CN102628082A - 基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，包括采用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法进行制备单链DNA文库后，采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测结果。该方法比普通的real-timeQ-PCR定量方法成本低很多，应用更加广泛提高了核酸定量的样本通量，可以对核酸的系列进行精确的定性和定量。

Description

基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法。
背景技术
高通量测序技术是对传统测序(Sanger测序)一次革命性的改变。传统测序技术一次只能测单一的基因片段，在1990年-2003年首次完成的一个人的全基+因组测序使用的就是传统的Sanger法，花费了十几年的时间，耗费了巨大的资金，动员了多个国家的数百科学家。而高通量测序可一次对几十万到几百万条甚至几千万条DNA分子片段进行序列测定，完成一个人的基因组测序目前达到只需要几天的时间，成本降到几千美元。
高通量测序一般称为下一代测序技术。高通量测序技术包括目前的Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和HiSeq技术、ABI公司的SOLiD技术、Life technologies公司的Ion torrent测序技术、Helicos HeliscopeTM和Pacific Biosciences推出的单分子测序技术，及将要出现的其它高通量测序技术。
高通量测序技术应用前景很广，已经应用到各物种基因组全测序、表观基因组学、宏基因组学及功能基因组学研究的许多方面。虽然这些应用极大地增加了发现与人类疾病息息相关的各种基因突变、短片段插入/缺失、基因组水平异常的机会，但目前还主要停留在研究阶段，还没有作为临床诊断和检测手段，更没有对各种环境下的微生物种群及其比例关系进行鉴定。造成这种现状的主要原因一是现有高通量技术使用成本高，二是还没有一种基于高通量测序的定性定量方法。
目前常用的核酸定性方法是做一个PCR扩增，有产物产生就断定是某种DNA。这种方法虽然简单，但一次只能鉴定一种DNA；又由于PCR非常灵敏，极易被污染造成假阳性结果。研究核酸定量的方法目前是real-timeQ-PCR(荧光实时定量PCR)方法。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团或者荧光探针，利用荧光信号产生时的扩增循环位点(Ct值)与样品中靶标的量有对数关系，实时监测整个PCR进程中荧光信号的累积过程，最后通过与样品中另一参照物或标准曲线进行比对的定量分析方法。因此，靶标定量有两种策略：相对定量和绝对定量。相对定量指的是在样本中靶标量相对于另一参照物的量。绝对定量指的是用已知量的标准曲线来推算靶标的未知量。
在一份核酸混合物样品中利用real-time Q-PCR技术定量分析各成分，除每次主要只能分析一个成分外，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-timeQ-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物(参照物)不受实验条件的影响，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键，实验证明要做到这一点是很难的。另外，与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是：(1)由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力；(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高，技术操作难度大，从而也限制了其广泛的应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，解决了现有技术中荧光实时定量PCR方法进行核酸定性和定量检测中的种种不足之处。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：
一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)将待捕获的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；
(2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；
(3)使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；
(4)将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库；
(5)采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测结果。
优选的，所述方法中固相载体为微球。
优选的，所述方法中固相载体为磁性微球。
优选的，所述方法中所述亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。
优选的，所述方法中所述第一接头DNA片段具有SEQ No：1的连续核苷酸序列，且5’端通过生物素进行标记；第二接头DNA片段具有SEQ No：2的连续核苷酸序列。
优选的，所述方法中所述第一引物由第一接头DNA片段、ACTG碱基组和用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列的特异性引物连接而成；所述第二引物由第二接头DNA片段、ACTG碱基组和用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列的特异性引物连接而成。
优选的，所述方法中所述第一引物进行第一次PCR扩增的第一PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第一PCR反应体系终浓度组成为：
PCR缓冲液       终浓度1～10×；
dNTPs           0.01～1.5mM；
引物序列        终浓度为0.01～2μM；
模板DNA         0.01～10ng/μL；
TaqDNA聚合酶    0.01～1.0U/μL；
MgCl2           终浓度为0.5～5mM。
优选的，所述方法中所述第二引物进行第二次PCR扩增的第二PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第二PCR反应体系终浓度组成为：
PCR缓冲液        终浓度1～10×；
dNTPs            0.01～1.5mM；
引物序列         终浓度为0.01～2μM；
模板DNA          0.01～10ng/μL；
TaqDNA聚合酶     0.01～1.0U/μL；
MgCl2            终浓度为0.5～5mM。
优选的，所述方法步骤(1)中待捕获的基因组是从选自人或动物或微生物群体中提取的。
优选的，所述方法步骤(5)中高通量测序技术选自454焦磷酸测序方法、Illumina Solexa合成测序方法、ABI SOLiD连接法测序方法、Lifetechnologies公司的Ion torrent测序方法、单分子测序方法。
优选的，所述方法步骤(5)中进行核酸的定性分析和定量分析是利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法来完成。
本发明待捕获的基因组样本来自包括但不限于人或动物血液组织、其他组织和排泄物的基因组和转录组；人或动物的口腔、皮肤和肠胃微生物菌群基因组；土壤、水、树林、草地等生态环境中微生物群体的基因组等等。作为示例，如外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片。
本发明基于高通量测序原理来完成的，本发明首次完成了核酸“测序-定性”、相对“测序-定量”和绝对“测序-定量”的方法，利用对一份核酸样本中几十万到上百万个不同DNA分子同时测序鉴定后，利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法就可完成对样本的准确定性定量。该方法克服了需要real-time Q-PCR标准曲线的方法，省去了逆转录效率的限制，本方法实验成本很低，并结合采用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法进行高通量测序后，就是一个“直接点数”识别各种不同核酸分子后定性和定量同时完成。检测一次获得几百上千万个数据只需要数百元人民币。
所述的多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法，包括以下步骤：
(1)将待捕获的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；
(2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；
(3)使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；
(4)将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库。
优选的多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法可以采用如下的步骤进行，如图1所示：
(1)首先将基因组用超声破碎仪进行随机打断；
(2)将单引物加入破碎的基因组中进行单向PCR扩增。单引物由DNA特异引物在5’端与接有生物素的接头DNA相连；
(3)用链霉亲和素磁珠将携带生物素(Bio)的单链目的片段DNA进行捕获；
(4)用特异性引物对捕获的DNA进行第二次单向PCR扩增；
(5)除去带有生物素的单链，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库(文库DNA相同序列分子也可以是不同系列的分子)；
(6)文库DNA用于测序或其它任何应用。
本发明多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法既集合了in-solution的高特异性的优点，由具有操作简单、省时省力的优点，又具有用样品量少的优点。
这样，进行核酸定性定量检测的方法可以按照如下步骤进行：
(1)提取样本的核酸(包括人或动物血液组织、其他组织和排泄物的基因组和转录组；人或动物的口腔、皮肤和肠胃微生物菌群基因组；土壤、水、树林、草地等生态环境中微生物群体的基因组等等)；
(2)应用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法或其它成熟的技术，制备单链DNA(ssDNA)测序文库；
(3)进行高通量测序；
(4)对测序结果进行定性、绝对定量(计数)和进行相对定量(比较)。
测序定性就是说对一个未知的微生物群体或者对可能有癌细胞存在的人体中的基因组进行测序后，确定了微生物群体中的微生物的种类和肿瘤细胞确定存在以及存在的突变的位置。测序绝对定量就是对测序后测得的每一种微生物种类或每一肿瘤细胞种类的某一或某几个特定的基因进行计数得出一个平均值作为群体中某一微生物或某一细胞的统计数目。测序的相对定量是对微生物种群中的不同微生物种类的统计数目的比值或者肿瘤细胞统计数目与正常细胞的统计数目的比值，这样可以辨别微生物种群中什么微生物是核心种群，以及肿瘤细胞达到什么样的比例是初期、中期或后期。
如本文所用，术语“亲和素”包括卵白亲合素(Avidin，A)、链霉亲合素(Streptavidin，SA)、卵黄亲合素及类亲合素等。该术语还包括野生型、突变型以及衍生型的亲和素。
如本文所用，术语“生物素”(biontin，B)广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31Kd。生物素分子有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。
如本文所用，术语“固相载体”一般选择可结合如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白质；生物大分子固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液。
接头DNA片段分别设计如下，其可以通过PCR扩增的方式连接入DNA片段；也可以通过连接酶连接的方式连接入DNA片段。
接头A：5’-/BioTEG/GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3’；
接头B：5’-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3’；
捕获引物包括第一引物和第二引物，均由接头DNA片段+ACTG碱基组+与待扩增的基因组DNA片段配合的特异性引物(specific primer)组成。即第一引物的结构为接头A+ACTG+specific primer；第二引物的结构为接头B+ACTG+specific primer；两引物中特异性引物根据所要捕获的不同基因而不同。
所述的特异性引物(specific primer)，为用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列；如进行PCR扩增血管性血友病基因的1-5个外显子的特异性引物具有SEQ No：5～14的连续核苷酸序列。
Figure BDA0000151960990000071
将捕获引物设计成三部分：接头部分、中间部分和末尾部分；其各部分作用不同。其中中间部分为ACTG碱基组，中间部分加上ACTG，其目的是为了在测序开始时用这四个已知的碱基进行纠正；ACTG 4个碱基顺序任意排列。特异性引物要求设计成相同或相近的退火温度，因此长度不固定。特异性引物根据所要捕获的不同基因的差异进行设计。
接头和特异性引物依据普通引物设计原则：
(1)长度：15-30bp，一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
(2)G十C含量：应在45％一55％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5-10度。
(3)碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
(4)引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
(5)引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
(6)特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
(7)引物的3’端：引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，3’端不应发生错配。引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。
(8)避开引物的二级结构区：某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响。
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：
(1)本发明方法的特异性与基于in-solution捕获方法的特异性更好，本发明方法引物设计容易，整个操作更简单。本发明方法相对于现有技术均一性和覆盖率更高。
(2)本发明方法能够定量微生物菌群的种类和比例，病原体的种类和比例，有机体中自己基因组成分与异己基因成分(包括病毒基因、癌症基因、病原体、胎儿基因)的比例。比普通的real-time Q-PCR定量方法成本低很多，应用更加广泛。本发明方法核酸定量的样本通量极大的得到提高。通过确定核酸的系列，就可最精确的定性。定量方面突破了现有方法的局限。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明进行多基因多区域捕获特异核酸靶标的方法流程示意图；
图2为本发明进行多基因多区域捕获特异核酸靶标的方法覆盖度结果；
图3为本发明捕获引物的结构示意图；在序列结构组成上，所述捕获引物由接头DNA片段+ACTG碱基组+与待扩增的基因组DNA片段配合的特异性引物(specific primer)组成。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法示例
一、基因组DNA的提取和纯化
1、向200μl全血中添加400μl Lysis Solution和20μl Proteinase Ksolution，混匀获得均一悬液。
2、在56℃水浴锅中孵育10min。
3、添加200μl无水乙醇并混匀。
4、将制备的裂解混合物转移到Gene JET Genomic DNA PurificationColumn。6000g离心1min，弃掉废液。将Gene JET Genomic DNAPurification Column转移到2ml新的收集管。
5、加500μl Wash buffer I，8000g离心1min弃掉废液后将纯化柱放回收集管。
6、加500μl Wash buffer II到Gene JET Genomic DNA PurificationColumn，12000g离心3min。
7、将空柱子12000g离心1min。
8、Gene JET Genomic DNA Purification Column转移到新的1.5ml的EP管。
9、添加100μl的双蒸水或Elution buffer到Gene JET Genomic DNAPurification Column的中心，室温孵育2min，8000g离心1min。
10、弃掉纯化柱，纯化的DNA或者立即用于下游实验或者储存在-20℃。
二、基因组DNA纯度检测(Nanodrop)
1、双击电脑屏幕上的Nanodrop图标，启动软件.
2、选择所需的测量模式，屏幕上会弹出初始化仪器的提示.往仪器的加样孔中加入2微升的蒸馏水，合上上盖使形成液柱，然后点击确定以开始初始化，可以听见电磁阀开合的声音.
3、五六秒后屏幕上的提示信息消失，表示初始化完成.用擦镜纸将蒸馏水擦干净，加入2-3微升的Buffer，合上上盖并点击Blank.
4、Blank完成后，用擦镜纸将Buffer擦干净即可以开始上样，点击Measure开始测量。
三、基因组DNA的片段化(fragmentization)
基因组DNA样品从不同的来源获得，从细菌到哺乳动物。当OD260/280的nanodrop检测值在1.8-2.0，浓度大约0.3μg/μl。将超声破碎仪的功率设置成200W，破碎5秒，停5秒，破碎次数200次。
四、引物设计
接头A：5’-/BioTEG/GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3’；
接头B：5’-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3’；
五、第一次单向PCR反应
反应体系如下：
反应温度：
Figure BDA0000151960990000102
六、产物纯化
产物用PCR纯化试剂盒纯化
将试剂盒提供的binding buffer直接加入反应管以终止72℃的延伸反应，为了防止溶液变凉后的非特异性反应发生。产物洗脱在30μl的洗脱液。
七、磁珠捕获
(1)取25μl M-270链霉亲和素磁珠，用500μl 2×Binding and washbuffer洗涤两次，然后用25μl 2×Binding and wash buffer重悬。
(2)取25μl纯化的引物延伸产物加入到链霉亲和素磁珠中。
(3)混合物在室温条件下，震动混合30min，以使磁珠能够很好的结合生物素化的引物延伸物和DNA模板的杂合双链。
(4)产物转移到新的1.5ml的离心管，用500μl 1×Binding and washbuffer洗涤5次。
八、第二次引物延伸反应
反应体系如下：
Figure BDA0000151960990000111
反应温度：
Figure BDA0000151960990000112
九、单链目标DNA的获得
(1)磁珠重悬在500μl hot wash buffer(1×PCR buffer，2.5mMMgCl2，0.1％Tween-20(v/v))，并把上述溶液转移到新的1.5ml EP管。
(2)混合物在65℃恒温金属浴(或者高于capture primer的Tm值5℃)震荡孵育2min，EP管在磁铁收集器上时，迅速将上清液去除干净，以防冷却。(这一步是除去那些没有延伸的与capture primer非特异性结合的背景片段)
(3)将沉淀重悬于30μl的EB buffer，将其转移到新的1.5ml的EP管(这一步有助于减少非特异性文库片段的携带)。在PCR仪上95℃孵育3min，并在MPC(Magnetic particle collector)上除去上清，小心留下磁珠。
十、测序，并进行结果分析
1、重复性
做了6个样品，每个样品有上百个外显子，其重复性结果如表1。
表1外显子的重复性结果
Figure BDA0000151960990000121
2、覆盖度
本发明的覆盖度结果如图2所示。
3、特异性
本发明与现有技术常用捕获方法的特异性比较结果如表2所示。
表2本发明与现有技术常用捕获方法的特异性比较结果
Figure BDA0000151960990000122
实施例2无创(非侵入性)产前筛查诊断唐氐综合症及各种先天性遗传病
婴儿细胞染色体异常会引起疾病。正常人的细胞中有23对或46个染色体，但是染色体异常的胎儿会有染色体增多或者染色体减少。导致出生后会产生各种各样的疾病，如发病率很高的唐氏綜合症就是因为21号染色体为三条引起的。目前如果需要明确诊断是否为染色体异常胎儿，需要进行抽取胎儿血、羊水或胎盘绒毛进行检查。这些手段都是侵入性检查，对胎儿和孕妇都有一定的危险，胎儿流产、早产、宫内感染的风险约为1％-2％。如果采用非侵入性的手段能从母亲外周血液中的DNA检查来鉴定染色体异常的胎儿就会极大的减少风险性和难度，也就能把这种检查推广到各地。
科学家已经证明了在母亲的外周血浆内有胎儿DNA的存在。胎儿DNA片段与母本DNA片段的主要差异在于长短不一，胎儿DNA序列很短，最长只有达到166bp或是143bp，143bp的片段是核小体中心片段的大小，而166bp则是在核小体中心片段大小基础上加上一段接头片段。这一发现可能让科学家在将来开发出从血浆中富集胎儿DNA片段的新技术。此外，核小体核心区143bp中每隔约10bp出现周期信号。这种周期信号来自于螺旋状的DNA结构，这种周期性的信号有助科学家明白血浆DNA的新陈代谢。
在母亲的血液中，大约95％的DNA是母亲的，而5％是从脱落的胎儿细胞来的。孕妇血液中的DNA获得后，假设每毫升样品含有100个基因组(一个基因组DNA中只会含有两条21号染色体DNA)，则意味着总共200条21号染色体中，正常情况下有190条是母亲的，10条是正常胎儿的21；而若胎儿患唐氏综合症，胎儿21号染色体会有15条，也就是与同时检查其它染色体数目相比，21号染色体DNA数目从5％(10/200)增加到7.5％，也就是在数目上增加2.5％。通过高通量测序一百万个全基因组DNA分子，21号染色体DNA分子就会从正常的5万个增加到7.5万个，从而达到具有统计学意义。如果在制备ssDNA测序文库时，只特异性的捕获21号染色体DNA和其它两到叁个染色体DNA进行比对，就能够只利用母亲的血液样品，早在11周时确定一个胎儿是否染色体异常，准确率达100％。利用同样的原理，就可在早期筛查出胎儿是否携带各种先天性遗传病基因突变。
实验方法如下
(1)样品的采集和处理：
在孕妇绒毛膜绒毛取样前，收集孕妇的血液样品5ml。外周血样品在4℃条件下1600xg离心10min。血浆部分4℃条件下16000xg离心10min。血细胞部分4℃条件下2500xg离心10min。来自血浆和血沉棕黄层(4ml)的DNA用血液基因组提取试剂盒提取，获得纯化的样品。分别提取孕妇血细胞和丈夫的基因组DNA。
(2)基因组DNA首先用限制性内切酶StyI进行酶切：
Figure BDA0000151960990000141
混匀并离心数秒以使溶液全部离到管底。
37℃孵育6小时后纯化。
(3)切割后的DNA采用连接酶连上通用接头：
接头A：5′GCCTCCCTCGCGCCATCAG 3′；
接头B：5′GCCTTGCCAGCCCGCTCAG 3′。
Figure BDA0000151960990000142
混匀并离心数秒以使溶液全部离到管底。
16℃孵育过夜后并纯化。
(4)测序
Illumina高通量测序平台，用T4DNA聚合酶、Klenow聚合酶和T4多聚核苷酸激酶磷酸化5’端，接头寡核苷酸连接到粘端。连接接头的DNA用PCR纯化试剂盒进行纯化。并用Illumina引物通过15个PCR循环进行富集。
将DNA文库稀释到36pM并杂交到测序流室里。根据Illumina的测序指南进行测序。
(5)测序结果的定量分析
例如检测21号染色体异常的话，分别鉴定孕妇及其丈夫的在21号染色体上的等位基因。
Figure BDA0000151960990000151
而小孩的基因型情况是I或II：
Figure BDA0000151960990000152
如果检测到小孩的基因型情况是I型斜线后面的基因说明是第一种类型，如果检测到小孩的基因型情况是II型斜线后面的基因是第二种类型。这样可以测序定性。如果在其他染色体上另选几个标记的话，其他标记都是与母亲的比例是95∶5，而这一标记是与母亲的比例是90∶10的话说明这一标记所在的染色体多出一条。通过进行测序定量可以确定染色体的异常。
实施例3人体微生物种类群落的测序定性和测序定量及与疾病健康的关系
随着生命科学研究的不断发展，人类迈入后基因组时代。人体的健康决定于基因与环境的相互作用，目前大量的研究集中在分析人的基因组成与疾病易感性和药物敏感性的关系上。但是，在体内发挥作用、影响人们生老病死的不仅有人的基因，还有大量的共生微生物的基因，其遗传信息的总和称为微生物组。人体微生物组指的是在人体内(主要在肠中)或者表面存在的生态群落中共生、共栖和致病的微生物的总称。如果将人定义为一个微生物和人体细胞的复合体，人类基因的范畴就包括人类基因组和微生物组的组合，人的新陈代谢功能也混合了人和微生物的特性，人类是由细菌和人体细胞共同组成的一个“超生物体”。在人体中存在两个基因组，一个是出生时从父母遗传来的人自身的基因组，一个是出生后从环境中获得的微生物基因组。两个基因组必须协同作用才能维持人的正常生命活动。微生物组主要包括人体的5个部位(胃肠道、口腔、鼻腔、女性生殖道和皮肤)的微生物组。
人体微生物组研究是为了确定人体微生物组的变化与人类疾病和健康的关系；最终目标是证明通过检测，控制人体微生物组变化情况来改善、提高人类健康水平。通过研究1000人左右的身体各部位微生物组的多样性，从而鉴定每一个部位的核心微生物组组成及表达情况。
2012年人体微生物组计划即将完成，人体微生物组的核心成员也初步确定。高通量测序定性定量的方法可以确定需要检测的人体的微生物种群的比例情况。初步确定其健康状况。
以口腔菌群基因组测序定量方法为例如下：
(1)样品的提取和纯化
来自牙齿和牙周的牙菌斑用灭菌的刮器收集。刮器上的牙菌斑被转移到100μl的TE buffer(50mM Tris-HCl，pH7.6；1mM EDTA).
用尼龙刷制样的软组织的细菌。来自刷子的细菌溶解到150μl的TEbuffer。DNA的提取是用微生物DNA分离试剂盒(TAKARA公司)。
(2)基因组片段化
将前述DNA放进Covaris E210超声破碎仪器中根据其说明指南：开启10秒，暂停10秒，200个循环。产生300bp左右的DNA片段。用PCR纯化试剂盒进行纯化。
(3)片段化的DNA进行修饰
片段化的DNA用磷酸酶进行磷酸化修饰。
Figure BDA0000151960990000171
37℃反应30min。
(4)采用连接酶连上通用接头：
接头A：5′GCCTCCCTCGCGCCATCAG 3′；
接头B：5′GCCTTGCCAGCCCGCTCAG 3′。
Figure BDA0000151960990000172
混匀并离心数秒以使DNA全部离到管底。
16℃孵育过夜后并纯化。
(5)对基因组中的16s rRNA基因进行捕获
取500ng整个微生物菌群的基因组片段文库在PCR仪中95℃加热5min，65℃加热5min后，与13μl预热(65℃)的2×杂交缓冲液(10×SSPE，10×Denhardt’s，10mM EDTA and 0.2％SDS)混合，并且与6μl的新制备的预热的生物素化的RNA诱饵引物(与基因组片段中16s rRNA互补序列)混合。65℃孵育66小时后，杂交混合物中加入50μl M-280链霉亲和素磁珠，洗涤三次后，重悬在20℃的200μl(1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5，and 1mM EDTA)溶液30min后，磁珠被吸附到管底并在20℃用0.5ml1×SSC/0.1％SDS溶液洗涤15min。杂交选择的DNA用50μl 0.1MNaOH洗脱。在洗脱液中10min后，磁珠被吸附到管底，上清液转移到一个新的1.5ml的管中，管中含有70μl 1MTris-HCl，pH7.5。DNA用PCR纯化试剂盒纯化。
(6)测序
将捕获的DNA取4μl加入200μl的聚合酶混合物中用接头A：5′GCCTCCCTCGCGCCATCAG 3′和接头B：5′GCCTTGCCAGCCCGCTCAG3′形成的捕获引物进行扩增14-18个循环以形成模板簇进行测序。
(7)定量分析
将获得的测序结果，进行统计可以获得菌群中不同菌种之间的数量关系(绝对数量和相对数量关系)，对测得的序列个数进行统计。
(8)结果
Figure BDA0000151960990000181
(9)以上方法可用于定性定量分析皮肤和肠胃中的菌种。
(10)以上方法可用于定性定量分析饮用水中各微生物病毒等病原体。
实施例4从粪便中直接对与肠癌有关的基因测序，定性定量分析进行肠癌普查
肠癌是常见的恶性肿瘤之一，以40岁-50岁年龄组发病率最高。据世界流行病学调查，结肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰、日本等发达国家的发病率最高，居内脏种瘤前二位，致死率也居第二位；在亚州特别是中国大陆，发病率近年也增加很快。
早期肠癌一般指Dukes’A期癌，系指肿瘤浸润深度达粘膜下层和固有肌层，若肿瘤穿过肌层至浆膜下层或穿透肠壁但无淋巴结转移则属于B期。近年来有些学者对仅限于粘膜层内原位癌的研究后认为，这种粘膜内或粘膜癌(intramucosal or mucosal carcinoma)由于大肠粘膜内几乎无淋巴管存在，这种癌一般不会发生淋巴结转移，若早期诊断出是可以完全治愈的。目前从粪便中查有无血液可筛查出一些高危人群，但这种方法准确率只有40-60％，会使大量的病人漏查。进行肠镜检查息肉是否存在然后作病理检查，虽然准确度高但由于病人要空腹24小时且要全麻，病人接受度低，费用也很高。
通过高通量直接测序分析粪便中的DNA有无肠癌基因突变，就可确诊有无肠癌细胞存在。
方法如下：
(1)基因组样本的提取
取粪便样品180-220mg至2ml的离心管中，并将管子置于冰上。然后用天根公司的粪便中提取基因组的试剂盒提取基因组，操作方法依照试剂盒说明书。
(2)根据以上的实施例子进行片段化和连接接头处理。并用大肠癌相关基因标记(APC，p53，DCC，K-ras，c-myc等)制成捕获探针捕获基因组片段中的与大肠癌产生相关的基因。
(3)测序并进行定量处理
对测得的数据统计个数，并进行分类，计算出每一类基因的测序个数。
(4)结果
Figure BDA0000151960990000191
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000151961080000011
Figure IDA0000151961080000021
Figure IDA0000151961080000031

Claims (10)

1. 一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）将待捕获的目的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列； 
（2）使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；
（3）使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；
（4）将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物， 获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库；
（5）采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测结果。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相载体为微球。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相载体为磁性微球。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一接头DNA片段具有SEQ No：1或3的连续核苷酸序列，且5’端通过生物素进行标记；第二接头DNA片段具有SEQ No：2或4的连续核苷酸序列。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一引物进行第一次PCR扩增的第一PCR反应体系包括PCR 缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第一PCR反应体系终浓度组成为：
PCR缓冲液 终浓度1～10 ×；
dNTPs  0.01～1.5mM；
引物序列   终浓度为0.01～2μM；
模板DNA   0.01～10ng/μL；
TaqDNA聚合酶  0.01～1.0U/μL；
MgCl2   终浓度为0.5～5mM。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第二引物进行第二次PCR扩增的第二PCR反应体系包括PCR 缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第二PCR反应体系终浓度组成为：
PCR缓冲液 终浓度1～10 ×；
dNTPs  0.01～1.5mM；
引物序列   终浓度为0.01～2μM；
模板DNA   0.01～10ng/μL；
TaqDNA聚合酶  0.01～1.0U/μL；
MgCl2   终浓度为0.5～5mM。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中待捕获的基因组是从选自人或动物或微生物群体中提取的。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（5）中高通量测序技术选自454焦磷酸测序方法、Illumina Solexa 合成测序方法、ABI SOLiD连接法测序方法、 Life technologies 公司的Ion torrent 测序方法、单分子测序方法。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（5）中进行核酸的定性分析和定量分析是利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法来完成。
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