TW202321465A - 一種腫瘤評估方法及應用 - Google Patents
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Abstract
提供了一種腫瘤評估方法及應用，具體提供了一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，包含評估待測樣本中一組標誌物基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。本發明還關於用於評估一組DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，及其製備方法。
Description
本發明關於生物醫學領域，具體的關於一種腫瘤評估方法及應用。
尋找更高效的腫瘤標誌物一直是腫瘤相關研究中重要的一個方向，基於液體活檢的血漿游離DNA檢測技術對於腫瘤標誌物的發現有了更高的需求。其基本原理為：腫瘤細胞死亡後，釋放游離DNA進入血液，藉由檢測血液中的DNA突變、DNA甲基化、miRNA、組蛋白修飾等腫瘤細胞相關信息，可探測到極早期的腫瘤信號。已有研究發現DNA甲基化變化可能早於DNA突變的發生，是腫瘤早期篩查的更行之有效的檢測標誌物。
但目前早期癌症中，釋放入血的腫瘤細胞極少，並且本領域急需尋找到更多的對於肝腫瘤有效的檢測標誌物。因此，亟需開發一種方法和/或試劑盒，藉由檢測準確、穩定、有效的肝癌生物標誌物或其組合，且可以從生物樣品中數量極為有限的細胞外游離DNA高效地讀取到該表觀遺傳學信息，更佳的，該方法應可以在醫院檢驗科裡很容易地配置並可靠地應用。
本發明提供的方法可以將更多高效的甲基化標誌物，用於確認或輔助確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展，可以提高腫瘤，例如肝腫瘤的早篩早診效率，解決肝癌早診率低、臨床治療負擔重等問題。
一方面，本發明提供了一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標基因包含SEPT9和IKZF1。
另一方面，本發明還提供了一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標基因包含SEPT9和IKZF1。
另一方面，本發明還提供了一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含確定待測樣本中目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標DNA區域包含來源於人chr17：75368651-75370720和來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。
另一方面，本發明還提供了一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標DNA區域包含來源於人chr17：75368651-75370720和來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。
另一方面，本發明還提供了一種核酸，該核酸包含能夠結合如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列；或者該核酸包含能夠結合如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
另一方面，本發明還提供了一種製備核酸的方法，該方法包含根據如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸；或者該方法包含根據如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明還提供了一種核酸組，該核酸組包含能夠結合如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列；或者該核酸組包含能夠結合如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
另一方面，本發明還提供了一種製備核酸組的方法，該方法包含根據如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組；或者該方法包含根據如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的
轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。
另一方面，本發明還提供了一種試劑盒，包含如本發明的核酸和/或本發明的核酸組。
另一方面，本發明還提供了如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備確定DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
另一方面，本發明還提供了如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。
另一方面，本發明還提供了如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明還提供了用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明還提供了用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段。
另一方面，本發明還提供了如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合，在製備用於
確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明還提供了如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明還提供了一種儲存介質，其記載可以運行本發明的方法的程序。
另一方面，本發明還提供了一種設備，其包含本發明的儲存介質。
所屬技術領域中具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本發明的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本發明的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本發明的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本發明所涉及發明的精神和範圍。相應地，本發明的說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本發明所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本發明所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1、3、5、7顯示的是檢測位點癌旁組織、癌組織和白細胞DNA甲基化信號對比。
圖2、4、6、8顯示的是檢測位點在對照血漿和肝癌血漿DNA甲基化信號對比。
以下由特定的具體實施例說明本發明發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本發明發明的其他優點及效果。
術語定義
在本發明中，術語“BCAT1”通常是指一種基因或其表達產物。例如，BCAT1(Branched-chain-amino-acid aminotransferase)蛋白的UniProt登錄號可以是P54687。本發明中，BCAT1可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“VASH2”通常是指一種基因或其表達產物。例如，VASH2(Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase 2)蛋白的UniProt登錄號可以是Q86V25。本發明中，VASH2可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“GPAM”通常是指一種基因或其表達產物。例如，GPAM(Glycerol-3-phosphate acyltransferase 1,mitochondrial)蛋白的UniProt登錄號可以是Q9HCL2。本發明中，GPAM可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“VAV3”通常是指一種基因或其表達產物。例如，VAV3(Guanine nucleotide exchange factor VAV3)蛋白的UniProt登錄號可以是
Q9UKW4。本發明中，VAV3可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“SEPT9”通常是指一種基因或其表達產物。例如，SEPT9(SEPTIN9)蛋白的UniProt登錄號可以是Q9UHD8。本發明中，SEPT9可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中SEPT9也可以表示檢測位點，例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以SEPT9表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“IKZF1”通常是指一種基因或其表達產物。例如，IKZF1(DNA-binding protein Ikaros)蛋白的UniProt登錄號可以是Q13422。本發明中，IKZF1可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中IKZF1也可以表示檢測位點，例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以IKZF1表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“BEST4”通常是指一種基因或其表達產物。例如，BEST4(Bestrophin-4)蛋白的UniProt登錄號可以是Q8NFU0。本發明中，BEST4可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中BEST4也可以表示檢測位點，例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以BEST4表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“B4GALNT1”通常是指一種基因或其表達產物。例如，B4GALNT1(Beta-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 1)蛋白的
UniProt登錄號可以是Q00973。本發明中，B4GALNT1可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中B4GALNT1也可以表示檢測位點，例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以B4GALNT1表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“GRASP”通常是指一種基因或其表達產物。例如，GRASP(GRP1(General receptor for phosphoinositides 1)-associated scaffold protein)蛋白的UniProt登錄號可以是K7CHN5。本發明中，GRASP可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中GRASP也可以表示檢測位點，例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以GRASP表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“IRF4”通常是指一種基因或其表達產物。例如，IRF4(Interferon regulatory factor 4)蛋白的UniProt登錄號可以是Q15306。本發明中，IRF4可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中IRF4也可以表示檢測位點，例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以IRF4表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“BEND4”通常是指一種基因或其表達產物。例如，BEND4(BEN domain-containing protein 4)蛋白的UniProt登錄號可以是Q6ZU67。本發明中，BEND4可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。例如，本發明中BEND4也可以表示檢測位點，
例如針對該基因特定核酸序列進行甲基化檢測。例如，以BEND4表示的檢測位點可以是該基因下的一個或多個區域的核酸序列。
在本發明中，術語“待測樣本”通常是指需要進行檢測的樣本。例如，可以檢測待測樣本上的一個或者多個基因區域是否存在有修飾狀態。
在本發明中，術語“無細胞游離核酸”或“cfDNA”通常是指樣品中的DNA，當採集時，該DNA沒有包含在細胞內。例如，無細胞游離核酸可以不是指藉由細胞或組織的體外破裂而使其不在細胞內的DNA。例如，cfDNA可以包括正常細胞和源自癌細胞的DNA兩者。例如，cfDNA可以獲自血液或血漿(“循環系統”)。例如，cfDNA可以藉由分泌或細胞死亡過程，如細胞壞死或凋亡釋放到循環系統中。
在本發明中，術語“互補核酸”通常是指與參考核苷酸序列相比具有互補的核苷酸序列。例如，互補核酸可以為視需要地具有相反方向的核酸分子。例如，該互補可以是指具有下面的互補性關聯：鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。
在本發明中，術語“DNA區域”通常是指兩個或更多個共價鍵合的天然存在的或經修飾的脫氧核糖核苷酸的序列。例如，基因的DNA區域可以是指該基因所位於的特定的脫氧核糖核苷酸的序列的位置，例如該脫氧核糖核苷酸的序列編碼該基因。例如，本發明的DNA區域包含DNA區域的全長、其互補區域，或者上述的片段。例如，本發明所提供的檢測區域的上下游至少約20kb的序列可以作為檢測的位點。例如，本發明所提供的區域的上下游至少約20kb、至少約15kb、至少約10kb、至少約5kb、至少約3kb、至少約2kb、至少約1kb、
或至少約0.5kb的序列可以作為檢測的位點。例如，可以根據該微電腦設計合適的引子和探針進行樣品的甲基化檢測。
在本發明中，術語“修飾狀態”通常是指本發明中基因片段、核苷酸或其鹼基具有的修飾狀態。例如，本發明中的修飾狀態可以是指胞嘧啶的修飾狀態。例如，本發明的具有修飾狀態的基因片段可以具有改變的基因表達活性。例如，本發明的修飾狀態可以是指鹼基具有的甲基化修飾。例如，本發明的修飾狀態可以是指在基因組DNA的CpG區域的胞嘧啶5'碳位共價結合一個甲基基團，例如可以成為5-甲基胞嘧啶(5mC)。例如，修飾狀態可以是指DNA序列內存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)。
在本發明中，術語“甲基化”通常是指本發明中基因片段、核苷酸或其鹼基具有的甲基化狀態。例如，本發明中基因所在的DNA片段可以在一條鏈或多條鏈上具有甲基化。例如，本發明中基因所在的DNA片段可以在一個位點或多個位點上具有甲基化。
在本發明中，術語“轉化”通常是指將一種或多種結構轉變為另一種結構。例如，本發明的轉化可以是具有特異性。例如，不具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以變為其它結構(例如尿嘧啶)，且具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以基本不發生變化。例如，不具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以被剪切，且具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以基本不發生變化。
在本發明中，術語“脫胺基試劑”通常是指具有移除胺基能力的物質。例如，脫胺基試劑可以將未修飾的胞嘧啶的胺基脫除。
在本發明中，術語“亞硫酸氫鹽”通常是指一種可以區分具有修飾狀態和不具有修飾狀態的DNA區域的試劑。例如，亞硫酸氫鹽可以包括亞硫酸
氫鹽、或其類似物或上述的組合。例如，亞硫酸氫鹽可以使未修飾的胞嘧啶的胺基脫胺基化，以使其與修飾的胞嘧啶區分。在本發明中，術語“類似物”通常是指具有類似結構和/或功能的物質。例如亞硫酸氫鹽的類似物可以與亞硫酸氫鹽具有類似的結構。例如，亞硫酸氫鹽的類似物可以是指一種同樣可以區分具有修飾狀態和不具有修飾狀態的DNA區域的試劑。
在本發明中，術語“甲基化敏感限制酶”通常是指一種根據其識別位點的甲基化狀態而選擇性消化核酸的酶。例如，對於當識別位點未被甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點被甲基化時，可以不會發生剪切，或以顯著降低的效率剪切。對於當識別位點被甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點未被甲基化時，可以不會發生剪切，或以顯著降低的效率剪切。例如，甲基化特異的限制酶可以識別含有CG二核苷酸(例如cgcg或cccggg)的序列。
在本發明中，術語“腫瘤”通常是指在正常生長和/或發育中呈現出至少部分失去控制的細胞和/或組織。例如，常見的腫瘤或癌細胞通常可以是失去了接觸抑制並可能是入侵性的和/或具有轉移的能力。例如，本發明的腫瘤可以是良性的，也可能是惡性的。
在本發明中，術語“進展”通常是指疾病從不太嚴重狀態到較嚴重狀態的變化。例如，腫瘤進展可以包括腫瘤的數量或嚴重性、癌細胞轉移程度、癌症生長或擴散的速度等增大。例如，腫瘤進展可以包括這種癌症從不太嚴重狀態到較嚴重狀態的階段時期，例如從I期到II期、從II期到III期等的進展。
在本發明中，術語“形成”通常是指個體體內出現病灶。例如，當腫瘤形成時，可以將該個體確診為腫瘤患者。
在本發明中，術語“螢光PCR”通常是指一種定量或半定量的PCR技術。例如，可以是實時定量聚合酶鏈反應、定量聚合酶鏈反應或動力學聚合酶鏈反應的PCR技術。例如，可以利用PCR擴增並借助嵌入性螢光染料或序列特異性探針定量檢測起始的靶核酸量，該序列特異性探針可以含有僅與靶核酸雜交才可檢出的螢光報導分子。
在本發明中，術語“PCR擴增”通常是指聚合酶鏈擴增反應。例如，本發明中的PCR擴增可以包含目前已知的用於DNA擴增的任意聚合酶鏈擴增反應。
在本發明中，術語“螢光Ct值”通常是指一種定量或半定量評估靶核酸的測量值。例如，可以是指螢光信號到達設定的域值時所經歷的擴增反應循環數。
[發明詳述]
本發明可以找到多種高效的肝臟腫瘤相關甲基化標誌物，提高肝腫瘤早篩早診效率，解決肝癌早診率低，臨床治療負擔重等問題。同時本發明提供多組高效的肝臟腫瘤甲基化標誌物，並列舉高效的標誌物組合。
甲基化標誌物組合
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標基因可以包含SEPT9和IKZF1。
例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中目標基因所在DNA區域或
其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標基因可以包含SEPT9和IKZF1。
例如，根據待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
例如，本發明的方法中，該SEPT9的DNA區域可以來源於人chr17：75276651-75496678。
例如，本發明的方法中，該IKZF1的DNA區域可以來源於人chr7：50343720-50472799。
例如，本發明的方法中，該目標基因還可以包含選自以下組的基因：BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、GRASP和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、IRF4、B4GALNT1和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含至少2種基因。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含2種至7種基因。例如，本發明的目標基因可以包含2種、3種、4種、5種、6種、或7種本發明提供的目標基因。例如，對相同的目標基因，本發明可以選擇該目標基因所在的一種或更多種的DNA區域。例如，本發明的方法中，該BEST4的DNA區域可以來源於人chr1：45249257-45253377。例如，本發明的方法中，該B4GALNT1的DNA區域可以來源於人chr12：58017193-58027138。例如，本發明的方法中，該GRASP的DNA區域可以來源於人chr12：52400724-52409673。例如，本發明的方法中，該IRF4的DNA區域可以來源於人chr6：391739-411447。例如，本發明的方法中，該BEND4的DNA區域可以來源於人chr4：42112955-42154895。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的2種：SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9和IKZF1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9和BEST4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9
和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1和BEST4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的3種：SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1和BEST4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，
該目標基因可以包含SEPT9、BEST4和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因
可以包含BEST4、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含GRASP、IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的4種：SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4和B4GALNT1。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1和BEND4。例
如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1、
IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的5種：SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1和GRASP。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的6種：SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP和IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP和IRF4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的7種：SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SEPT9、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。
例如，本發明的方法中位於SEPT9基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr17：75368651-75370720定義的區域。例如來源於人chr17：75369558-75369622定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由SEPT(1)表示。
例如，本發明的方法中位於IKZF1基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。例如來源於
人chr7：50343793-50343896定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由IKZF1(1)表示。
例如，本發明的方法中位於BEST4基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr1：45251728-45252477定義的區域。例如來源於人chr1：45252095-45252176定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由BEST4(1)表示。
例如，本發明的方法中位於B4GALNT1基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr12：58020498-58022962定義的區域。例如來源於人chr12：58021586-58021670定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由B4GALNT1(1)表示。
例如，本發明的方法中位於GRASP基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr12：52400724-52401698定義的區域。例如來源於人chr12：52401083-52401169定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由GRASP(1)表示。
例如，本發明的方法中位於IRF4基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr6：391739-394056定義的區域。例如來源於人chr6：392282-392377定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由IRF4(1)表示。
例如，本發明的方法中位於BEND4基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr4：42152705-42154895定義的區域。例如來源於人chr4：42153816-42153921定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由BEND4(1)表示。
例如，本發明的方法中位於SEPT9基因所在DNA區域的目標DNA區域可以包含來源於人chr17：75368651-75370720定義的區域。例如來源於人chr17：75369603-75369693定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由SEPT9(1a)表示。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域的特定的亞區域(例如目標DNA區域)、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標DNA區域可以包含來源於人chr17：75368651-75370720和來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標DNA區域可以包含來源於人chr17：75368651-75370720和來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。
例如，該目標DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的目標DNA區域可以是指目標基因組DNA的一個或多個特定區段。例如，本發明的目標DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，以SEPT9表示的目標DNA區域可以是SEPT9基因所在DNA區域的一個或多個特定區段。例如，以SEPT9表示的目標DNA區域可以是本發明提供的SEPT9基因中目標DNA區域的一個或多個特定區段。例如，SEPT9的一個或多個不同的特定區段可以藉由SEPT9(1)和SEPT9(1a)等可以區分的形式分別地表示。
例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同
的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：1所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr17：75369558-75369622定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由SEPT(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：2所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：3與4所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr17：75369558-75369622定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：5所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr7：50343793-50343896定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由IKZF1(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：6所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：7與8所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr7：50343793-50343896定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法中，該目標DNA區域還可以包含選自以下組定義的區域：來源於人chr1：45251728-45252477、來源於人chr12：58020498-58022962、來源於人chr12：52400724-52401698、來源於人chr6：391739-394056、和來源於人chr4：42152705-42154895。
例如，本發明的方法中，該目標DNA區域可以包含至少2個區域。
例如，本發明的方法中，該目標DNA區域可以包含2個至8個區域。例如，本發明的方法中，該目標DNA區域可以包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、或8個區域。
例如，本發明的方法中，該目標DNA區域可以包含來源於人chr17：75368651-75370720、來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr12：58020498-58022962定義的區域。
例如，本發明的方法中，該目標DNA區域可以包含來源於人chr17：75368651-75370720、來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人
chr1：45251728-45252477、來源於人chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：58020498-58022962定義的區域。
例如，本發明的方法中，該目標DNA區域可以包含來源於人chr6：391739-394056、來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr1：45251728-45252477、來源於人chr12：58020498-58022962、來源於人chr4：42152705-42154895和來源於人chr17：75368651-75370720定義的區域。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：9所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr1：45252095-45252176定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由BEST4(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：10所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：11與12所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr1：45252095-45252176定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：13所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr12：58021586-58021670定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由B4GALNT1(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：14所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：15與16所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr12：58021586-58021670定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：17所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr12：52401083-52401169定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由GRASP(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：18所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：19與20所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr12：52401083-52401169定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：21所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr6：392282-392377定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由IRF4(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：22所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：23與24所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr6：392282-392377定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：25所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr4：42153816-42153921定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由BEND4(1)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：26所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：27與28所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr4：42153816-42153921定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，本發明的方法可以包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：1所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
例如，本發明的方法中，該目標區域可以包含來源於人chr17：75369603-75369693定義的區域。例如，該目標DNA區域可以藉由SEPT9(1a)表示。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：29所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含提供SEQ ID NO：30與31所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，上述探針和/或引子組可以對來源於人chr17：75369603-75369693定義的區域的DNA區域進行檢測和/或擴增。
例如，上述目標區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
甲基化標誌物
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr12：24964295-25102393。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中BCAT1基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：25101630-25102393、來源於人chr：12：25078661-25079410和來源於人chr12：25054781-25056311。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA
區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：25101630-25102393、來源於人chr：12：25078661-25079410和來源於人chr12：25054781-25056311。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr12：25101630-25102393的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr：12：25078661-25079410的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr12：25054781-25056311的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：43。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：25102016-25102110、來源於人chr12：25101992-25102093、來源於人chr12：25079051-25079133和來源於人chr12：25056027-25056134。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述
的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：25102016-25102110、來源於人chr12：25101992-25102093、來源於人chr12：25079051-25079133和來源於人chr12：25056027-25056134。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr12：25102016-25102110、來源於人chr12：25101992-25102093、來源於人chr12：25079051-25079133和來源於人chr12：25056027-25056134。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：44。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：33所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25101630-25102393的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25102016-25102110的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：36所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25101630-25102393的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25101992-25102093的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：40所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人
chr：12：25078661-25079410的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25079051-25079133的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：44所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25054781-25056311的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：25056027-25056134的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：34與35、SEQ ID NO：37與38、SEQ ID NO：41與42和SEQ ID NO：45與46。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：34與35所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25101630-25102393的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25102016-25102110的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：37與38所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25101630-25102393的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25101992-25102093的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：41與42所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr：12：25078661-25079410的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25079051-25079133的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：45與46所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25054781-25056311的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：25056027-25056134的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr7：50343720：50472799。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中IKZF1基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr7：50450118-50450531和來源於人chr7：50467368-50469092。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr7：50450118-50450531和來源於人chr7：50467368-50469092。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：50343720-50344547的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：50450118-50450531的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：50467368-50469092的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：54。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：50343793-50343896、來源於人chr7：50343867-50343961、來源於人chr7：50450311-50450411和來源於人chr7：50467865-50467980。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：50343793-50343896、來源於人chr7：50343867-50343961、來源於人chr7：50450311-50450411和來源於人chr7：50467865-50467980。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：
來源於人chr7：50343793-50343896、來源於人chr7：50343867-50343961、來源於人chr7：50450311-50450411和來源於人chr7：50467865-50467980。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：55。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：6所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50343720-50344547的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50343793-50343896的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：47所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50343720-50344547的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50343867-50343961的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：51所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50450118-50450531的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50450311-50450411的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：55所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人
chr7：50467368-50469092的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：50467865-50467980的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：7與8、SEQ ID NO：48與49、SEQ ID NO：52與53和SEQ ID NO：56與57。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：7與8所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50343720-50344547的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50343793-50343896的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：48與49所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50343720-50344547的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50343867-50343961的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：52與53所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50450118-50450531的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50450311-50450411的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：56與57所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50467368-50469092的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：50467865-50467980的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中VAV3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr1：108113782-108507766。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中VAV3基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：108507215-108507766。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：108507215-108507766。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，
一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：108507215-108507766的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：58。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：108507591-108507674和來源於人chr1：108507624-108507725。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：108507591-108507674和來源於人chr1：108507624-108507725。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr1：108507591-108507674和來源於人chr1：108507624-108507725。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：62。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：59所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：108507215-108507766的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：108507591-108507674的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：62所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：108507215-108507766的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：108507624-108507725的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：60與61和SEQ ID NO：63與64。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：60與61所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：108507215-108507766的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：108507591-108507674的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：63與64所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：108507215-108507766的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：108507624-108507725的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中IRF4基因所在DNA區域或其片
段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr6：391739-411447。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中IRF4基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr6：391739-394056和來源於人chr6：401233-401801。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區
域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr6：391739-394056和來源於人chr6：401233-401801。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr6：391739-394056的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr6：401233-401801的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：71。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr6：392282-392377、來源於人chr6：392036-392145、來源於人chr6：392405-392500和來源於人chr6：401641-401752。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr6：392282-392377、來源於人chr6：392036-392145、來源於人chr6：392405-392500和來源於人chr6：401641-401752。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：
來源於人chr6：392282-392377、來源於人chr6：392036-392145、來源於人chr6：392405-392500和來源於人chr6：401641-401752。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：72。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：22所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：391739-394056的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：392282-392377的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：65所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：391739-394056的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：392036-392145的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：68所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：391739-394056的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：392405-392500的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：72所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人
chr6：401233-401801的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr6：401641-401752的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：23與24、SEQ ID NO：66與67、SEQ ID NO：69與70和SEQ ID NO：73與74。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：23與24所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：391739-394056的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：392282-392377的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：66與67所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：391739-394056的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：392036-392145的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：69與70所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：391739-394056的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：392405-392500的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：73與74所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：401233-401801的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr6：401641-401752的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr12：58017193-58027138。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或
稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中B4GALNT1基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：58020498-58022962和來源於人chr12：58025539-58027138。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：58020498-58022962和來源
於人chr12：58025539-58027138。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr12：58020498-58022962的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr12：58025539-58027138的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：78。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：58021586-58021670、來源於人chr12：58021907-58021987和來源於人chr12：58026383-58026475。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：58021586-58021670、來源於人chr12：58021907-58021987和來源於人chr12：58026383-58026475。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr12：58021586-58021670、來源於人chr12：58021907-58021987和來源於人chr12：58026383-58026475。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：79。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：14所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人
chr12：58020498-58022962的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：58021586-58021670的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：75所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：58020498-58022962的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：58021907-58021987的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：79所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：58025539-58027138的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：58026383-58026475的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：15與16、SEQ ID NO：76與77和SEQ ID NO：80與81。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：15與16所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：58020498-58022962的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：58021586-58021670的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：76與77所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：58020498-58022962的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：58021907-58021987的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：80與81所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：58025539-58027138的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：58026383-58026475的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中GRASP基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr12：52400724-52409673。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中GRASP基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：52406880-52409127。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：52406880-52409127。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr12：52400724-52401698的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr12：52406880-52409127的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺
失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：85。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：52401083-52401169、來源於人chr12：52400965-52401055和來源於人chr12：52408471-52408566。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：52401083-52401169、來源於人chr12：52400965-52401055和來源於人chr12：52408471-52408566。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr12：52401083-52401169、來源於人chr12：52400965-52401055和來源於人chr12：52408471-52408566。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：86。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：18所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：52400724-52401698的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：52401083-52401169的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：82所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：52400724-52401698的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：52400965-52401055的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：86所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：52406880-52409127的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr12：52408471-52408566的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：19與20、SEQ ID NO：83與84和SEQ ID NO：87與88。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：19與20所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對
來源於人chr12：52400724-52401698的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：52401083-52401169的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：83與84所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：52400724-52401698的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：52400965-52401055的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：87與88所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：52406880-52409127的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr12：52408471-52408566的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中BEST4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr1：45249257-45253377。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中BEST4基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr1：45249853-45250527。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修
飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr1：45249853-45250527。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：45251728-45252477的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：45249853-45250527的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：92。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：45252095-45252176、來源於人chr1：45252187-45252275和來源於人chr1：45249894-45249981。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：45252095-45252176、來源於人chr1：45252187-45252275和來源於人chr1：45249894-45249981。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr1：45252095-45252176、來源於人chr1：45252187-45252275和來源於人chr1：45249894-45249981。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：93。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：10所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：45251728-45252477的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：45252095-45252176的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：89所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：45251728-45252477的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：45252187-45252275的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：93所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：45249853-45250527的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：45249894-45249981的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：11與12、SEQ ID NO：90與91和
SEQ ID NO：94與95。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：11與12所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：45251728-45252477的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：45252095-45252176的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：90與91所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：45251728-45252477的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：45252187-45252275的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：94與95所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：45249853-45250527的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：45249894-45249981的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量
的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中BEND4基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr4：42112955-42154895。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中BEND4基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr4：42152705-42154895。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA
區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr4：42152705-42154895。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr4：42152705-42154895的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：25。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr4：42153816-42153921來源於人chr4：42153513-42153601。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr4：42153816-42153921來源於人chr4：42153513-42153601。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr4：42153816-42153921來源於人chr4：42153513-42153601。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：96。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：26所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr4：42152705-42154895的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr4：42153816-42153921的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：96所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr4：42152705-42154895的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr4：42153513-42153601的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：27與28和SEQ ID NO：97與98。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：27與28所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr4：42152705-42154895的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr4：42153816-42153921的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：97與98所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr4：42152705-42154895的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr4：42153513-42153601的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA
區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：145389746-145401075、來源於人chr1：145384910-145385929和來源於人chr1：145406714-145408013。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以
包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：145389746-145401075、來源於人chr1：145384910-145385929和來源於人chr1：145406714-145408013。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：145389746-145401075的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：145384910-145385929的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：145406714-145408013的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：110。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：145399249：145399476、來源於人chr1：145396880-145396983、來源於人chr1：145385298-145385376和來源於人chr1：145407431-145407518。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：145399249：145399476、來源於人chr1：145396880-145396983、來源於人chr1：145385298-145385376和來源於人chr1：145407431-145407518。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr1：145399249：145399476、來源於人chr1：145396880-145396983、來源於人chr1：145385298-145385376和來源於人chr1：145407431-145407518。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：111。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：100所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145389746-145401075的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145399249：145399476的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：103所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145389746-145401075的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145396880-145396983的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：107所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145384910-145385929的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145385298-145385376的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：111所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145406714-145408013的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：145407431-145407518的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：101與102、SEQ ID NO：104與105、SEQ ID NO：108與109和SEQ ID NO：112與113。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：101與102所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145389746-145401075的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145399249：145399476的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：104與105所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145389746-145401075的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145396880-145396983的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：108與109所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145384910-145385929的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組
作為引子組，可以針對來源於人chr1：145385298-145385376的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：112與113所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145406714-145408013的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：145407431-145407518的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA
區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：26416257-26416363來源於人chr7：26416026-26416126。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述
的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：26416257-26416363來源於人chr7：26416026-26416126。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr7：26416257-26416363來源於人chr7：26416026-26416126。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：117。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：114所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：26416257-26416363的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：117所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：26416026-26416126的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：115與116和SEQ ID NO：118與119。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：115與116所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：26416257-26416363的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：118與119所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：26416026-26416126的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中GPAM基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr10：113909624-113975135。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描
述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中GPAM基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr10：113942657-113943906。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr10：113942657-113943906。例如，
該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr10：113942657-113943906的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：120。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr10：113943540：113943739來源於人chr10：113943511-113943582。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr10：113943540：113943739來源於人chr10：113943511-113943582。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr10：113943540：113943739來源於人chr10：113943511-113943582。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：124。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：121所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr10：113942657-113943906的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr10：113943540：113943739的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：124所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人
chr10：113942657-113943906的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr10：113943511-113943582的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：122與123和SEQ ID NO：125與126。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：122與123所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr10：113942657-113943906的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr10：113943540：113943739的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：125與126所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr10：113942657-113943906的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr10：113943511-113943582的DNA區域進行擴增。
一方面，本發明提供一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認肝腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為肝腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根
據待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為肝腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估肝腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中VASH2基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與肝腫瘤的發生有關聯。
例如，本發明的該DNA區域可以來源於人chr1：213123862-213165379。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中VASH2基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人
chr1：213123862-213125211。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：213123862-213125211。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr1：213123862-213125211的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：127。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：213124569-213124670來源於人chr1：213124036-213124162。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr1：213124569-213124670來源於人chr1：213124036-213124162。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr1：213124569-213124670來源於人chr1：213124036-213124162。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：131。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：128所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：213123862-213125211的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：213124569-213124670的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：131所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：213123862-213125211的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr1：213124036-213124162的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：129與130和SEQ ID NO：132與133。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：129與130所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：213123862-213125211的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組
作為引子組，可以針對來源於人chr1：213124569-213124670的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：132與133所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：213123862-213125211的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr1：213124036-213124162的DNA區域進行擴增。
例如，該疾病可以包含腫瘤。例如，該疾病可以包含實體瘤。例如，該疾病可以包含肝腫瘤等任意的腫瘤。
例如，“引子”可以是天然的或合成的寡核苷酸，其在與多核苷酸模板形成雙鏈體後能夠充當核酸合成的起始點並從其3'端沿模板延伸，從而形成延伸的雙鏈體。在延伸過程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列決定。引子通常可以藉由聚合酶如核酸聚合酶延伸。
例如，本發明的“互補的”和“基本上互補的”可以包括在核苷酸或核酸之間，例如在雙鏈DNA分子的兩條鏈之間，或在寡核苷酸引子和單鏈核酸上的引子結合位點之間的雜交或鹼基配對或雙鏈體的形成。互補的核苷酸可以通常是A和T(或A和U)或C和G。對於兩個單鏈RNA或DNA分子，當一條鏈的核苷酸在進行最佳比對和比較並且具有適當的核苷酸插入或缺失時與另一條鏈的至少約80%(通常至少約90%至約95%，甚至約98%至約100%)成對時，可以認為它們是基本互補的。在一個方面，兩個互補的核苷酸序列能夠雜交，並且可以在反向的核苷酸之間有小於25%的錯配，更可以以小於15%的錯配，可以以小於5%的錯配，或不具有錯配。例如，兩個分子可以在高嚴格條件下雜交。
例如，本發明的修飾狀態可以是指該修飾狀態在DNA區域內部一個特定核苷酸或多個核苷酸處的存在、不存在和/或其含量。例如，本發明的修飾狀態可以是指特定DNA序列中每個鹼基或每個特定鹼基(例如胞嘧啶)的修飾狀態。例如，本發明的修飾狀態可以是指特定DNA序列中鹼基對組合和/或鹼基組合的修飾狀態。例如，本發明的修飾狀態可以是指特定DNA序列(包括基因所在DNA區域或其特定區域片段)中關於區域修飾密度的信息，而可以不提供該序列中何處發生修飾的精確位置信息。
例如，本發明的修飾狀態可以是指甲基化狀態或與甲基化類似的狀態。例如，具有或具有較高的甲基化的狀態可以是與特定區域的轉錄沉默相關的。例如，具有或具有較高的甲基化的狀態可以是與能夠被甲基化特異性轉化試劑(例如脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶)轉化相關的。例如，轉化可以是指被轉變為其它物質和/或被剪切或消化。
例如，“甲基化狀態(methylation state)”或“甲基化狀態(methylation status)”可以是指在DNA序列內的一個或多個CpG二核苷酸處存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mC”或“5-mCyt”)。DNA序列內一個或多個特定CpG甲基化位點(每個都有兩個CpG二核苷酸序列)處的甲基化狀態包括“未甲基化”、“完全甲基化”和“半甲基化”。術語“半甲基化”可以是指雙鏈DNA的甲基化狀態，其中該雙鏈DNA僅有一條鏈被甲基化。術語“高甲基化”可以是指與以下情況相對應的平均甲基化狀態：相對於正常對照DNA樣品中相應CpG二核苷酸處發現的5-mCyt量，測試DNA樣品的DNA序列中的一個或多個CpG二核苷酸處5-mCyt的存在增加。術語“低甲基化”可以是指與以下情況相對應的平均甲基化狀態：相對於
正常對照DNA樣品中相應CpG二核苷酸處發現的5-mCyt量，測試DNA樣品的DNA序列中的一個或多個CpG二核苷酸處5-mCyt的存在降低。
例如，該方法還可以包含獲取待測樣本中的核酸。例如，該核酸可以包含無細胞游離核酸。例如，該待測樣本可以包含組織、細胞和/或體液。例如，該待測樣本可以包含血漿。例如，本發明的檢測方法可以對任何適合的生物樣品進行。例如，待測樣本可以為生物材料的任何樣品，例如其可以源自動物，但不限於細胞材料、生物流體(例如血液)、排出物、組織活組織檢查標本、手術標本或已經導入動物身體中並且隨後取出的流體。例如，本發明的待測樣本可以包含在該樣本分離後經任何形式處理的樣本。
例如，該方法還可以包含轉化該DNA區域或其片段。例如，藉由本發明的轉化步驟，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後可以形成不同的物質。例如，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後可以改變為與該鹼基不同的其它鹼基(例如，該其它鹼基可以包含尿嘧啶)、或在轉化後被剪切。例如，該鹼基可以包含胞嘧啶。例如，該修飾狀態可以包含甲基化修飾。例如，該轉化可以包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。例如，該脫胺基試劑可以包含亞硫酸氫鹽或其類似物。例如，亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀。
例如，該方法還可以視需要地包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。例如，該擴增可以包含PCR擴增。例如，本發明的擴增可以包含已知的任意一種擴增系統。例如，本發明的擴增步驟可以是視需要地。例如，“擴增”可以是指產生所需序列的多個拷貝的過程。“多個拷貝”可以是指至少兩個拷貝。“拷貝”可以不意味
著與模板序列具有完美的序列互補性或同一性。例如，拷貝可以包括核苷酸類似物如脫氧肌苷，有意的序列改變(例如藉由包含與模板可雜交但不互補的序列的引子引入的序列改變)，和/或在擴增過程中可以發生序列錯誤。
例如，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法可以包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。例如，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法可以包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。例如，可以直接檢測具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。例如，可以藉由以下方式檢測：具有該修飾狀態的DNA區域或其片段可以在反應(例如擴增反應)的過程中可以與不具有該修飾狀態的DNA區域或其片段具有不同的特性。例如，在螢光PCR方法中，具有該修飾狀態的DNA區域或其片段可以被特異性擴增，並發出螢光；不具有該修飾狀態的DNA區域或其片段可以基本不被擴增，並基本不發出螢光。例如，確定具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量的替代方法，可以包含在本發明的範圍之內。
例如，可以藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。例如，可以藉由該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定肝腫瘤的存在、或者有肝腫瘤形成或形成的風險。例如，當該待測樣本的螢光Ct值相對於參考螢光Ct值更低時，可以確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或可以確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的含量高於參考樣本中的修飾狀態的含量。例如，可以藉由檢測參考樣本確定該參考螢光Ct值。例如，當該待測樣本的螢光Ct值相對於參考螢光Ct值更高
或基本相當時，也可以不排除該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在；當該待測樣本的螢光Ct值相對於參考螢光Ct值更高或基本相當時，可以確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的含量低於或基本等於參考樣本中的修飾狀態的含量。
例如，本發明可以藉由循環閾值(即Ct值)來表示特定DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，例如包括待測樣本的甲基化水平和參考水平。例如，Ct值可以是指在背景信號以上可以檢測到PCR產物的螢光的循環數。例如，Ct值與樣品中目標標記物的起始數量可以成負相關關係，即Ct值越低，待測樣品中DNA區域或其片段的修飾狀態的數量越多。
例如，當待測樣品的Ct值相對於其相應的參考Ct值相同或更低可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當待測樣品的Ct值相對於其相應的參考Ct值低至少1個循環、至少2個循環、至少5個循環、至少10個循環、至少20個循環、或至少50個循環時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本的Ct值相對於其相應的參考Ct值相同或更高，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本的Ct值相對於其相應的參考Ct值高至少1個循環、至少2個循環、至少5個循環、至少10個循環、至少20個循環、或至少50個循環時，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受
試者的樣本的Ct值相對於其相應的參考Ct值疾病相同時，可以確認為存在或不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或未形成、具有或不具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展，並同時可以給出需要進一步檢測的建議。
例如，本發明的參考水平或對照水平可以是指是正常水平或健康水平。例如，該正常水平可以是來源於無該疾病的細胞、組織或個體的樣本DNA區域的修飾狀態水平。例如，當用於腫瘤的評估，該正常水平可以是來源於無腫瘤的細胞、組織或個體的樣本DNA區域的修飾狀態水平。例如，當用於肝腫瘤的評估，該正常水平可以是來源於無肝腫瘤的細胞、組織或個體的樣本DNA區域的修飾狀態水平。
例如，在本發明中參考水平可以是指將受試者或樣本確認為存在或不存在特定疾病的閾值水平。例如，在本發明中參考水平可以是指將受試者診斷為特定疾病的形成或具有形成風險的閾值水平。例如，在本發明中參考水平可以是指將受試者評估為特定疾病的某種進展的閾值水平。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態高於或基本等於相應參考水平時，例如此處參考水平可以是指不具有特定疾病患者的DNA區域的修飾狀態，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，本發明中的A與B“基本等於”可以是指A與B的差值為1%或更少、0.5%或更少、0.1%或更少、0.01%或更少、0.001%或更少或0.0001%或更少。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態高於相應參考水平至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為
特定疾病的某種進展。例如，當多次檢測中的至少一次、至少兩次、或至少三次的檢測中，細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態高於相應參考水平至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態低於或基本等於相應參考水平時，例如此處參考水平可以是指具有特定疾病患者的DNA區域的修飾狀態，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態低於相應參考水平至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少100%時，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
所屬技術領域具有通常知識者可以根據期望的靈敏度和特異性來選擇參考水平。例如，在本發明中各種情況下的參考水平可以是本領域人員容易確認的，如根據有限次嘗試確認合適的參考水平和/或合適的獲取參考水平的手段，例如，參考水平可以源自一個或多個參考樣品，其中參考水平獲自與檢測目的樣品的實驗平行進行的實驗。或者，也可以在數據庫中獲得參考水平，該數據庫包括來自一個或多個參考樣品或疾病參考樣品的數據、標準或水平的集合。在一些實施方式中，數據、標準或水平的集合可以被標準化或歸一化，以便可用
於與來自一個或多個樣品的數據進行比較，從而用於減少不同檢測條件下產生的誤差。
例如，參考水平可以來源於數據庫，該數據庫可以是參考數據庫，例如包括來自一個或多個參考樣品的目標標記物和/或其他實驗室和臨床數據的修飾狀態水平。例如，可以藉由匯總獲自健康個體和/或非相應疾病患者個體(即已知沒有該疾病的個體)的參考樣品的參考水平數據來建立參考數據庫。例如，可以藉由匯總獲自正在接受治療的患有相應疾病個體的參考樣品的參考水平數據來建立參考數據庫。例如，可以藉由匯總獲自疾病不同階段的個體的參考樣品的數據來建立參考數據庫。例如，例如不同階段可以是藉由本發明目標標記物的不同的修飾狀態水平來證明的。所屬技術領域具有通常知識者還可以基於各種因素，例如年齡、性別、病史、家族史、症狀等，來確定個體是否患相應疾病或具有患相應疾病的風險。
例如，本發明的方法可以包含以下步驟：獲取待測樣本中的核酸；轉化該DNA區域或其片段；確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
例如，本發明的方法可以包含以下步驟：獲取待測樣本中的核酸；轉化該DNA區域或其片段；擴增待測樣本中該DNA區域或其片段；確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
例如，本發明的方法可以包含以下步驟：獲取待測樣本中的核酸；用試劑處理從待測樣品中獲得的DNA，該試劑能夠區分該DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA；可選地擴增待測樣本中該DNA區域或其片段；定量、半定量或定性分析待測樣本中經處理的DNA的甲基化狀態
的存在和/或含量；比較測樣本中經處理的DNA的甲基化水平以及相應的參考水平，當待測樣本中的DNA區域的甲基化狀態高於或基本等於相應參考水平時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
另一方面，本發明提供一種核酸，該核酸可以包含能夠結合本發明目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。例如，該核酸可以是本發明的任一種探針。另一方面，本發明提供一種製備核酸的方法，可以包含根據本發明目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，製備核酸的方法可以是本領域已知的任意合適的方法。
另一方面，本發明提供一種核酸組，該核酸組可以包含能夠結合本發明目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。例如，該核酸組可以是本發明的任一種引子組。另一方面，本發明提供一種製備核酸組的方法，可以包含根據本發明目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。例如，製備核酸組中的核酸的方法可以是本領域已知的任意合適的方法。例如，可以使用單個探針或引子評估靶多核苷酸的甲基化狀態，該單個探針或引子被配置成與該靶多核苷酸雜交。例如，可以使用多個探針或引子評估靶多核苷酸的甲基化狀態，該多個探針或引子被配置成與該靶多核苷酸雜交。
另一方面，本發明提供一種核酸，該核酸包含能夠結合如本發明所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列；另一方面，本發明提供一種核酸，該核酸可以包含能夠結合如本發明所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
另一方面，本發明提供一種製備核酸的方法，該方法可以包含根據如本發明所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸；另一方面，本發明提供一種核酸，該方法可以包含根據如本發明所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種核酸組，該核酸組包含能夠結合如本發明所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列；另一方面，本發明提供一種核酸，該核酸組可以包含能夠結合如本發明所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。例如，製備核酸的方法可以是本領域已知的任意合適的方法。
另一方面，本發明提供一種製備核酸組的方法，該方法可以包含根據如本發明所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標基因所在
DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組；另一方面，本發明提供一種核酸，該方法可以包含根據如本發明所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。例如，可以使用單個探針或引子評估靶多核苷酸的甲基化狀態，該單個探針或引子被配置成與該靶多核苷酸雜交。例如，可以使用多個探針或引子評估靶多核苷酸的甲基化狀態，該多個探針或引子被配置成與該靶多核苷酸雜交。
另一方面，本發明提供一種試劑盒，可以包含如本發明的核酸和/或本發明的核酸組。例如，本發明的試劑盒可以可選地包含相應用途的參考樣本或提供相應用途的參考水平。
診斷方法、製備用途
例如，本發明的方法可以用於受試者中的癌症或腫瘤形成的診斷、預後、分層、風險評估或治療監測。例如，“受試者”可以是指可以對之施用或施加本發明提供的方法、核酸、核酸組、試劑盒、裝置和系統的生物體或該生物體的一部分或組分。例如，該受試者可以是哺乳動物或該哺乳動物的細胞、組織、器官或一部分。如本文所用，“哺乳動物”是指任何種類的哺乳動物，較佳人(包括人、人受試者或人患者)。受試者和哺乳動物包括，但不限於，農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓和齧齒類動物如小鼠和大鼠。
另一方面，本發明所述方法可用於評估任何合適的受試者中的癌症或腫瘤形成。例如，本發明所述方法可用於評估哺乳動物中的癌症或腫瘤形成。該哺乳動物可以是非人哺乳動物，例如寵物，農場動物，伴侶動物或實驗動
物。較佳地，該哺乳動物是人。例如，受試者可以是需要進行癌症或腫瘤形成風險篩查的人，高危人群中的人，被診斷為患有癌症或腫瘤形成但需要進一步分層或分級的人，被診斷為患有癌症或腫瘤形成且正在接受積極治療的人，或患有癌症或腫瘤形成並正在緩解的人。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備確定DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
另一方面，本發明提供一種確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的方法，可以包括提供本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，其可以用於確定該DNA區域或其片段的修飾狀態。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供一種疾病檢測方法，可以包括提供本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，其可以用於進行疾病檢測。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估
疾病的進展的物質中的應用。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包括提供本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，其可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域可以包含如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒。該用於確定的DNA區域可以包含如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，其可以用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展。該用於確定的DNA區域可以包含如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域可以包含如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段。
另一方面，本發明提供確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒。該用於確定的DNA區域可以包含如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，其可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展。該用於確定的DNA區域可以包含如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段。
例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如實體瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。例如，本發明應用中，該修飾狀態可以包含甲基化修飾。
另一方面，本發明提供如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合，在製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明提供確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，可以包含提供本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合。
另一方面，本發明提供如本發明的方法中該目標基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合，其可以用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展。
另一方面，本發明提供如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含提供如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供如本發明的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合，其可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展。例如，本發明應用中，該疾病可以包含腫瘤。例如，本發明應用中，該疾病可以包含肝腫瘤。
另一方面，本發明提供一種設備，其可以包含本發明的儲存介質。另一方面，本發明提供了一種非易失性計算機可讀存儲介質，其上存儲有計算機程序，該程序被處理器執行以實現本發明所述的任一種或多種的方法。例如，該方法可以含有使用甲基化指標對具有不同癌性可能性的樣品進行分類的方法。
示例性分類算法可以是線性判別分析、邏輯回歸、樸素貝葉斯分類、感知分類、二次分類、k近鄰法、提升方法、決策樹、隨機森林、神經網絡、學習向量量化或支持向量機、或其組合。例如，該非易失性計算機可讀存儲介質可以包括軟碟、柔性碟、硬碟、固態存儲(SSS)(例如固態驅動(SSD))、固態卡(SSC)、固態模塊(SSM))、企業級閃存驅動、磁帶或任何其他非臨時性磁介質等。非易失性計算機可讀存儲介質還可以包括打孔卡、紙帶、光標片(或任何其他具有孔型圖案或其他光學可識別標記的物理介質)、壓縮碟唯讀存儲器(CD-ROM)、可重寫式光碟(CD-RW)、數字通用光碟(DVD)、藍光光碟(BD)和/或任何其他非臨時性光學介質。
例如，本發明的設備還可以包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現本發明的方法。例如，該設備可以實現各種機制以便確保在數據庫系統上執行的本發明所述的方法產生正確的結果。在本發明中，該設備可以使用磁盤作為永久性數據存儲器。
在本發明中，該設備可以為多個數據庫客戶端提供數據庫存儲和處理服務。該設備可以跨多個共享存儲設備存儲數據庫數據，和/或可以利用具有多個執行節點的一個或更多個執行平臺。該設備可以被組織成使得存儲和計算資源可以被有效地無限擴展。
本發明利用螢光PCR檢測技術，檢測白膜層(其中大多數為白細胞)、癌旁組織和肝癌組織相關標誌物的甲基化情況。初步確認該標誌物用於血液檢測肝腫瘤的潛能。理想的肝癌甲基化檢測標誌物應該具備以下特徵：1.白膜層DNA甲基化水平低；2.肝癌組織DNA甲基化水平高。
甲基化標誌物檢測可以採用甲基化特異PCR(MSP)來進行，MSP的基本原理是在檢測中，只有甲基化的序列模板產生擴增信號，而非甲基化的序列模板不產生擴增信號。該方法可藉由引子或者探針設計甲基化特異序列來實現，也可以同時設計甲基化特異的引子、探針對來實現。其主要步驟包括：1.根據標誌物序列，在適合進行MSP的檢測區段(可以為CpG富集區域)，設計檢測引子和探針。2.進行白細胞和組織樣本的核酸提取。3.對核酸進行亞硫酸氫鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶維持序列不變。4.進行螢光PCR檢測。
經白細胞和組織樣本檢測，滿足上述特徵的標誌物，證明其存在藉由血液來檢測肝癌的潛能。然後在血漿樣本中，對這些標誌物進行驗證，檢測樣本包括對照組、肝癌組以及B型肝炎、肝硬化干擾人群。分析這些標誌物的參考水平及標誌物組合性能。因單個樣本血漿游離DNA有限，可選地進行螢光PCR檢測時，可以對靶點進行了預擴增，以使最少量的DNA能夠檢測盡可能多的甲基化位點。其主要步驟包括：1.血漿樣本的核酸提取。2.對核酸進行亞硫酸氫鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶維持序列不變。3.進行靶點的預擴增及稀釋。4.進行螢光PCR檢測。
在靶點組合分析時，也可在上述靶點組合基礎上，再進行任意組合形式，或者在數據算法上引入機器學習的數學模型，如線性回歸、支持向量回歸、脊回歸、隨機森林等等，得到檢測準確性高的肝癌甲基化檢測標誌物組合。
本申提供的內容：1.找到了眾多具有優異性能的肝癌甲基化標誌物；2.開發了檢測準確性高的肝癌甲基化檢測標誌物組合；3.檢測性能較已有的螢光PCR檢測方法有大幅提升；4.可以較二代測序檢測方法相比，具備易開展、
易臨床推廣、成本低等眾多優勢。本發明提供的標誌物以及標誌物的組合，其應用方式可以不限於特定的檢測方式。
[實施方案]
1.一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
2.一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
3.如實施方案1或2所述的方法，該DNA區域來源於人chr12：24964295-25102393、來源於人chr7：50343720：50472799、來源於人chr1：108113782-108507766、來源於人chr6：391739-411447、來源於人chr12：58017193-58027138、來源於人chr12：52400724-52409673、來源於人chr1：45249257-45253377、來源於人chr4：42112955-42154895、來源於人chr1：145384249：145413094、來源於人chr7：26415938：26416740、來源於人chr10：113909624-113975135、和/或來源於人chr1：213123862-213165379。
4.如實施方案1至3中任一項所述的方法，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
5.如實施方案4所述的方法，該核酸包含無細胞游離核酸。
6.如實施方案1至5中任一項所述的方法，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
7.如實施方案1至6中任一項所述的方法，該待測樣本包含血漿。
8.如實施方案1至7中任一項所述的方法，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
9.如實施方案8所述的方法，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
10.如實施方案8或9所述的方法，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
11.如實施方案9或10所述的方法，該鹼基包含胞嘧啶。
12.如實施方案1至11中任一項所述的方法，該修飾狀態包含甲基化修飾。
13.如實施方案10至12中任一項所述的方法，該其它鹼基包含尿嘧啶。
14.如實施方案8至13中任一項所述的方法，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
15.如實施方案14所述的方法，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
16.如實施方案1至15中任一項所述的方法，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質
的存在和/或含量。
17.如實施方案1至16中任一項所述的方法，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
18.如實施方案1至17中任一項所述的方法，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
19.如實施方案1至18中任一項所述的方法，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定肝腫瘤的存在、或者有肝腫瘤形成或形成的風險。
20.如實施方案1至19中任一項所述的方法，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
21.如實施方案20所述的方法，該擴增包含PCR擴增。
22.一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：25101630-25102393、來源於人chr：12：25078661-25079410和來源於人chr12：25054781-25056311、或者來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr7：50450118-50450531和來源於人chr7：50467368-50469092、或者來源於人chr1：108507215-108507766、或者來源於人chr6：391739-394056和來源於人chr6：401233-401801、或者來源於人chr12：58020498-58022962和來源於人chr12：58025539-58027138、或者來源於人
chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：52406880-52409127、或者來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr1：45249853-45250527、或者來源於人chr4：42152705-42154895、或者來源於人chr1：145389746-145401075、來源於人chr1：145384910-145385929和來源於人chr1：145406714-145408013、或者來源於人chr7：26416257-26416363和來源於人chr7：26416026-26416126、或者來源於人chr10：113942657-113943906、或者來源於人chr1：213123862-213125211。
23.一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr12：25101630-25102393、來源於人chr：12：25078661-25079410和來源於人chr12：25054781-25056311、或者來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr7：50450118-50450531和來源於人chr7：50467368-50469092、或者來源於人chr1：108507215-108507766、或者來源於人chr6：391739-394056和來源於人chr6：401233-401801、或者來源於人chr12：58020498-58022962和來源於人chr12：58025539-58027138、或者來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr1：45249853-45250527、或者來源於人chr4：42152705-42154895、或者來源於人chr1：145389746-145401075、來源於人chr1：145384910-145385929和來源於人chr1：145406714-145408013、或者來源於人chr7：26416257-26416363和來源於人chr7：26416026-26416126、或者來源於人chr10：113942657-113943906、或者來源於人chr1：213123862-213125211。
24.如實施方案22或23所述的方法，包含提供能夠結合包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：43、或者SEQ ID NO：
5、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：54、或者SEQ ID NO：58、或者SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：71、或者SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：78、或者SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：85、或者SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：92、或者SEQ ID NO：25、或者SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：110、或者SEQ ID NO：120、或者SEQ ID NO：127。
25.如實施方案22至24中任一項所述的方法，包含提供能夠結合包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr12：25102016-25102110、來源於人chr12：25101992-25102093、來源於人chr12：25079051-25079133和來源於人chr12：25056027-25056134、或者來源於人chr7：50343793-50343896、來源於人chr7：50343867-50343961、來源於人chr7：50450311-50450411和來源於人chr7：50467865-50467980、或者來源於人chr1：108507591-108507674和來源於人chr1：108507624-108507725、或者來源於人chr6：392282-392377、來源於人chr6：392036-392145、來源於人chr6：392405-392500和來源於人chr6：401641-401752、或者來源於人chr12：58021586-58021670、來源於人chr12：58021907-58021987和來源於人chr12：58026383-58026475、或者來源於人chr12：52401083-52401169、來源於人chr12：52400965-52401055和來源於人chr12：52408471-52408566、或者來源於人chr1：45252095-45252176、來源於人chr1：45252187-45252275和來源於人chr1：45249894-45249981、或者來源於人chr4：42153816-42153921和來源於人chr4：42153513-42153601、或者來源於人chr1：145399249：145399476、來源於人chr1：145396880-145396983、來源於人chr1：145385298-145385376和來源於人chr1：145407431-145407518、或者來源於人chr10：113943540：113943739和來源於
人chr10：113943511-113943582、或者來源於人chr1：213124569-213124670和來源於人chr1：213124036-213124162。
26.如實施方案22至25中任一項所述的方法，包含提供選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：44、或者SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：55、或者SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：62、或者SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：72、或者SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：79、或者SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：86、或者SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：93、或者SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：96、或者SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：111、或者SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：117、或者SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：124、或者SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：131。
27.如實施方案22至26中任一項所述的方法，包含提供選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：34與35、SEQ ID NO：37與38、SEQ ID NO：41與42和SEQ ID NO：45與46、或者SEQ ID NO：7與8、SEQ ID NO：48與49、SEQ ID NO：52與53和SEQ ID NO：56與57、或者SEQ ID NO：60與61和SEQ ID NO：63與64、或者SEQ ID NO：23與24、SEQ ID NO：66與67、SEQ ID NO：69與70和SEQ ID NO：73與74、或者SEQ ID NO：15與16、SEQ ID NO：76與77和SEQ ID NO：80與81、或者SEQ ID NO：19與20、SEQ ID NO：83與84和SEQ ID NO：87與88、或者SEQ ID NO：11與12、SEQ ID NO：90與91和SEQ ID NO：94與95、或者SEQ ID
NO：27與28和SEQ ID NO：97與98、或者SEQ ID NO：101與102、SEQ ID NO：104與105、SEQ ID NO：108與109和SEQ ID NO：112與113、或者SEQ ID NO：115與116和SEQ ID NO：118與119、或者SEQ ID NO：122與123和SEQ ID NO：125與126、或者SEQ ID NO：129與130和SEQ ID NO：132與133。
28.如實施方案22至27中任一項所述的方法，該疾病包含腫瘤。
29.如實施方案22至28中任一項所述的方法，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
30.如實施方案29所述的方法，該核酸包含無細胞游離核酸。
31.如實施方案22至30中任一項所述的方法，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
32.如實施方案22至31中任一項所述的方法，該待測樣本包含血漿。
33.如實施方案22至32中任一項所述的方法，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
34.如實施方案33所述的方法，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
35.如實施方案33或34所述的方法，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
36.如實施方案34或35所述的方法，該鹼基包含胞嘧啶。
37.如實施方案22至36中任一項所述的方法，該修飾狀態包含甲
基化修飾。
38.如實施方案35至37中任一項所述的方法，該其它鹼基包含尿嘧啶。
39.如實施方案33至38中任一項所述的方法，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
40.如實施方案39所述的方法，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
41.如實施方案22至40中任一項所述的方法，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
42.如實施方案22至41中任一項所述的方法，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
43.如實施方案22至42中任一項所述的方法，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
44.如實施方案22至43中任一項所述的方法，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定肝腫瘤的存在、或者有肝腫瘤形成或形成的風險。
45.如實施方案22至44中任一項所述的方法，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA
區域或其片段。
46.如實施方案45所述的方法，該擴增包含PCR擴增。
47.一種核酸，該核酸包含能夠結合BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
48.一種製備核酸的方法，包含根據BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
49.一種核酸組，該核酸組包含能夠結合BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
50.一種製備核酸組的方法，包含根據BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的
區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。
51.一種試劑盒，包含如實施方案47所述的核酸和/或實施方案49所述的核酸組。
52.如實施方案47所述的核酸、如實施方案49所述的核酸組和/或實施方案51所述的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。
53.如實施方案47所述的核酸、如實施方案49所述的核酸組和/或實施方案51所述的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
54.如實施方案47所述的核酸、如實施方案49所述的核酸組和/或實施方案51所述的試劑盒，在製備確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
55.用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域或其片段。
56.用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用，該DNA區域包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：來源於人chr12：25101630-25102393、來源於人chr：12：25078661-25079410
和來源於人chr12：25054781-25056311、或者來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr7：50450118-50450531和來源於人chr7：50467368-50469092、或者來源於人chr1：108507215-108507766、或者來源於人chr6：391739-394056和來源於人chr6：401233-401801、或者來源於人chr12：58020498-58022962和來源於人chr12：58025539-58027138、或者來源於人chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：52406880-52409127、或者來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr1：45249853-45250527、或者來源於人chr4：42152705-42154895、或者來源於人chr1：145389746-145401075、來源於人chr1：145384910-145385929和來源於人chr1：145406714-145408013、或者來源於人chr7：26416257-26416363和來源於人chr7：26416026-26416126、或者來源於人chr10：113942657-113943906、或者來源於人chr1：213123862-213125211、。
57. BCAT1、IKZF1、VAV3、IRF4、B4GALNT1、GRASP、BEST4、BEND4、GPAM、VASH2基因所在DNA區域、來源於人chr1：145384249：145413094所在DNA區域、和/或來源於人chr7：26415938：26416740所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用。
58.選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用：來源於人chr12：25101630-25102393、來源於人chr：12：25078661-25079410和來源於人chr12：25054781-25056311、或者來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人
chr7：50450118-50450531和來源於人chr7：50467368-50469092、或者來源於人chr1：108507215-108507766、或者來源於人chr6：391739-394056和來源於人chr6：401233-401801、或者來源於人chr12：58020498-58022962和來源於人chr12：58025539-58027138、或者來源於人chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：52406880-52409127、或者來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr1：45249853-45250527、或者來源於人chr4：42152705-42154895、或者來源於人chr1：145389746-145401075、來源於人chr1：145384910-145385929和來源於人chr1：145406714-145408013、或者來源於人chr7：26416257-26416363和來源於人chr7：26416026-26416126、或者來源於人chr10：113942657-113943906、或者來源於人chr1：213123862-213125211。
59.一種儲存介質，其記載可以運行實施方案1至46中任一項所述的方法的程序。
60.一種設備，其包含實施方案59所述的儲存介質。
61.如實施方案59所述的設備，還包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現實施方案1至46中任一項所述的方法。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本發明的方法和用途等，而不用於限制本發明發明的範圍。
[實施例]
實施例1
比較肝癌、癌旁組織及白膜層DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於肝臟未見異常的健康人群的白膜層、來源於肝癌患者的癌組織中獲得DNA樣品(其中白膜層樣品10個，癌組織各10個)，選擇白膜層DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白膜層破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白膜層DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(D5031，ZYMO RESEARCH)處理，以獲得轉化的DNA。
藉由螢光PCR檢測，獲得標記物的檢測螢光Ct值。在螢光PCR反應體系中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，2.5μL包含檢測位點的引子和探針預混液；12.5μL PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白膜層、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。其中各個甲基化標誌物的引子序列見表1-1，探針序列見表1-2。
表1-1引子序列
表1-2檢測探針序列
表1-3樣本檢測結果匯總
上表結果顯示，癌組織檢測的平均Ct值小，代表具有更強的甲基化信號。癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白膜層，也代表甲基化信號強。白膜層大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測肝癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
比較肝癌患者、肝臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取266個肝臟未見異常健康對照血漿、372個肝癌患者術前血漿(其中I期占比為86%)、37例乙肝患者血漿和39例肝硬化血漿樣本進行檢測。
使用商業化Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
可選地，將上述轉化後的DNA用於預擴增，用含有表1所示的甲基化標誌物特異性引子和內參引子(ACTB，正向引子和反向引子可以分別如表1所示，探針可以如表2所示)的引子池，以轉化後的DNA為模板，進行PCR擴增，每條引子的終濃度為100nM。PCR反應體系為10μL轉化的DNA，包含上述引子的預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，15個循環。
將獲得的預擴增產物稀釋10倍後用於螢光PCR檢測。使用如表1所示的各個甲基化標誌物的引子、表2所示的檢測探針序列，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。
PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。結果顯示，本發明的各個靶點都可以具備用於血液檢測肝癌的能力。
在約90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表5所示：
表1-4檢測位點的檢測靈敏度
上表結果顯示，檢測位點在對照血漿和肝癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對肝癌患者血液樣本具有較高的靈敏度。
在對靶點進行組合分析時，數據分析可採用對單一靶點設定陽性判讀閾值，聯合靶點時，任一靶點陽性即樣本綜合判讀為陽性的方式。以此方式驗證了：
聯合SEPT9(1)、IKZF1，可使肝癌檢測靈敏性64.5%，健康對照特異性高達95.9%，同時B型肝炎患者的陽性率為2.7%，肝硬化患者陽性率為20.5%；聯合SEPT9(1)、IKZF1、BEST4、B4GALNT1，可使肝癌檢測靈敏性73.1%，健康對照特異性為91.0%，同時B型肝炎患者的陽性率為9.1%，肝硬化患者陽
性率為20.5%；聯合SEPT9(1)、SEPT9(1a)、IKZF1、BEST4、GRASP、B4GALNT1，可使肝癌檢測靈敏性75.8%，健康對照特異性為90.2%，同時B型肝炎患者的陽性率為16.2%，肝硬化患者陽性率為20.5%；聯合IRF4、IKZF1、BEST4、B4GALNT1、BEND4、SEPT9(1))時，可使肝癌檢測靈敏性76.9%，健康對照特異性為91.0%，同時B型肝炎患者的陽性率為9.1%，肝硬化患者陽性率為20.5%；以上靶點組合均證實區分健康對照與肝癌的性能優越，且在B型肝炎和肝硬化患者中特異性良好。
實施例2
比較肝癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於肝臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於肝癌患者的癌旁組織和癌組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品約10個，癌旁組織和癌組織各約24個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(D5031，ZYMO RESEARCH)處理，以獲得轉化的DNA。
可選地，用含有本發明靶點甲基化特異性引子和內參(ACTB)引子對的引子池，以轉化後的DNA為模板，進行PCR擴增，每條引子的終濃度為100nM。PCR反應體系包含：10μL轉化的DNA(包含2.5μL上述引子的預混液)和12.5μL PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。PCR反應條件為：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，進行10個循環。例如，本
發明表格序列中的小寫字母所在的位置可以對應該序列所結合的基因組的區域上天然胞嘧啶的位點。例如，本發明表格中序列的小寫字母表示的鹼基，可以用於與轉化後的鹼基配對；如天然的胞嘧啶在亞硫酸氫鹽處理後可以轉化尿嘧啶，小寫的鹼基a可以與該轉化後的尿嘧啶配對，小寫的鹼基t可以進一步與該尿嘧啶配對的腺嘌呤配對。其中引子序列如表2-1所示。
表2-1本發明靶點特異性引子
將獲得的預擴增產物稀釋10倍，藉由多重螢光PCR檢測，獲得標記物的檢測螢光Ct值。在螢光PCR反應體系中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，2.5μL包含檢測位點的引子和探針預混液；12.5μL PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。其中引子序列見表2-1，探針序列見表2-2。
表2-2本發明靶點檢測探針序列
結果如圖1、3、5、7所示，可見這些檢測位點甲基化在白細胞DNA中本底信號均很低，組織信號強於白細胞DNA信號，癌組織信號強於癌旁組織信號。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
比較肝癌患者、肝臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
使用螢光PCR檢測方法對約65例肝癌個體的血漿樣本和約76例對照個體的血漿樣本進行檢測：
使用商業化Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
可選地，將上述轉化後的DNA用於預擴增，用含有表2-1所示的本發明靶點甲基化特異性引子和內參(ACTB)引子對的引子池，以轉化後的DNA為模板，進行PCR擴增，每條引子的終濃度為100nM。PCR反應體系為10μL轉化的DNA，包含上述引子的預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，15個循環。
將獲得的預擴增產物稀釋10倍後用於螢光PCR檢測。使用如表2-1所示的引子、表2-2所示的檢測探針序列，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與本實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。
結果如圖2、4、6、8所示，檢測位點在對照血漿和肝癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如下表所示：
表2-3檢測位點的檢測靈敏度
將5個標記物組(Septin9、IKZF1、IRF4、VAV3和BCAT1)綜合考量，在對照組特異性為90.8%的情況下，肝癌的檢測靈敏度可以實現90.8%，具體信息如下表所示：
表2-4檢測多個位點的檢測準確性
比較肝癌、癌旁組織及白膜層DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於肝臟未見異常的健康人群的白膜層、來源於肝癌患者的癌組織中獲得DNA樣品(其中白膜層樣品約10個，癌組織各約10個)，選擇白膜層DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白膜層破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白膜層DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。將上述步驟中獲得的DNA取20
ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(D5031，ZYMO RESEARCH)處理，以獲得轉化的DNA。
可選地，用含有本發明靶點甲基化特異性引子和內參(ACTB)引子對的引子池，以轉化後的DNA為模板，進行PCR擴增，每條引子的終濃度為100nM。PCR反應體系包含：10μL轉化的DNA(包含2.5μL上述引子的預混液)和12.5μL PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。PCR反應條件為：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，進行10個循環。例如，本發明表格序列中的小寫字母所在的位置可以對應該序列所結合的基因組的區域上天然胞嘧啶的位點。例如，本發明表格中序列的小寫字母表示的鹼基，可以用於與轉化後的鹼基配對；如天然的胞嘧啶在亞硫酸氫鹽處理後可以轉化尿嘧啶，小寫的鹼基a可以與該轉化後的尿嘧啶配對，小寫的鹼基t可以進一步與該尿嘧啶配對的腺嘌呤配對。其中引子序列如表2-5所示。
將獲得的預擴增產物稀釋10倍，藉由多重螢光PCR檢測，獲得標記物的檢測螢光Ct值。在螢光PCR反應體系中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，2.5μL包含檢測位點的引子和探針預混液；12.5μL PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白膜層、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。其中引子序列見表2-5，探針序列見表2-6。基因間隔區2表示人chr1：145384249：145413094區域，基因間隔區1表示人chr7：26415938：26416740區域。
表2-5引子序列
表2-6檢測探針序列
表2-7樣本檢測結果匯總
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白膜層，也代表甲基化信號強。白膜層大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以
具備用於血液檢測肝癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
比較肝癌患者、肝臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取約170個肝臟未見異常健康對照血漿、約321個肝癌患者術前血漿(其中I期占比為86%)、約36例B型肝炎患者血漿和20例肝硬化血漿樣本進行檢測：使用商業化Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
可選地，將上述轉化後的DNA用於預擴增，用含有表2-5所示的本發明靶點甲基化特異性引子和內參(ACTB)引子對的引子池，以轉化後的DNA為模板，進行PCR擴增，每條引子的終濃度為100nM。PCR反應體系為10μL轉化的DNA，包含上述引子的預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒，15個循環。
將獲得的預擴增產物稀釋10倍後用於螢光PCR檢測。使用如表2-5所示的引子、表2-6所示的檢測探針序列，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與本實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。
表2-8樣本檢測結果匯總
上表結果顯示標誌物在肝癌組和健康對照組之間的AUC統計，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測肝癌。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如下表所示：
表2-9檢測位點的檢測靈敏度
結果顯示，檢測位點在對照血漿和肝癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對肝癌患者血液樣本具有較高的靈敏度。
實施例3
本發明甲基化標誌物各個亞區域的樣本檢測能力
參考以上實施例，對於本發明的甲基化標誌物的各個亞區域進行肝癌樣本的檢測。檢測結果如下表所示：
表3樣本檢測結果匯總
其中各個檢測區域編號中下劃線之後的數字編號為該檢測區域對應的亞區域編號，下劃線之後的相同數字編號如有不同字母，代表相同亞區域中的不同的特定檢測區域。各個檢測區域用到的引子對和探針如表2-1、2-5以及2-2和2-6所示，各個檢測區域編號中下劃線之後的編號，與對應使用的表格中引子對和探針名稱結尾的編號對應。
癌組織甲基化信號Ct值相較於白細胞甲基化信號Ct值，體現了靶點檢測效果的指數級差異。各個靶點特定區域檢測效果等級劃分標準為：A表
示癌組織甲基化信號相較於白細胞大於100倍，是肝癌檢測的較佳位點；B表示癌組織甲基化信號相較於白細胞介於10倍到100倍，有可能用於肝癌檢測的位點；C表示癌組織甲基化信號相較於白細胞小於10倍，大概率不可用於肝癌檢測的位點。
實施例4
分別從來源於肝臟未見異常的健康人群的白膜層、來源於肝癌患者的癌組織中獲得DNA樣品(其中白膜層樣品10個，癌組織各10個)，選擇白膜層DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白膜層破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白膜層DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(D5031，ZYMO RESEARCH)處理，以獲得轉化的DNA。
藉由螢光PCR檢測，獲得標記物的檢測螢光Ct值。在螢光PCR反應體系中，每個引子的終濃度為500nM，每個檢測探針的終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，2.5μL包含檢測位點的引子和探針預混液；12.5μL PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。其中各個甲基化標誌物的引子序列見表4-1，探針序列見表4-2。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 30秒，56℃ 60秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白膜層、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，未檢測到擴增信號的靶點Ct值被設定為50。
表4-1引子序列
表4-2檢測探針序列
表4-3樣本檢測結果匯總
上表結果顯示，肝癌組織檢測的平均Ct值相較於白膜層大，代表肝癌組織樣本SDC2甲基化信號比白膜層弱。例如並不是所有本領域已知的甲基化靶點都可用於肝癌血液樣本檢測。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附請求項的範圍。目前本發明所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域中具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的請求項和其等同方案的範圍內。
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Claims (97)
- 一種確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標基因包含SEPT9和IKZF1。
- 一種評估肝腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中目標基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標基因包含SEPT9和IKZF1。
- 如請求項1或2所述的方法，其中該SEPT9的DNA區域來源於人chr17：75276651-75496678。
- 如請求項1至3中任一項所述的方法，其中該IKZF1的DNA區域來源於人chr7：50343720-50472799。
- 如請求項1至4中任一項所述的方法，其中該目標基因還包含選自以下組的基因：BEST4、B4GALNT1、GRASP、IRF4和BEND4。
- 如請求項1至5中任一項所述的方法，其中該目標基因包含至少2種基因。
- 如請求項1至6中任一項所述的方法，其中該目標基因包含2種至7種基因。
- 如請求項1至7中任一項所述的方法，其中該目標基因包含SEPT9、IKZF1、BEST4和B4GALNT1。
- 如請求項1至8中任一項所述的方法，其中該目標基因包含SEPT9、IKZF1、BEST4、GRASP和B4GALNT1。
- 如請求項1至9中任一項所述的方法，其中該目標基因包含SEPT9、IKZF1、BEST4、IRF4、B4GALNT1和BEND4。
- 如請求項5至10中任一項所述的方法，其中該BEST4的DNA區域來源於人chr1：45249257-45253377。
- 如請求項5至11中任一項所述的方法，其中該B4GALNT1的DNA區域來源於人chr12：58017193-58027138。
- 如請求項5至12中任一項所述的方法，其中該GRASP的DNA區域來源於人chr12：52400724-52409673。
- 如請求項5至13中任一項所述的方法，其中該IRF4的DNA區域來源於人chr6：391739-411447。
- 如請求項5至14中任一項所述的方法，其中該BEND4的DNA區域來源於人chr4：42112955-42154895。
- 一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含確定待測樣本中目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標DNA區域包含來源於人chr17：75368651-75370720和來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。
- 一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量，該目標DNA區域包含來源於人chr17：75368651-75370720和來源於人chr7：50343720-50344547定義的區域。
- 如請求項1至17中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：1所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至18中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr17：75369558-75369622定義的區域。
- 如請求項1至19中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：2所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至20中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：3與4所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項1至21中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：5所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至22中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr7：50343793-50343896定義的區域。
- 如請求項1至23中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：6所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至24中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：7與8所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項16至25中任一項所述的方法，其中該目標DNA區域還包含選自以下組定義的區域：來源於人chr1：45251728-45252477、來源於人chr12：58020498-58022962、來源於人chr12：52400724-52401698、來源於人chr6：391739-394056、和來源於人chr4：42152705-42154895。
- 如請求項16至26中任一項所述的方法，其中該目標DNA區域包含至少2個區域。
- 如請求項16至27中任一項所述的方法，其中該目標DNA區域包含2個至8個區域。
- 如請求項16至28中任一項所述的方法，其中該目標DNA區域包含來源於人chr17：75368651-75370720、來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr1：45251728-45252477和來源於人chr12：58020498-58022962定義的區域。
- 如請求項16至29中任一項所述的方法，其中該目標DNA區域包含來源於人chr17：75368651-75370720、來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr1：45251728-45252477、來源於人chr12：52400724-52401698和來源於人chr12：58020498-58022962定義的區域。
- 如請求項16至30中任一項所述的方法，其中該目標DNA區域包含來源於人chr6：391739-394056、來源於人chr7：50343720-50344547、來源於人chr1：45251728-45252477、來源於人chr12：58020498-58022962、來源於人chr4：42152705-42154895和來源於人chr17：75368651-75370720定義的區域。
- 如請求項1至31中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：9所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至32中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr1：45252095-45252176定義的區域。
- 如請求項1至33中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：10所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至34中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：11與12所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項1至35中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：13所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至36中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr12：58021586-58021670定義的區域。
- 如請求項1至37中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：14所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至38中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：15與16所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項1至39中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：17所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至40中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr12：52401083-52401169定義的區域。
- 如請求項1至41中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：18所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至42中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：19與20所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項1至43中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：21所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至44中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr6：392282-392377定義的區域。
- 如請求項1至45中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：22所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至46中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：23與24所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項1至47中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：25所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至48中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr4：42153816-42153921定義的區域。
- 如請求項1至49中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：26所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至50中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：27與28所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項1至51中任一項所述的方法，其包含提供能夠結合包含SEQ ID NO：1所示的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 如請求項16至52中任一項所述的方法，其中該目標區域包含來源於人chr17：75369603-75369693定義的區域。
- 如請求項1至53中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：29所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。
- 如請求項1至54中任一項所述的方法，其包含提供SEQ ID NO：30與31所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。
- 如請求項16至55中任一項所述的方法，其中該疾病包含腫瘤。
- 如請求項16至56中任一項所述的方法，其中該疾病包含肝腫瘤。
- 如請求項1至57中任一項所述的方法，其中該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
- 如請求項58所述的方法，其中該核酸包含無細胞游離核酸。
- 如請求項1至59中任一項所述的方法，其中該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
- 如請求項1至60中任一項所述的方法，其中該待測樣本包含血漿。
- 如請求項1至61中任一項所述的方法，其中該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
- 如請求項62所述的方法，其具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
- 如請求項1至63中任一項所述的方法，其具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
- 如請求項63或64所述的方法，其中該鹼基包含胞嘧啶。
- 如請求項1至65中任一項所述的方法，其中該修飾狀態包含甲基化修飾。
- 如請求項64至66中任一項所述的方法，其中該其它鹼基包含尿嘧啶。
- 如請求項62至67中任一項所述的方法，其中該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
- 如請求項68所述的方法，其中該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
- 如請求項1至69中任一項所述的方法，其中該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
- 如請求項1至70中任一項所述的方法，藉由確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
- 如請求項1至71中任一項所述的方法，其中藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有所述修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
- 如請求項1至72中任一項所述的方法，其中藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定肝腫瘤的存在、或者有肝腫瘤形成或形成的風險。
- 如請求項1至73中任一項所述的方法，其中該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
- 如請求項74所述的方法，其中該擴增包含PCR擴增。
- 一種核酸，該核酸包含能夠結合如請求項1至15和58至75中任一項所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列；或者該核酸包含能夠結合如請求項16至75中任一項所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
- 一種製備核酸的方法，該方法包含根據如請求項1至15和58至75中任一項所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸；或者該方法包含根據如請求項16至75中任一項所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 一種核酸組，該核酸組包含能夠結合如請求項1至15和58至75中任一項所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列；或者該核酸組包含能夠結合如請求項16至75中任一項所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
- 一種製備核酸組的方法，該方法包含根據如請求項1至15和58至75中任一項所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組；或者該方法包含根據如請求項16至75中任一項所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。
- 一種試劑盒，包含如請求項76所述的核酸和/或如請求項78所述的核酸組。
- 一種如請求項76所述的核酸、如請求項78所述的核酸組和/或如請求項80所述的試劑盒在製備確定DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
- 一種如請求項76所述的核酸、如請求項78所述的核酸組和/或如請求項80所述的試劑盒在製備疾病檢測產品中的應用。
- 一種如請求項76所述的核酸、如請求項78所述的核酸組和/或請求項80所述的試劑盒在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
- 如請求項82至83中任一項所述的應用，其中該疾病包含腫瘤。
- 如請求項82至84中任一項所述的應用，其中該疾病包含肝腫瘤。
- 一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒在製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用，其中該用於確定的DNA區域包含如請求項1至15和58至75中任一項所述的方法中該目標基因所在DNA區域或其片段。
- 一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用，其中該用於確定的DNA區域包含如請求項16至75中任一項所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的片段。
- 如請求項87所述的應用，其中該疾病包含腫瘤。
- 如請求項87或88所述的應用，其中該疾病包含肝腫瘤。
- 如請求項81和86至89中任一項所述的應用，其中該修飾狀態包含甲基化修飾。
- 一種如請求項1至15和58至75中任一項所述的方法中該目標基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合在 製備用於確認肝腫瘤的存在、評估肝腫瘤形成或形成風險和/或評估肝腫瘤的進展的物質中的應用。
- 一種如請求項16至75中任一項所述的方法中該目標DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸或其組合在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
- 如請求項92所述的應用，其中該疾病包含腫瘤。
- 如請求項92或93所述的應用，其中該疾病包含肝腫瘤。
- 一種儲存介質，其記載可以運行請求項1至75中任一項所述的方法的程序。
- 一種設備，其包含請求項95所述的儲存介質。
- 如請求項96所述的設備，還包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現如請求項1至75中任一項所述的方法。
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