振荡一次,吸取上清液,即为孕妇外周血浆中游离DNA提取液。
8.根据权利要求4所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:所述的微滴数字PCR的扩增反应包括母血浆中游离DNA的扩增反应以及囊胚培养基中的游离DNA进行扩增反应。
9.根据权利要求8所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:所述的母血浆中游离DNA和囊胚培养基中的游离DNA的扩增反应体系均包括:模板:6μl;Super mix:25μl;上游引物终浓度:900nmol/l;下游引物终浓度:900nmol/l;探针终浓度:200nmol/l;稳定剂:2μl;RNase Free水:补充至50μl;反应条件:95℃ 10min;94℃ 15s,60℃ 1min,45个循环;98℃ 10min,梯度升降温速0.5℃/s,和12℃维持。
10.根据权利要求4所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法,其特征在于:所述的使用方法还包括新生儿中口腔细胞DNA的提取,包括以下步骤:
1)采集婴儿口腔脱落细胞样本;
2)在采集的样本中加入GA缓冲液和蛋白酶K,振荡混匀,得到组织混合液;
3)将得到的组织混合液在56℃放置,直至组织混合液溶解,简短离心,得到混合液;
4)在混合液中加入缓冲液GB,颠倒混匀,70℃放置,溶液变清亮后,简短离心,得到预混液;
5)在预混液中加入无水乙醇,振荡混匀,待出现絮状沉淀,简短离心,得到清凉的沉淀液;
6)将所得沉淀液和絮状沉淀都加入到同吸附柱CB3中,离心并倒掉废液,得到初步吸附DNA;
7)向含有初步吸附的DNA的吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD,离心,倒掉废液,得到二次吸附DNA;
8)向含二次吸附DNA的吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,离心,倒掉废液,得到三次吸附DNA;
9)重复操作步骤8),得到四次吸附DNA;
10)将含有四次吸附DNA的吸附柱CB3,离心,倒掉废液,室温放置,晾干吸附材料中残余的漂洗液,得到干燥的吸附柱CB3;
11)向干燥的吸附柱CB3中吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液TE,室温放置,离心,即得到新生儿中口腔细胞DNA的提取。
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